食品中志賀氏菌檢驗(yàn)（課堂PPT）

1、1志賀氏菌檢驗(yàn)志賀氏菌檢驗(yàn) 2一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?了解食品安全與志賀氏菌檢驗(yàn)關(guān)系1 了解志賀氏菌生理形態(tài)化學(xué)性質(zhì)2 掌握志賀氏菌檢驗(yàn)方法和結(jié)果判斷3檢驗(yàn)食品中是否有志賀氏菌43二二.實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理需氧或兼性厭氧。營養(yǎng)要求不高，能在普通培養(yǎng)基上生長，最適溫度為37，最適pH為6.4-7.8。37培養(yǎng)18-24小時(shí)后菌落呈圓形、微凸、光滑濕潤、無色、半透明、邊緣整齊，直徑約2nm，能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。不發(fā)酵乳糖，靛基質(zhì)產(chǎn)生不定，甲基紅陽性，VP試驗(yàn)陰性，不分解尿素，不產(chǎn)生H2S。根據(jù)生化反應(yīng)可進(jìn)行初步分類。4三、實(shí)驗(yàn)的試劑和儀器三、實(shí)驗(yàn)的試劑和儀器儀器與設(shè)備試劑和儀器試劑和儀器培養(yǎng)基

2、與試劑5儀器與設(shè)備儀器與設(shè)備v規(guī)格名稱數(shù)量用途v1、500ml廣口瓶1個(gè)稀釋樣品v2、500ml三角瓶1個(gè)制增菌液v3、250ml三角瓶4個(gè)制培養(yǎng)基v4、18180mm試管制三糖鐵培養(yǎng)基v5、13100mm試管 制蛋白胨水等v6、1ml移液管v7、10ml移液管v8、直徑為90mm平皿 5副 制SS、EMB平板v9、250ml量筒1個(gè)v10、玻璃棒 v11.、恒水浴箱 1個(gè)v12、顯微鏡 1臺 鏡檢6培養(yǎng)基與試劑培養(yǎng)基與試劑v GN增菌液225ml/瓶1瓶500ml三角瓶v EMB培養(yǎng)基100ml/瓶1瓶250ml三角瓶v SS瓊脂 100ml/瓶 1瓶250ml三角瓶v 三糖鐵斜面 6ml/

3、支 6支 15150mm試管v 葡萄糖半固體培養(yǎng)費(fèi)基 4ml/支 5支 13100mm試管v 蛋白胨水2ml/支5支 13100mm試管v 5%乳糖發(fā)酵管 3ml/支5支 13100mm試管v 甘露醇發(fā)酵管 3ml/支5支13100mm試管v 棉子糖發(fā)酵管 3ml/支 5支 13100mm試管v 甘油發(fā)酵管3ml/支 5支13100mm試管 7四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟驗(yàn)步驟 實(shí)流程圖操作步驟8流程圖流程圖 采樣 樣品處理 選擇性增菌 選擇性平板劃分 生化實(shí)驗(yàn) 鏡檢 結(jié)果報(bào)告 9實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備v 對燒杯、玻璃棒、移液管、試管、培養(yǎng)皿、錐形瓶的清洗v 注意：洗滌后的儀器應(yīng)達(dá)到玻璃壁能被水

4、均勻濕潤而無條紋和水珠v 對試管、玻璃棒、移液管、錐形瓶、燒杯、培養(yǎng)皿進(jìn)行包扎：要將報(bào)紙裁成5-10公分，成30卷起，結(jié)尾處向上折疊即。包扎滅菌10培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備v 1.CN 增菌液v 成分:胰蛋白胨20g 檸檬酸鈉5g 磷酸二氫鉀1.5g 葡萄糖1g 去氧膽堿酸鈉0.5g 氯化鈉5g 甘露醇2g 磷酸氫二鉀4g 蒸餾水1000ml ph7.0v 制法：按上述成分配好，加熱溶解，校正PH。分裝每瓶225ml ， 115 C高溫滅菌15minv 2、HE瓊脂v 成分：蛋白胨12g 水楊素2g 蒸餾水1000ml 乙液20ml 牛肉膏3g 膽鹽20g 0.4% 溴麝香草芬蘭鈉溶液16ml

5、 乳糖12g 氯化鈉5g 蔗糖12g 瓊脂20g 甲液20ml HP7.5v 制法：將蛋白胨、乳糖、水楊素、氯化鈉、蔗糖、牛肉膏、膽鹽等溶解于400ml蒸餾水中作為基礎(chǔ)液；加瓊脂與600ml蒸餾水中，加熱溶解。加入甲液乙液與基礎(chǔ)液中，校正HP,再加指示劑。并與瓊脂液合并，冷卻，傾注平板，11培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備v 3、SS瓊脂液的配制v 成分：牛肉膏0.6g 瓊脂2.04g 三號膽鹽0.42g 蒸餾水120ml，月示胨0.6gv 制法：將牛肉膏、月示胨和膽鹽溶解于400ml蒸餾水中，將瓊脂加入600ml蒸v 餾水中，煮沸使其溶解，再將兩液混合121高壓滅菌15min,保存?zhèn)溆?。v 4、麥慷

