實驗一細(xì)胞及組織培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作

1、實驗內(nèi)容介紹實驗內(nèi)容介紹 實驗一、細(xì)胞及組織培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作 實驗二、培養(yǎng)基及胰酶的配制 實驗三、細(xì)胞的傳代（I）與凍存 實驗四、細(xì)胞復(fù)蘇及細(xì)胞鑒別與計數(shù) 實驗五、細(xì)胞原代培養(yǎng) 實驗六、細(xì)胞傳代（II）細(xì)胞爬片 實驗七、細(xì)胞骨架組分的熒光染色觀察 實驗八、考試動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實驗內(nèi)容介紹實驗內(nèi)容介紹 實驗九、動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與GFP的RNA干擾技術(shù) 實驗十、利用MTT比色法測定細(xì)胞群體的相對細(xì)胞數(shù) 實驗十一、探究實驗（綜合設(shè)計實驗） 實驗十二、探究實驗（綜合設(shè)計實驗） 實驗十三、掃描電子顯微鏡簡介 實驗十四、掃描電子顯微鏡生物樣品制備及觀察課程要求課程要求 一、遵守實驗室的各項規(guī)定 二、儀器使用要

2、遵守操作規(guī)則 三、上課不遲到、不早退、不無故曠課 四、上課時必須穿實驗服 五、服從研究生助教的指導(dǎo)和安排 六、按時完成作業(yè) 七、保護實驗環(huán)境、愛護實驗動物 八、實驗結(jié)束后，及時清理實驗用品 實驗考核方式實驗考核方式 平時成績 60 %，期末考試40 %平時成績：課堂操作，實驗習(xí)慣，合作精神， 實驗報告，課堂互動期末考試：組織培養(yǎng)技能考核：辨認(rèn)細(xì)胞 實驗操作 總結(jié)報告：自主創(chuàng)新實驗收獲 科研小論文實驗一、細(xì)胞及組織培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作實驗一、細(xì)胞及組織培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作一、實驗原理一、實驗原理 1.體外培養(yǎng)（in vitro culture) 的基本概念: 將活體結(jié)構(gòu)成分（甚至個體）從體內(nèi)或其寄生體內(nèi)取出

3、，放在類似于體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長和發(fā)育的方法。按照體外培養(yǎng)的結(jié)構(gòu)成分，可將體外培養(yǎng)人為地分為： 組織培養(yǎng)（tissue culture） 器官培養(yǎng)（organ culture） 細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture)一、實驗原理一、實驗原理 組織培養(yǎng)(Tissue Culture)是指從生物體內(nèi)取出活的組織（多指組織塊）在模擬體內(nèi)生理環(huán)境下，使之生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。 細(xì)胞培養(yǎng)(Cell Culture)是指從生物體內(nèi)取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在體外進行培養(yǎng)的方法。 器官培養(yǎng)（Organ Culture） 培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整

4、個器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法。一、實驗原理一、實驗原理 2. 組織細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點 能夠長時間觀察細(xì)胞的生命活動 容易控制實驗條件，有利于生物學(xué)研究 容易直接采集細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的圖象 便于各種細(xì)胞染色處理和標(biāo)記 培養(yǎng)細(xì)胞的單一性，有利于排除干擾因素一、實驗原理一、實驗原理 3. 體外培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用： 基礎(chǔ)研究：細(xì)胞生物學(xué)乃至整個生命科學(xué)研究中最基本的實驗技術(shù)之一。被培養(yǎng)的組織或細(xì)胞是良好的實驗材料。細(xì)胞培養(yǎng)廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)研究之中 生產(chǎn)實踐：疫苗生產(chǎn)、藥物研制與腫瘤防治等醫(yī)學(xué)實踐提供了全新的手段。一、實驗原理一、實驗原理 4. 細(xì)胞及組織培養(yǎng)的基本條件（1）無污

5、染的環(huán)境條件（2）適當(dāng)?shù)臏囟?由酶和蛋白質(zhì)所需要的最適溫度決定,3537(人和哺乳動物細(xì)胞)（3）氣體環(huán)境與pH環(huán)境： pH7.2-7.4 (人和哺乳動物細(xì)胞)（4）營養(yǎng)條件（5）其它條件：等滲條件、附著底物一、實驗原理一、實驗原理 5.無污染的環(huán)境條件 凡混入細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)視為污染。（1）細(xì)胞污染的種類 A.物理污染: *溫度: 解決對策： 孵箱放在溫度較恒定的房間中培養(yǎng)液從冰箱取出后在室溫放置 *放射線與輻射:解決對策： 試劑周圍不能放同位素盡量不放在帶有玻璃門的冰箱中 *振動:解決對策：孵箱周圍不能放引起振動的設(shè)備 *其他：塵土、玻璃殘渣等.解

6、決對策：嚴(yán)格清洗 B.化學(xué)污染水: 解決對策：用雙蒸和三蒸水配液和清洗容器 （現(xiàn)在用純水儀millipore超純水） 容器: 生產(chǎn)過程中有毒物質(zhì)殘留（鉛、砷）;消毒劑和清洗劑的殘留;鋁箔和包裹紙殘留 解決對策：培養(yǎng)用各種器皿的嚴(yán)格清洗（泡酸）培養(yǎng)箱:CO2混有有毒氣體; 消毒劑和清洗劑的殘留 解決對策：購置高質(zhì)量的CO2培養(yǎng)箱擦拭干凈一、實驗原理一、實驗原理 C.生物污染細(xì)菌、霉菌和酵母:易被發(fā)現(xiàn),易造成隱性污染病毒: 最難發(fā)現(xiàn)和清除,嚴(yán)格的宿主性,自限性支原體：污染嚴(yán)重,難發(fā)現(xiàn) ,難清除原蟲、昆蟲：其它細(xì)胞系：解決對策：實驗用品嚴(yán)格滅菌，無菌操作同一時間只傳同一種細(xì)胞,每種細(xì)胞要有單獨的液體

