流式細(xì)胞儀常用的幾種檢測(cè)方法

1、流式細(xì)胞儀常用的幾種檢測(cè)方法（轉(zhuǎn)載）一、測(cè)定用乙醇固定的DNA的含量1、培育細(xì)胞的DNA含量的測(cè)定制備單細(xì)胞懸液于200l的PBS緩沖液中；加入2ml預(yù)冷的70%乙醇，4保存；附:細(xì)胞固定的一般步驟1)        取單細(xì)胞懸液12×106個(gè)細(xì)胞于PBS（PH=7.2）緩沖液中；2)        300g離心5分鐘，棄上清，反復(fù)兩次；3)        重懸細(xì)胞于0.5ml PBS緩沖液中；4)

2、0;       將細(xì)胞懸液放置于23ml冷70%乙醇中，混勻，保存于4，至少30分鐘。在4條件下可保存23周。留意：²       依據(jù)試驗(yàn)的要求，固定劑也可選用13%多聚甲醛；²       將乙醇作為固定劑時(shí)，乙醇應(yīng)預(yù)冷至04；²       細(xì)胞在固定時(shí)，固定劑應(yīng)緩慢滴入細(xì)胞懸液中，使固定劑的濃度緩慢增加，并不斷震搖，以免細(xì)胞成團(tuán)（特殊是用乙醇固定時(shí)）。²   

3、;    300g離心5分鐘，去上清，再重懸于400l PBS中；²       顯微鏡下觀看，若有明顯的黏附，須再用篩網(wǎng)過(guò)濾；²       加入PI（含Rnase），避光孵育30分鐘；²       上機(jī)檢測(cè)。2、新穎組織的DNA含量的測(cè)定1)        用200mg濕重組織用機(jī)械法制成單細(xì)胞懸液；2)      

4、60; 500g離心5分鐘；3)        棄上清，重懸于10ml染色-去污劑中；4)        再過(guò)濾，用200目的篩網(wǎng)或7080m的篩網(wǎng)過(guò)濾；5)        上機(jī)檢測(cè)。3、石蠟包埋組織切片的DNA含量的測(cè)定1)        從石蠟包埋切取切片50 m厚，23片，制成單細(xì)胞懸液；2)      

5、;  用PBS緩沖液洗滌，500g離心5分鐘，棄上清；3)        加入PI液1ml室溫避光30分鐘；4)        調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml；5)        上機(jī)檢測(cè)。二、細(xì)胞凋亡檢測(cè)及相關(guān)分子檢測(cè)1、細(xì)胞DNA含量分布（由細(xì)胞DNA降解方式檢測(cè)細(xì)胞凋亡）²       收集已固定的單細(xì)胞懸液約5×1051

6、×106/ml；²       離心除去固定液，3ml PBS重懸細(xì)胞;²       1500rpm離心，5分鐘 ，棄去PBS；²       加PI染液1ml，室溫避光20分鐘；²       調(diào)整細(xì)胞濃度5×105/ml；²       上機(jī)檢測(cè)。2、磷脂酰絲氨酸外翻分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡1)    

7、;    常規(guī)制備單細(xì)胞懸液,用PBS洗兩次.(若為全血要先溶                            血),取約5×106個(gè)細(xì)胞，1500rpm離心,棄上清,用400l 1×Binding Buffer重懸； 2)        分成a、b、c、d、e五管，每管約1×106個(gè)細(xì)胞a)

8、        陰性對(duì)比，不加任何試劑；b)        陽(yáng)性對(duì)比,加2%多聚甲醛固定30分鐘,加AnnexinV 5l,室溫10min,用1×Binding Buffer洗一次,棄上清再加190l 緩沖液、10l PI避光15分鐘    c)        加10l PI，避光孵育15分鐘；d)        加5l Ann

9、exinV液，室溫避光孵育15min；e)        加10l PI和5l AnnexinV液，室溫避光孵育5min；3)        每管各加400l 1×Binding Buffer。4)        上機(jī)檢測(cè)。留意 a. 操作動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞；b. 操作時(shí)留意避光；c. 反應(yīng)完畢后盡快檢測(cè)，最好在一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。3、用單克隆抗體APO2.7檢測(cè)細(xì)胞凋亡1)   

10、     放置0.51×106個(gè)細(xì)胞到試管中；2)        室溫離心200g，6min；3)        棄上清，加入100l冷的（4）在PBSF溶液中含100µg/ml的digitonnin，輕輕地重懸細(xì)胞，在冰上孵育20min；4)        加入2ml冷的（4）PBSF液，室溫離心200g，6min；5)    

