生物工程大實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、生物工程大實(shí)驗(yàn)30L發(fā)酵罐上黃原膠發(fā)酵實(shí)驗(yàn)姓 名： 學(xué) 號(hào)： 學(xué) 院： 生命學(xué)院專(zhuān) 業(yè)： 生物工程年 級(jí)： 同組成員： 1. 材料和方法1.1菌株：HYJ1.2培養(yǎng)基1.2.1斜面培養(yǎng)基（100ml）葡萄糖 3.0；蛋白胨 0.5；酵母粉 0.3；氯化鈉 0.5；瓊脂 2.0；pH 7.0-7.3滅菌條件：115，20min；培養(yǎng)溫度：30；培養(yǎng)時(shí)間：24-48 h1.2.2種子培養(yǎng)基（100ml）葡萄糖 2.0；蛋白胨 0.5；酵母粉 0.1；牛肉膏 0.3 g；pH 7.0-7.3滅菌條件：115，20 min；培養(yǎng)溫度：30；培養(yǎng)時(shí)間：10-15 h1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基（100ml）葡萄

2、糖 3.0；蛋白胨 0.2；酵母粉 0.1；Na2HPO412H2O 0.252；KH2PO4 0.3；K2SO4 0.1；MgSO47H2O 0.1；pH 7.0-7.3滅菌條件：115，20 min；培養(yǎng)溫度：30；培養(yǎng)時(shí)間：48-62 h1.3. 培養(yǎng)條件1.3.1斜面培養(yǎng)1）配置400 ml的斜面培養(yǎng)基，分裝試管，于115下滅菌20 min，之后擺斜面，冷卻至室溫后，將凝固后的斜面放于30培養(yǎng)箱過(guò)夜。2）轉(zhuǎn)接斜面菌種，將轉(zhuǎn)接好的斜面菌放于30培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48 h。1.3.2一級(jí)種子培養(yǎng)1）配置種子培養(yǎng)基：按照種子培養(yǎng)基配方配制3000 ml，分別分裝到5000 ml和500 ml的

3、三角瓶中，裝液量分別為100 ml/500 ml三角瓶（用于一級(jí)種子培養(yǎng)）；1000 ml/5000 ml三角瓶（用于二級(jí)種子培養(yǎng)），于115下滅菌20 min。2）接種：將培養(yǎng)好的斜面菌種接種到一級(jí)種子培養(yǎng)基中（100 ml/500 ml三角瓶），接種量為每瓶2-3接種環(huán)，放在30搖床培養(yǎng)10-15 h，轉(zhuǎn)速為200 rpm。1.3.3二級(jí)種子培養(yǎng)將培養(yǎng)好的一級(jí)種子接種到二級(jí)種子培養(yǎng)基中（1000 ml/5000 ml三角瓶），接種量為10%（v/v），放在30搖床培養(yǎng)6-8 h，轉(zhuǎn)速為200 rpm。1.3.4發(fā)酵罐培養(yǎng)1）配置發(fā)酵培養(yǎng)基20 L，考慮到接入的種子液的體積（10%, 200

4、0 ml），所以培養(yǎng)基配置定容時(shí)為18 L。2）將培養(yǎng)好的二級(jí)種子接種到發(fā)酵罐中，接種量為10%（v/v），溫度30，發(fā)酵罐初始攪拌轉(zhuǎn)速約為100 rpm，通風(fēng)量1.5-2.0 vvm，初始pH為7.0-7.3，中間過(guò)程不控制pH。1.4 檢測(cè)方法1.4.1發(fā)酵液OD取一定體積的發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)缓笥梅止夤舛扔?jì)在620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。1.4.2葡萄糖含量取一定發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)?000 rpm/min 離心15 min，取上清，采用SBA檢測(cè)。1.4.3發(fā)酵液粘度發(fā)酵過(guò)程中取大約100 ml發(fā)酵液，用Blankspoon粘度計(jì)(DV-E，VISCOMETER)測(cè)定其粘度。1.4.