7、。建立細(xì)胞庫，每三個月更換一次細(xì)胞一、實驗原理一、實驗原理 6.清洗與滅菌除去各種玻璃或塑料器皿上對細(xì)胞生長有影響的各種雜質(zhì)以及消除附著在其上的各種微生物及化學(xué)物質(zhì)，改善玻璃表面性質(zhì)，有利于細(xì)胞的粘著和生長。 清洗和消毒是否徹底直接關(guān)系到體外培養(yǎng)的成敗。（1）清洗玻璃器皿：培養(yǎng)瓶、吸管、滴管 、試管等浸泡 刷洗、烘干 浸酸沖洗（15遍自來水后3遍蒸餾水 倒置烤干 包裝干熱消毒膠塞（舊）：用加入適量洗滌靈的水溶液煮沸30分鐘，自來水沖洗 蒸餾水漂洗3次 晾干包裝 濕熱滅菌烘干備用膠塞（新）：水中浸泡 2%NaOH煮10-20min 自來水沖洗10次 1%HCl浸泡30min自來水沖10次，蒸餾水

8、洗3次 晾干 包裝 濕熱滅菌烘干備用。金屬器械 ： 自來水洗 75%酒精擦 濕熱滅菌、包裝 烘干備用或者自來水沖10次，蒸餾水3次 晾干 包裝 濕熱滅菌烘干備用一、實驗原理一、實驗原理（2）細(xì)胞及組織培養(yǎng)用品的包裝1局部包裝：濾器，培養(yǎng)瓶口2. 全包裝：膠塞、瓶蓋、金屬器械、注射器、小的瓶皿等（3）細(xì)胞及組織培養(yǎng)用品的消毒與滅菌射線消毒: 用鈷60等發(fā)出的射線消毒滅菌。 適宜用于量大或不適做高壓、干熱或過濾處理的培養(yǎng)用品，如塑料制品等。紫外線消毒: DNA損傷，臭氧，雙氧水 適用于空氣、主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料、培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒. 【注意事項】：空氣消毒時燈管應(yīng)距地面25 m以

9、內(nèi)；臺面的消毒應(yīng)在80 cm以內(nèi)；培養(yǎng)器皿的消毒在30 cm以內(nèi)。不要讓紫外線照射人的皮膚。一、實驗原理一、實驗原理干熱滅菌: 高溫變性， 160保溫90120 min 適用于玻璃器皿 【注意事項】溫度降至100之下才能開烤箱門。一、實驗原理一、實驗原理濕熱滅菌:高溫變性。 121度，15磅30分或115度，10磅20分 適用于膠塞、瓶蓋、玻璃器皿、濾器、槍頭 塑料物品、PBS、LB等不易產(chǎn)生沉淀的液體 一、實驗原理一、實驗原理過濾除菌：采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以更換的微孔濾膜，適用于培養(yǎng)基、胰酶、TdR、秋水仙素、谷氨酰胺、抗生素等對熱不穩(wěn)定的試劑及藥物一、實驗原理一、實驗原理化

10、學(xué)消毒: 來蘇(0.3%)、新潔而滅（0.1%）、乙醇（70- 75%）、乳酸、過氧乙酸(0.5%)火焰消毒：僅限于無菌操作過程，在火焰近處并經(jīng)過燒灼進 行。用于培養(yǎng)瓶、滴管、試管、吸管等。 注意：等用品冷卻后放可接觸活的組織和細(xì)胞。抗生素的抑菌作用：青霉素、鏈霉素100單位/ mL培養(yǎng)基一、實驗原理一、實驗原理7. 平衡鹽DHanks緩沖液的配制 平衡鹽溶液（balanced salt solution,BSS）主要是由無機鹽、葡萄糖組成。它的作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。主要用于取材時組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。 D-Hanks與Hanks的一個主要

11、區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hanks常用于配制胰酶溶液。DHanks的配制 配方（1000 mL）：KCl 0.4g；KH2PO4 0.06 g； NaCL 8 g； Na2HPO4.12H2O 0.132 g；NaHCO3 0.35 g；酚紅0.02g（2%，1 mL）可不加酚紅一、實驗原理一、實驗原理二、實驗?zāi)康亩?、實驗?zāi)康?1.掌握細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念 2.了解細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件 3.掌握清洗和消毒的基本方法 4.學(xué)習(xí)DHanks液的配制方法三、實驗材料三、實驗材料1.細(xì)胞培養(yǎng)用品：玻璃器皿；濾器；塑料及橡膠制品 濾膜；棉花；酒精燈等2. 藥品及試劑：KCl ，KH2PO4 ， NaCL ，Na2HPO4， NaHCO3， 酒精、新潔爾滅等。四、實驗內(nèi)容四、實驗內(nèi)容無菌室及互動顯微鏡室、儀器的使用規(guī)則清點儀器設(shè)備針頭濾器的安裝與滅菌：安裝濾膜（0.22m光滑面朝上），高壓滅菌。DHanks緩沖液的配制及滅菌處理練習(xí)清洗培養(yǎng)瓶。練習(xí)包瓶子、塞子、插槍頭、切蓋玻片，移液管塞棉花等。75%酒精配制、酒精棉球制作以及酒精燈內(nèi)酒精添加。配新潔而滅消毒水。練習(xí)培養(yǎng)基瓶蓋的開啟與蓋上無菌室的打掃：自來水拖地、擦桌子及超凈臺，然后0.1%新潔而滅擦。 CO2培養(yǎng)箱滅菌：0