6、慨瓊脂液的配制v 成分：蛋白胨2.04g 脙胨0.36g 豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)5g 氯化鈉0.6g 瓊脂2.04g 蒸餾水120mL 乳糖1.2g 0.01%結(jié)晶紫水溶液1.2mL 0.5%中性紅水溶液0.6mLv 制法： 將蛋白胨、胨、膽鹽和氯化鈉溶解于400mL蒸餾水中，校正pH7.2， v 將瓊脂加入于600ML蒸餾水中， 加熱溶解。將兩液合并，分裝于121高壓滅菌15min備用。 臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，趁熱加入乳糖，冷至5055時(shí)，加入結(jié)晶紫和中性紅水溶液，搖勻后傾注平板。12培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備v 5、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）v 成分：蛋白胨 10g 2%伊紅溶液20ml 乳糖10

7、g 0.65%美蘭溶液10ml 磷酸二氫鉀28g 蒸餾水1000ml 瓊脂17g PH7.1 v 制法：將蛋白胨、磷酸鹽、瓊脂溶解于蒸餾水中，校正ph，分裝于燒杯內(nèi)，121c高壓滅菌15min備用。臨用時(shí)加入乳糖并加熱溶解瓊脂，冷卻，加入伊紅和美藍(lán)溶液，搖勻。傾注平板。v 6、三糖鐵瓊脂的配制v 成分：蛋白胨4.8g 牛肉膏0.6g 乳糖1.2g 蔗糖1.2g 葡萄糖0.12g 氯化鈉0.6g 硫酸亞鐵胺0.024g 硫代硫酸鈉0.024g 瓊脂0.72g 酚紅0.003g 蒸餾水120mL pH7.4v 制法：將除瓊脂和酚紅以外的各成分溶解于蒸餾水中，校正pH。加入瓊脂，加熱煮沸，以溶化瓊脂

8、。加入0.2%酚紅水溶液12.5mL，搖勻。分裝試管，裝量宜多些，以便得到較高的底層。121高壓滅菌15min。放置高層斜面?zhèn)溆谩?3培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備v 7、生理鹽水的配制v 成分Nacl0.9g,蒸餾水100mlv 制法一般每種檢樣配制250ml生理鹽水。稱取2.2gNacl，加入250ml蒸餾水溶液；分裝于2支大試管中，每支9ml，再量取225ml裝入500ml廣口瓶中，并加入適量的玻璃珠；剩余的裝人另1支試管中，包扎后于121度高壓滅菌15minv 8、氯化鈉結(jié)晶紫增菌液的配制v 成分：蛋白胨2.4g 氯化鈉4.8g 0.01%結(jié)晶紫溶液0.6mL 蒸餾水120mL pH9.0

9、v 制法：胨晶晶紫外，其他按上述成分配好，加熱溶解。約加30%氫氧化鉀溶液4.5mL，校正pH。加熱煮沸，過濾。再加入結(jié)晶紫溶液，混合后分裝試管。121高壓滅菌15min14操作步驟操作步驟v1.滅菌v 干熱滅菌：剪刀及棉繩等干熱滅菌v 濕熱滅菌：均質(zhì)袋、紗布、各種培養(yǎng)基、生理鹽水、增菌液v2.采樣 從食堂中取一個(gè)雞蛋v3.樣品處理 將雞蛋打碎放入無菌碗里，然后用殺菌的玻璃棒攪拌，在放入到均質(zhì)袋中用均質(zhì)器打勻v4. 增菌 稱取檢樣25g，加入裝有225mlGN增菌液的500ml的廣口瓶內(nèi)，于（361）培養(yǎng)6-8h15操作步驟操作步驟v 5.分離 取增菌液一環(huán) ，劃線接種于SS瓊脂平板一個(gè)，伊紅

10、美藍(lán)瓊脂平板一個(gè)，于（361）培養(yǎng)18-24小時(shí)。志賀菌在這些培養(yǎng)基上呈現(xiàn)無色透明不發(fā)酵乳糖的菌落。v 6.生化試驗(yàn) 挑取平板上的可疑菌落，接種三塘鐵瓊脂和半固體各一管，一般應(yīng)多挑取幾個(gè)以防遺漏，志賀菌屬在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果為底層產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，斜面產(chǎn)堿，不產(chǎn)生硫化氫，無動力，在半固體管內(nèi)，沿穿刺線生長。v 7.鏡檢 從三塘鐵瓊脂和半固體各一管中挑取生長出來的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，然后放在顯微鏡下觀察。v 8.結(jié)果報(bào)告 16五五 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1、志賀菌在常溫存活期很短。因此，當(dāng)樣品采集后，應(yīng)盡快進(jìn)行檢驗(yàn)。如果在24h內(nèi)檢驗(yàn)，樣品可保存在冰箱內(nèi)，入欲保存較長時(shí)間，必須放在低溫冰箱內(nèi)。2、迄今沒有很好的曾菌培養(yǎng)基。目前仍然認(rèn)為用GN肉湯曾菌檢查食品中和糞便中的志賀菌是有效的。17注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)3、增加鑒別培養(yǎng)基的數(shù)目，可以增加志賀菌的陽性檢出率。用于分離的鑒別培養(yǎng)基一般不少于兩個(gè)。中等選擇性的，HE或SS瓊脂平板一個(gè)；弱選擇性的。麥康凱或EMB瓊脂平板