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文檔簡(jiǎn)介
1、流式細(xì)胞儀常用的幾種檢測(cè)方法(轉(zhuǎn)載)一、測(cè)定用乙醇固定的DNA的含量1、培育細(xì)胞的DNA含量的測(cè)定制備單細(xì)胞懸液于200l的PBS緩沖液中;加入2ml預(yù)冷的70%乙醇,4保存;附:細(xì)胞固定的一般步驟1) 取單細(xì)胞懸液12×106個(gè)細(xì)胞于PBS(PH=7.2)緩沖液中;2) 300g離心5分鐘,棄上清,反復(fù)兩次;3) 重懸細(xì)胞于0.5ml PBS緩沖液中;4)
2、0; 將細(xì)胞懸液放置于23ml冷70%乙醇中,混勻,保存于4,至少30分鐘。在4條件下可保存23周。留意:² 依據(jù)試驗(yàn)的要求,固定劑也可選用13%多聚甲醛;² 將乙醇作為固定劑時(shí),乙醇應(yīng)預(yù)冷至04;² 細(xì)胞在固定時(shí),固定劑應(yīng)緩慢滴入細(xì)胞懸液中,使固定劑的濃度緩慢增加,并不斷震搖,以免細(xì)胞成團(tuán)(特殊是用乙醇固定時(shí))。²
3、; 300g離心5分鐘,去上清,再重懸于400l PBS中;² 顯微鏡下觀看,若有明顯的黏附,須再用篩網(wǎng)過(guò)濾;² 加入PI(含Rnase),避光孵育30分鐘;² 上機(jī)檢測(cè)。2、新穎組織的DNA含量的測(cè)定1) 用200mg濕重組織用機(jī)械法制成單細(xì)胞懸液;2)
4、60; 500g離心5分鐘;3) 棄上清,重懸于10ml染色-去污劑中;4) 再過(guò)濾,用200目的篩網(wǎng)或7080m的篩網(wǎng)過(guò)濾;5) 上機(jī)檢測(cè)。3、石蠟包埋組織切片的DNA含量的測(cè)定1) 從石蠟包埋切取切片50 m厚,23片,制成單細(xì)胞懸液;2)
5、; 用PBS緩沖液洗滌,500g離心5分鐘,棄上清;3) 加入PI液1ml室溫避光30分鐘;4) 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml;5) 上機(jī)檢測(cè)。二、細(xì)胞凋亡檢測(cè)及相關(guān)分子檢測(cè)1、細(xì)胞DNA含量分布(由細(xì)胞DNA降解方式檢測(cè)細(xì)胞凋亡)² 收集已固定的單細(xì)胞懸液約5×1051
6、×106/ml;² 離心除去固定液,3ml PBS重懸細(xì)胞;² 1500rpm離心,5分鐘 ,棄去PBS;² 加PI染液1ml,室溫避光20分鐘;² 調(diào)整細(xì)胞濃度5×105/ml;² 上機(jī)檢測(cè)。2、磷脂酰絲氨酸外翻分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡1)
7、; 常規(guī)制備單細(xì)胞懸液,用PBS洗兩次.(若為全血要先溶 血),取約5×106個(gè)細(xì)胞,1500rpm離心,棄上清,用400l 1×Binding Buffer重懸; 2) 分成a、b、c、d、e五管,每管約1×106個(gè)細(xì)胞a)
8、 陰性對(duì)比,不加任何試劑;b) 陽(yáng)性對(duì)比,加2%多聚甲醛固定30分鐘,加AnnexinV 5l,室溫10min,用1×Binding Buffer洗一次,棄上清再加190l 緩沖液、10l PI避光15分鐘 c) 加10l PI,避光孵育15分鐘;d) 加5l Ann
9、exinV液,室溫避光孵育15min;e) 加10l PI和5l AnnexinV液,室溫避光孵育5min;3) 每管各加400l 1×Binding Buffer。4) 上機(jī)檢測(cè)。留意 a. 操作動(dòng)作要盡量輕柔,勿用力吹打細(xì)胞;b. 操作時(shí)留意避光;c. 反應(yīng)完畢后盡快檢測(cè),最好在一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。3、用單克隆抗體APO2.7檢測(cè)細(xì)胞凋亡1)
10、 放置0.51×106個(gè)細(xì)胞到試管中;2) 室溫離心200g,6min;3) 棄上清,加入100l冷的(4)在PBSF溶液中含100µg/ml的digitonnin,輕輕地重懸細(xì)胞,在冰上孵育20min;4) 加入2ml冷的(4)PBSF液,室溫離心200g,6min;5)
11、; 棄上清,加入20l PE標(biāo)記的Apo2.7 單克隆抗體和80l PBSF液,用vortex輕輕震蕩,室溫避光孵育15分鐘;6) 加入2ml PBSF液,室溫離心200g,6min;7) 棄上清,加入1ml PBSF液重懸細(xì)胞;8) 避光保存,直到流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
