酪蛋白的提取與測(cè)定

1、牛乳中酪蛋白的制備與濃度測(cè)定一、試驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)從牛乳中分別酪蛋白的原理和方法2、把握等電點(diǎn)沉淀法提取蛋白質(zhì)的方法3、了解紫外吸取法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理，生疏紫外分光光度計(jì)的使用4、學(xué)會(huì)用考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度二、試驗(yàn)原理1、預(yù)備酪蛋白原理：牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白兩種蛋白質(zhì)，其中酪蛋白占了牛乳蛋白質(zhì)的80%。牛乳在PH4.7時(shí)酪蛋白等電聚沉后剩余的蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為乳清蛋白。酪蛋白是白色、無(wú)味的物質(zhì)，不溶于水、乙醇等有機(jī)溶劑，但溶于堿溶液。乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水和力量很強(qiáng)，分散性高，在乳中呈高分子狀態(tài)。本法利用等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的原理，將牛乳的PH調(diào)至4.7時(shí)，酪蛋白就沉淀

2、出來(lái)。用乙醇洗滌沉淀物，除去脂類雜質(zhì)后便可得到純的酪蛋白。2、紫外吸取法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理：大多數(shù)蛋白質(zhì)由于有酷氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280nm有吸取高峰，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。但是核酸在280nm也有吸取，干擾測(cè)定，不過(guò)核酸的最大吸取峰在260nm，通過(guò)測(cè)定在280nm和260nm時(shí)A的比值，然后通過(guò)計(jì)算消退核酸存在的影響，可以求得有核酸存在時(shí)蛋白質(zhì)的濃度。3、考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度原理：考馬斯亮藍(lán)能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)相結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性?？捡R斯亮藍(lán)G250的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸取峰在465nm。當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)呈藍(lán)色，其最大吸取峰轉(zhuǎn)變?yōu)?95nm

3、，考馬斯亮藍(lán)G250蛋白質(zhì)復(fù)合物的高消光效應(yīng)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)定量測(cè)定的高敏感度。在肯定范圍內(nèi)，考馬斯亮藍(lán)G250蛋白質(zhì)復(fù)合物呈色后，在595nm下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可以用于蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定。三、試驗(yàn)器材與試劑1、制備酪蛋白：燒杯、玻璃棒、量筒、精密PH試紙、離心機(jī)、布氏漏斗、表面皿、恒溫水浴鍋牛奶、醋酸緩沖液、冰醋酸、95%乙醇、無(wú)水乙醚2、紫外光吸取法：紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)、容量瓶50ml(1)、石英比色皿0.9%NaCl、1mol/LNaOH溶液、1mol/L乙酸溶液3、考馬斯亮藍(lán)法：紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)、試管1.5cm15cm(9)、玻璃比色皿牛血清白蛋白（0.1mg/ml）

4、、考馬斯亮藍(lán)、0.9%NaCl四、試驗(yàn)步驟制備酪蛋白1、將20mL pH4.7的醋酸-醋酸鈉緩沖液預(yù)熱至402、將20mL牛奶加熱至40，在攪拌下緩慢地加入20mL預(yù)熱的pH4.7的醋酸-醋酸鈉緩沖液3、用精密pH試紙調(diào)pH至4.7，可見(jiàn)溶液變?yōu)槿榘咨珣腋∫?、待懸浮液冷卻至室溫，4000rpm離心5min，棄上清，得酪蛋白粗制品5、用蒸餾水洗沉淀3次，3000rpm離心5min，棄上清6、在沉淀中加入20mL95乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾7、用乙醇-乙醚混合液洗滌沉淀2次（10ml/次），最終用乙醚洗滌沉淀2次（10ml/次），抽干8、將沉淀攤開在表面皿上，風(fēng)干，得酪蛋

5、白純品9、精確稱量，計(jì)算含量和得率紫外光吸取法1取待測(cè)樣品溶液置于的石英比色皿中，于分光光度計(jì)波長(zhǎng)280nm和260nm，分別讀取A280nm和A260nm，用生理鹽水為比色空白對(duì)比。2若A280nm/A260nm1.5，用公式：蛋白質(zhì)含量（mg/ml）=A280nm/6.3*10若A280nm/A260nm1.5，用公式：蛋白質(zhì)含量（mg/ml）=1.45A280nm0.74A260nm考馬斯亮藍(lán)法取9支潔凈試管，按表進(jìn)行編號(hào)并加入試劑?；靹?，室溫靜置3min，以第1管為空白，于波長(zhǎng)595nm處比色，讀取吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)液濃度（g/ml）作為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。五、試驗(yàn)數(shù)據(jù)酪蛋白質(zhì)量：0.5421g酪蛋白含量：2.71g/100ml牛乳紫外光吸取法：A280nm 0.769A A260nm 0.959AA280nm/A260nm1.5，蛋白質(zhì)含量（mg/ml）=1.45A280nm0.74A260nm =0.405 mg/ml考馬斯亮藍(lán)法管號(hào)1（空白）23456789標(biāo)準(zhǔn)蛋白液/ml00.10.20.30.40.60.8樣品/ml110.9%NaCl/ml10.90.80.70.60.40.200考馬斯亮藍(lán)染液/ml4.04.04.04.04.04.0