CCK-8法（課堂PPT）

1、1細(xì)胞毒性及細(xì)胞毒性及CCK-8法法2細(xì)胞毒性 細(xì)胞毒性是由細(xì)胞或者化學(xué)物質(zhì)引起的單純的細(xì)胞殺傷事件，不依賴于凋亡或壞死的細(xì)胞死亡機理。 細(xì)胞毒性檢測主要是根據(jù)細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變來進(jìn)行的檢測。 常用的幾種方法檢測細(xì)胞毒性的方法：MTT法、XTT法，CCK-8法，LDH的方法以及其它酶的方法。3 MTT、XTT，CCK-8：利用線粒體內(nèi)部酶的活性，可以將特定的四唑鹽類進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后通過酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。 LDH的方法：通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH的酶活性，來檢測細(xì)胞毒性。 其它酶方法：如檢測上清中堿性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等細(xì)胞毒性4原理 細(xì)胞增殖能力分析試劑盒 正常細(xì)胞代謝旺盛，其線粒體內(nèi)的

2、琥珀酸脫氫酶，可將四唑鹽類物質(zhì)（如 MTT、XTT、WST-1等 ）還原為紫色的結(jié)晶狀的物質(zhì)，沉積在細(xì)胞周圍然后通過酶標(biāo)儀讀取OD值，從而檢測到細(xì)胞增值狀態(tài) 熒光素發(fā)光法細(xì)胞生存能力檢測 腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核細(xì)胞的胞漿中，AK具有激活A(yù)DP生成ATP。當(dāng)細(xì)胞受損后，細(xì)胞膜發(fā)生破損，AK會釋放到培養(yǎng)上清中。該試劑盒利用熒光素酶和熒光素在ATP作用下可以發(fā)光，通過化學(xué)發(fā)光儀可以定量進(jìn)行檢測。 5LDH法細(xì)胞毒性檢測 LDH（乳酸脫氫酶）是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，存在于正常細(xì)胞的胞質(zhì)中，一旦細(xì)胞膜受損，LDH即被釋放到細(xì)胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸鹽，和INT（四唑鹽類）反應(yīng)形成紫色

3、的結(jié)晶物質(zhì)，可通過500nm酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH的活性，可判斷細(xì)胞受損的程度6CCK-8 Cell Counting Kit簡稱CCK試劑盒，是一種基于WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。 WST-8屬于MTT的升級產(chǎn)品，工作原理為：在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan）。顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450mM波長處測定OD值，間接反映活

4、細(xì)胞數(shù)量。7CCK方法的優(yōu)勢 8實驗方法實驗方法比色用含10胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液以每孔40005000個細(xì)胞接種到96孔板每孔100ul.培養(yǎng) 每孔加CCK8溶液 20ul，孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150ul DMSO振蕩10分鐘 選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。 接種培養(yǎng)細(xì)胞呈色9CCK-8優(yōu)點：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT；5、對細(xì)胞毒性??；6、為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。缺點：1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價格比較貴。2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生