高效液相色譜法測(cè)定西司他丁鈉的含量及有關(guān)物質(zhì)

1、高效液相色譜法測(cè)定西司他丁鈉的含量及有關(guān)物質(zhì)【摘要】 目的 建立HPLC測(cè)定西司他丁鈉的含量和有關(guān)物質(zhì)。方法 采用高效液相法色譜(HPLC法)，以C18柱(4.6mm250mm，5m)為分析柱，乙腈0.1mol/L磷酸銨(用磷酸調(diào)pH至6.8)(3070)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，流速0.8ml/min，柱溫50。結(jié)果 西司他丁鈉在0.080.60mg/ml范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，平均回收率為100.2%(n=9)。西司他丁鈉與相鄰雜質(zhì)峰完全分離，西司他丁鈉的檢測(cè)限為1.8ng，定量限為5.9ng。結(jié)論 該方法可靠、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確?？勺鳛槲魉舅♀c含量和有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法。 【關(guān)鍵詞】

2、 西司他丁鈉； 高效液相色譜法； 有關(guān)物質(zhì) ABSTRACT Objective To establish an HPLC method for the determination of the content and the related substances of cilastatin sodium. Method The column: C18(4.6mm250mm, 5m) was used, the mobile phase was acetonitrile and 0.1mol/L phosphate ammonium (adjust to pH6.8 with phosphor

3、ic acid) (3070), the detecting wavelength was 210nm, the flow rate was 0.8ml/min and the column temperature was 50. Results The average recovery was 100.2% (n=9). Cilastatin sodiumn could be completely separated from other impurities. Limit of detection for cilastatin sodium was 1.8ng. Limit of quan

4、titation for cilastatin sodium was 5.9ng. Conclusion The proposed HPLC method is reliable, convenient and accurate. The method can be used for determination of content and related substaces of cilastatin sodium. KEY WORDS Cilastatin sodium; Related substaces; HPLC 西司他丁鈉(cilastatin sodium，CS)是一種很好的腎去

5、氫肽酶I抑制劑，其本身不具有抗菌活性，對(duì)內(nèi)酰胺酶也無(wú)抑制作用，它是碳青霉烯類藥物亞胺培南(imipenen，IMP)的增效劑。IMP單獨(dú)給藥時(shí)，經(jīng)腎小球過(guò)濾或分泌后，被近端腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣中的去氫肽酶I水解失活60%95%，導(dǎo)致尿中活性藥物濃度降低。CS能阻抑IMP進(jìn)入腎小管上皮組織，減少IMP的排泄并保護(hù)IMP在腎中不被破壞，可防止因IMP引起的腎小管壞死，減輕藥物的腎毒性，增加療效。兩者合用后西司他丁減少IMP被腎小管上皮細(xì)胞的去氫肽酶水解，可使IMP的AUC增加20%，在尿中回收的原形藥物多達(dá)70%，所以在制劑時(shí)IMP/CS以等量配制1。 IMP/CS適用于多種細(xì)菌的混合感染和需氧/

6、厭氧菌的混合感染以及在尚未確定病原菌前的早期治療，近年廣泛用于抗感染治療，取得滿意結(jié)果，已成為治療嚴(yán)重感染的一線藥物。 對(duì)于原料CS的含量測(cè)定，國(guó)外藥典采用電位滴定法2，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。本研究建立HPLC法測(cè)定CS含量和有關(guān)物質(zhì)，得到滿意結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下。 1 儀器與試藥 島津LC2010A型高效液相色譜儀，Waters millipore真空泵，SB5200型超聲波儀，F(xiàn)13型酸度計(jì)，島津MultiSpec1501紫外 分光光度計(jì)。 CS原料3批(由某藥廠提供；批號(hào)20044006、20044007和20044008)；CS對(duì)照品(純度97.8%)由河北省藥品檢驗(yàn)所提供；乙腈為色譜純，磷酸銨、

7、磷酸二氫鉀、鹽酸、30%過(guò)氧化氫、氫氧化鈉均為分析純。 2 方法與結(jié)果 2.1 色譜條件 色譜柱：Diamond C18(4.6mm250mm，5m)；流動(dòng)相：乙腈0.1mol/L磷酸銨(精密稱取磷酸銨20.31mg，加1000ml水使溶解并稀釋至刻度，用磷酸調(diào)至pH6.8)(3070)；流速0.8ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；柱溫50；進(jìn)樣量20l，結(jié)果見(jiàn)圖1。 1：西司他丁鈉； 2、3：未知雜質(zhì) 圖1 西司他丁鈉HPLC有關(guān)物質(zhì)圖譜 2.2 系統(tǒng)適用性 (1)柱效與不對(duì)稱度取CS對(duì)照品溶液進(jìn)樣，理論塔板數(shù)按CS峰計(jì)算為7070。 (2)進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取CS對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5針，其峰