5、4黃原膠產(chǎn)量測(cè)定發(fā)酵結(jié)束后取10 ml發(fā)酵液，用3倍體積無(wú)水乙醇沉淀黃原膠， 8000 rpm/min 離心15 min，去上清，沉淀的黃原膠50通風(fēng)箱內(nèi)干燥至恒重，用分析天平稱(chēng)重。1.4.5 pH值測(cè)定 用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH值。1.4.6菌體干重的測(cè)定取發(fā)酵液10 ml加入20 ml去離子水稀釋?zhuān)胖迷?0水浴鍋中用1 mol/l NaOH調(diào)節(jié)pH10后，水浴15 min，然后再用1 mol/l HCl調(diào)節(jié)pH7.0，迅速12000 rpm離心20 min，去上清，留沉淀，于50通風(fēng)箱內(nèi)干燥至恒重（8-10 h）。1.4.7計(jì)劃取樣時(shí)間及待測(cè)參數(shù)：前24 h發(fā)酵過(guò)程中，每隔4 h取一次樣

6、測(cè)定pH、發(fā)酵液OD、黃源膠產(chǎn)量、菌體干重，葡萄糖含量、發(fā)酵液粘度。2. 結(jié)果與討論2.1實(shí)驗(yàn)圖片其中A為斜面上菌的鏡檢圖B為二級(jí)種子鏡檢圖C為28.5h鏡檢圖D為70h鏡檢圖2.2 30L發(fā)酵罐上的發(fā)酵曲線(xiàn)a) 發(fā)酵曲線(xiàn)匯總b) 菌干重上圖為菌干重?cái)?shù)據(jù)以及擬合曲線(xiàn)（OD實(shí)際也是反映菌體濃度，因此在此不做討論），可以看出實(shí)際的數(shù)據(jù)與擬合曲線(xiàn)擬合的并不是很好。而且我們由于接種量比較大，為15%的接種量，且經(jīng)過(guò)二級(jí)種子的培養(yǎng)也沒(méi)有延遲期，故最大生長(zhǎng)速率應(yīng)該在20h左右，但由于發(fā)酵液后期產(chǎn)膠過(guò)大，粘度過(guò)大，而我們分離菌的方法比較簡(jiǎn)單原始，故后期很難將菌從發(fā)酵液中分離下來(lái)，故后期所測(cè)的菌的干重實(shí)際是菌

7、和部分膠的重量，后期數(shù)據(jù)不準(zhǔn)因而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差較大。c) 膠干重曲線(xiàn)其中A為原始數(shù)據(jù)作圖，B為刪掉0小時(shí)數(shù)據(jù)作圖在0h我們?nèi)訒r(shí)可能未等發(fā)酵液混勻后便取，因而測(cè)得的膠干重?cái)?shù)據(jù)異常，可以看出A圖數(shù)據(jù)擬合的并不是很好，在B圖中我將0h膠干重設(shè)為0，可以看出擬合度大大提高。從數(shù)據(jù)來(lái)看，膠干重測(cè)量還是不錯(cuò)的，當(dāng)然由于提取膠的方法比較簡(jiǎn)單，會(huì)有部分菌帶到膠中，這也是不可避免的誤差。可以看出在15小時(shí)左右時(shí)膠的產(chǎn)生速率最大，而到30小時(shí)左右時(shí)膠的產(chǎn)生速率有所下降并在逐漸降低，這與底物的消耗、溶氧的降低等因素有關(guān)。d) 殘?zhí)乔€(xiàn)從圖中可以看出所測(cè)的數(shù)據(jù)與擬合直線(xiàn)擬合的較好，這證明實(shí)際的操作比較規(guī)范。從一開(kāi)

8、始糖的消耗來(lái)看，消耗量較小，原因可能是菌種有延遲期；但從8h開(kāi)始，糖的消耗量迅速增加，到30h左右殘?zhí)橇恳呀?jīng)到了一個(gè)較低的值，這證明在這段時(shí)間內(nèi)菌體大量繁殖消耗了糖分。到發(fā)酵后期，發(fā)酵液中溶氧量和菌對(duì)糖的消耗量處在一個(gè)很低的水平，此時(shí)菌體進(jìn)入衰退期。e) 溶氧曲線(xiàn)在最初的4個(gè)小時(shí)內(nèi)通風(fēng)量變化不大，轉(zhuǎn)速也較低的情況下氧變化比較小，因?yàn)榇藭r(shí)菌體處于適應(yīng)期，沒(méi)有大量繁殖，消耗的氧氣不多。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的初期，比耗氧速率達(dá)到最大值，但此時(shí)細(xì)胞濃度還很低，攝氧率并不高。隨著細(xì)胞濃度的迅速增高，培養(yǎng)液的攝氧率也迅速增高，并在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的后期達(dá)到峰值。于是表現(xiàn)為發(fā)酵液中溶氧迅速降低，最后低至負(fù)值。由于接種量為15