12、PBSF:含2.5% FCS(v/v)和0.01%NaN3(w/v)的PBS。三、用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DNA周期分析 1、方法:同DNA含量檢測(cè) 2、留意:?jiǎn)渭?xì)胞濃度應(yīng)約106/ml,以免影響檢測(cè)的CV值和檢測(cè)結(jié)果;制備完成后的標(biāo)本應(yīng)用光學(xué)顯微鏡檢查其質(zhì)量(如細(xì)胞是否聚集或過(guò)多碎片),以保證得到足夠的細(xì)胞含量;醛類(lèi)固定會(huì)影響PI與核酸的結(jié)合。四、免疫熒光標(biāo)記法1、細(xì)胞膜上的免疫熒光檢測(cè)法間接標(biāo)記法1) 制備單細(xì)胞懸液;2)
13、60; 細(xì)胞計(jì)數(shù),取出1×106個(gè)細(xì)胞于試管中;3) 用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)活細(xì)胞數(shù),要求活細(xì)胞數(shù) >9095%;4) 在試管中加入一抗,(劑量依據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求),孵育3060分鐘;5) PBS洗滌12次,1500rpm,離心3分鐘,棄上清;6)
14、; 加入二抗,孵育2030分鐘;7) PBS洗一次,1500rpm,離心3分鐘,棄上清;8) 加300l PBS,上機(jī)檢測(cè)(若不能準(zhǔn)時(shí)上機(jī)檢測(cè),可加1ml 1%多聚甲醛固定,可放置1周)。直接標(biāo)記法同間接標(biāo)記法在試管中加入熒光標(biāo)記的抗體,混勻,孵育30分鐘;用PBS洗2次,1500rpm,離心3分鐘,棄上清;加300l PBS(PH=7.4),上機(jī)檢測(cè)。2、細(xì)胞膜內(nèi)的免疫熒光標(biāo)記法間接免疫熒光標(biāo)記法1)
15、; 取已制備好的單細(xì)胞懸液,用13%的多聚甲醛固定30分鐘(也可4保存過(guò)夜);2) 用PBS洗兩次,棄上清;3) 細(xì)胞膜打孔,加入0.1%皂素 200l,室溫10分鐘;4) 用PBS洗滌兩次;5) 加入第一抗體,室溫3060分鐘,或4過(guò)夜,同時(shí)須設(shè)陰性對(duì)比或同型對(duì)比管
16、;6) 用PBS洗滌兩次;7) 加入二抗(熒光標(biāo)記的抗體)室溫20分鐘,避光;8) 用PBS洗滌12次,棄上清;9) 重懸細(xì)胞于500lPBS中,上機(jī)檢測(cè)。直接熒光標(biāo)記法同間接熒光標(biāo)記法;加入熒光素標(biāo)記好的抗體,避光30分鐘(同時(shí)做同型對(duì)比管);用PBS洗滌次,棄上清;加300l PBS上機(jī)檢測(cè)。細(xì)胞膜
17、上及細(xì)胞內(nèi)雙標(biāo)記法(直標(biāo)法)1) 取出已制備好的未固定的單細(xì)胞懸液1×10 6個(gè)細(xì)胞于試管中;2) 用PBS洗滌兩次;3) 加入用熒光素標(biāo)記的抗體來(lái)標(biāo)記細(xì)胞膜上的抗原,同時(shí)加上陰性對(duì)比管,室溫孵育20分鐘;4) 在試管中加入13多聚甲醛1ml,固定30分鐘;5)
18、60; PBS洗滌兩次1500rpm 3分鐘,棄上清;6) 打孔,加入0.1皂素200l室溫10分鐘;7) 用PBS洗滌兩次,棄上清;8) 加入用熒光素標(biāo)記的抗體,標(biāo)記膜內(nèi)的抗原(標(biāo)記膜內(nèi)的抗體的熒光素的顏色與膜上標(biāo)記的熒光素的顏色務(wù)必不相同)室溫20分鐘孵育;9) 用PBS洗一遍棄上清;10) 用300lPBS重懸細(xì)胞,上機(jī)檢測(cè)五、流式細(xì)胞術(shù)中的幾點(diǎn)留意事項(xiàng):1、對(duì)比組的設(shè)置: 在流式細(xì)胞術(shù)中所測(cè)得的量都是相對(duì)值,不是確定值。如需知道確定值時(shí)必需設(shè)置對(duì)比組樣品。對(duì)比組樣品包括有陰性對(duì)比和陽(yáng)性對(duì)比。(1)、陰性對(duì)比的設(shè)置² 在試驗(yàn)過(guò)程中,如做間接標(biāo)記法,可設(shè)置與一抗無(wú)關(guān)的試驗(yàn),即在試驗(yàn)中不加一抗而只加上帶有熒光標(biāo)記的其次抗體作為陰性對(duì)比管,作為陰性對(duì)比。²
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