8、面積的RSD為0.008%，表明系統(tǒng)精密度良好。 2.3 專屬性 對(duì)CS對(duì)照品進(jìn)行高溫、氧化、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的破壞性試驗(yàn)，以研究其降解產(chǎn)物與主峰的分離情況。 在選定的色譜條件下，取上述破壞后供試品溶液進(jìn)樣，結(jié)果主峰與各雜質(zhì)峰獲得有效分離，提示氧化和強(qiáng)酸破壞產(chǎn)生較大雜質(zhì)，高溫和強(qiáng)堿破壞總雜質(zhì)量和雜質(zhì)個(gè)數(shù)變化不大，表明CS在氧化、強(qiáng)酸條件下較不大穩(wěn)定，強(qiáng)堿和高溫對(duì)樣品影響較小。 2.4 準(zhǔn)確度 精密稱取CS對(duì)照品及已知含量的樣品各三份，分別置于100ml量瓶中加水溶解并稀釋至刻度，制成含量測(cè)定濃度的80%、100%和120%的溶液，搖勻，濾過(guò)，進(jìn)樣，結(jié)果低、中、高3個(gè)濃度的回收率(n=3)分別為100

9、.1%(RSD=0.28%)、100.8%(RSD=1.24%)和99.8%(RSD=0.53%)；平均回收率為100.2%(n=9)(表1)，表明方法準(zhǔn)確度良好。表1 回收率測(cè)定結(jié)果 2.5 線性和范圍 y=5.178107x-1.981105 r=0.9997 2.6 方法精密度 同一批樣品，分別進(jìn)樣6次，依法測(cè)定含量，結(jié)果含量的RSD為0.08%，表明方法精密度良好。 2.7 檢測(cè)限和定量限 以信噪比3時(shí)，注入儀器的量確定CS的檢測(cè)限為1.8ng；以信噪比10時(shí)，確定CS的定量限為5.9ng。 2.8 樣品溶液的穩(wěn)定性論文出處(作者): 在同一批樣品的溶液，在0、1、2、3、4和5h分別

10、進(jìn)樣進(jìn)行考察溶液的穩(wěn)定性，測(cè)得峰面積的積分值，結(jié)果RSD為0.78%，表明在室溫(25)條件下，溶液放置6h，其主峰面積沒(méi)有變化，保留時(shí)間也基本沒(méi)有變化。因此，CS溶液穩(wěn)定性好。 2.9&n bsp; 重復(fù)性試驗(yàn) 分別平行制備6份CS供試品溶液。在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣20l，測(cè)得CS的含量。結(jié)果顯示RSD為0.58%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性好(表2)。 2.10 有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定 原料測(cè)定溶液的制備 精密稱取CS 15mg，置25ml容量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml容量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。 測(cè)定方法 量取對(duì)照品20

11、l注入液相色譜儀中，調(diào)節(jié)檢測(cè)器靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的20%，再分別精密量取上述各溶液20l，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖至20min(表3)。 表2 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果表3 有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果 2.11 含量測(cè)定 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定CS對(duì)照品適量，加水溶解并稀釋成每1ml中約含CS 0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。 供試品溶液的制備 取本品適量，精密稱定，加水制成每1ml中約含0.3mg CS的溶液，作為供試品溶液。 測(cè)定方法 取CS原料3批，按上述方法制被測(cè)定溶液，各20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算CS含量，結(jié)果見(jiàn)表4。 取CS原料3批(同上)，用電

12、位滴定法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。 3 討論 (2)檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取CS對(duì)照品適量，用水溶解并稀釋至15g/ml的溶液。在200700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果CS在此范圍內(nèi)無(wú)最大吸收波長(zhǎng)，但考慮其邊緣效應(yīng)，同時(shí)考慮到其基線噪音的穩(wěn)定性，故選擇CS和雜質(zhì)均有較高檢測(cè)靈敏度作為測(cè)定波長(zhǎng)。 (3)柱溫的選擇 分別將柱溫設(shè)為25、30、35、40、45和50，結(jié)果顯示柱溫對(duì)分離影響不大，但升高柱溫可使系統(tǒng)平衡時(shí)間縮短，基線穩(wěn)定性明顯改善，降低了流動(dòng)相的粘度和柱壓，縮短了保留時(shí)間，提高柱效，適當(dāng)改善峰形，使試驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性更好。 (4)與電位滴定方法的比較 電位滴定法測(cè)定CS含量時(shí)，共有三個(gè)突躍點(diǎn)，計(jì)算采用第一和第三突躍之間的滴定數(shù)差值。但是它的第一個(gè)突躍很不顯著，影響結(jié)果的判定，也影響測(cè)定準(zhǔn)確度。采用高效液相色譜法，簡(jiǎn)單、快速且準(zhǔn)確度高。 致謝：本文的實(shí)驗(yàn)得到長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院2002級(jí)學(xué)生張文波和宋鑫鑫兩位同學(xué)的大