9、%，比一般接種量偏大，所以菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)生速度也偏快，因此在最初的10h內(nèi)溶解氧就降到了一個(gè)很低的水平。之后由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，以及培養(yǎng)裝置氧傳遞能力的限制，到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段結(jié)束，溶氧已經(jīng)降到了一個(gè)極低的水平，雖然細(xì)胞濃度可能還會(huì)有所增加，但溶解氧量也不會(huì)再升高。此后，由于本實(shí)驗(yàn)菌種產(chǎn)生的黃原膠分子量較大，粘度較大，因此即使再加大通風(fēng)量提高轉(zhuǎn)速，發(fā)酵液的溶氧量也不會(huì)再增加。f) 粘度曲線(xiàn)本次實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一使用S4轉(zhuǎn)子進(jìn)行粘度的測(cè)量，可以看出前8個(gè)小時(shí)并未測(cè)出發(fā)酵液的粘度，但從測(cè)得的膠干重來(lái)看，此時(shí)應(yīng)該會(huì)有一定的粘度，可能由于轉(zhuǎn)子測(cè)量范圍有限，因此并未測(cè)出一定的數(shù)值。可以看出在30h左右粘度開(kāi)始迅

10、速增加，此時(shí)菌體數(shù)量已達(dá)到一個(gè)比較穩(wěn)定數(shù)值，開(kāi)始大量產(chǎn)生黃原膠，所以隨著產(chǎn)膠量的不斷增加，發(fā)酵液的粘度在不斷變大。在后期隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡以及代謝產(chǎn)物不斷增多，菌體數(shù)量也會(huì)逐漸減少，因此產(chǎn)膠能力也下降，所以雖然粘度仍不斷增加，但其增長(zhǎng)速率已經(jīng)大大下降，最后會(huì)達(dá)到一個(gè)峰值。g) pH曲線(xiàn)從最上方匯總的發(fā)酵曲線(xiàn)中可以看出，隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，發(fā)酵液的pH有下降的趨勢(shì)。在生產(chǎn)階段，一般發(fā)酵液的pH趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定在最適合產(chǎn)物生成的pH范圍。2.2 菌體比生長(zhǎng)速率2.3 產(chǎn)物比生成速率2.4 底物比消耗速率3、實(shí)驗(yàn)總結(jié)通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，我系統(tǒng)學(xué)習(xí)了微生物發(fā)酵的全過(guò)程，包括發(fā)酵過(guò)程中各個(gè)環(huán)節(jié)的基礎(chǔ)理論，如菌

11、種培養(yǎng)及種子的擴(kuò)大培養(yǎng)、發(fā)酵過(guò)程控制、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)等。了解了發(fā)酵設(shè)備的種類(lèi)及結(jié)構(gòu)。學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)室階段發(fā)酵方法及如何進(jìn)行工藝放大。由于我們組做這個(gè)實(shí)驗(yàn)總共做了兩遍，因此對(duì)發(fā)酵罐已經(jīng)比較了解。整體來(lái)說(shuō)兩次實(shí)驗(yàn)都比較順利。但最后測(cè)量菌體干重時(shí)可能由于操作不規(guī)范（我認(rèn)為是我們?cè)谡{(diào)節(jié)pH時(shí)沒(méi)有很好的把握好應(yīng)該加多少酸堿量，所以每個(gè)管加的量都不大一樣）以及本次實(shí)驗(yàn)固有的誤差的影響，菌干重的測(cè)量數(shù)據(jù)不夠好。 在寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告的過(guò)程中我感覺(jué)我確確實(shí)實(shí)學(xué)到了很多，通過(guò)與老師和同學(xué)的溝通交流中，我現(xiàn)在已經(jīng)比較熟練的用Origin作圖，這是我最大的收獲。4、致謝附件：發(fā)酵實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)黃原膠發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄表發(fā)酵時(shí)間（h）粘度

12、（cP）膠干重（g/l）葡萄糖（g/l）發(fā)酵OD620菌體干重g/l）溫度溶氧（%）轉(zhuǎn)速（rpm）通風(fēng)量vvmpH003.66261.120.6635.240.81501.66.7403.0025.53.90.3634.720.02501.756.7804.1723.58.072.7834.637.23501.76.7128.75.831711.345.0635.111.53502.156.7161697.911411.886.9534.7-14.44002.26.5204868.6612118.2335.0-17.74002.36.5243608.961017.7810.8535.1-17.44002.06.529.59309.4782113.2435.4-17.64002.46.338.5270010.03716.6543.6735.6-17.34002.46.342.5357010.1