11、;    棄上清，加入20l PE標(biāo)記的Apo2.7 單克隆抗體和80l PBSF液，用vortex輕輕震蕩，室溫避光孵育15分鐘；6)        加入2ml PBSF液，室溫離心200g，6min；7)        棄上清，加入1ml PBSF液重懸細(xì)胞；8)        避光保存，直到流式細(xì)胞儀檢測(cè)。        

12、PBSF：含2.5% FCS（v/v）和0.01%NaN3（w/v）的PBS。三、用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DNA周期分析     1、方法：同DNA含量檢測(cè)      2、留意：?jiǎn)渭?xì)胞濃度應(yīng)約106/ml，以免影響檢測(cè)的CV值和檢測(cè)結(jié)果；制備完成后的標(biāo)本應(yīng)用光學(xué)顯微鏡檢查其質(zhì)量（如細(xì)胞是否聚集或過(guò)多碎片），以保證得到足夠的細(xì)胞含量；醛類(lèi)固定會(huì)影響PI與核酸的結(jié)合。四、免疫熒光標(biāo)記法1、細(xì)胞膜上的免疫熒光檢測(cè)法間接標(biāo)記法1)        制備單細(xì)胞懸液；2)

13、60;       細(xì)胞計(jì)數(shù)，取出1×106個(gè)細(xì)胞于試管中；3)        用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)活細(xì)胞數(shù)，要求活細(xì)胞數(shù) >9095%；4)        在試管中加入一抗，（劑量依據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求），孵育3060分鐘；5)        PBS洗滌12次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清；6)       

14、; 加入二抗，孵育2030分鐘；7)        PBS洗一次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清;8)        加300l PBS，上機(jī)檢測(cè)(若不能準(zhǔn)時(shí)上機(jī)檢測(cè)，可加1ml 1%多聚甲醛固定，可放置1周)。直接標(biāo)記法同間接標(biāo)記法在試管中加入熒光標(biāo)記的抗體，混勻，孵育30分鐘；用PBS洗2次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清;加300l PBS(PH=7.4)，上機(jī)檢測(cè)。2、細(xì)胞膜內(nèi)的免疫熒光標(biāo)記法間接免疫熒光標(biāo)記法1)    

15、;    取已制備好的單細(xì)胞懸液，用13%的多聚甲醛固定30分鐘（也可4保存過(guò)夜）；2)        用PBS洗兩次，棄上清；3)        細(xì)胞膜打孔，加入0.1%皂素 200l，室溫10分鐘；4)        用PBS洗滌兩次；5)        加入第一抗體，室溫3060分鐘，或4過(guò)夜，同時(shí)須設(shè)陰性對(duì)比或同型對(duì)比管

16、；6)        用PBS洗滌兩次；7)        加入二抗（熒光標(biāo)記的抗體）室溫20分鐘，避光；8)        用PBS洗滌12次，棄上清；9)        重懸細(xì)胞于500lPBS中，上機(jī)檢測(cè)。直接熒光標(biāo)記法同間接熒光標(biāo)記法；加入熒光素標(biāo)記好的抗體，避光30分鐘（同時(shí)做同型對(duì)比管）；用PBS洗滌次，棄上清；加300l PBS上機(jī)檢測(cè)。細(xì)胞膜

17、上及細(xì)胞內(nèi)雙標(biāo)記法（直標(biāo)法）1)        取出已制備好的未固定的單細(xì)胞懸液1×10 6個(gè)細(xì)胞于試管中；2)        用PBS洗滌兩次；3)        加入用熒光素標(biāo)記的抗體來(lái)標(biāo)記細(xì)胞膜上的抗原，同時(shí)加上陰性對(duì)比管，室溫孵育20分鐘；4)        在試管中加入13多聚甲醛1ml，固定30分鐘；5)   

18、60;    PBS洗滌兩次1500rpm 3分鐘，棄上清;6)        打孔，加入0.1皂素200l室溫10分鐘;7)        用PBS洗滌兩次，棄上清;8)        加入用熒光素標(biāo)記的抗體，標(biāo)記膜內(nèi)的抗原（標(biāo)記膜內(nèi)的抗體的熒光素的顏色與膜上標(biāo)記的熒光素的顏色務(wù)必不相同）室溫20分鐘孵育;9)        用PBS洗一遍棄上清；10)    用300lPBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)五、流式細(xì)胞術(shù)中的幾點(diǎn)留意事項(xiàng)：1、對(duì)比組的設(shè)置：       在流式細(xì)胞術(shù)中所測(cè)得的量都是相對(duì)值，不是確定值。如需知道確定值時(shí)必需設(shè)置對(duì)比組樣品。對(duì)比組樣品包括有陰性對(duì)比和陽(yáng)性對(duì)比。（1）、陰性對(duì)比的設(shè)置²       在試驗(yàn)過(guò)程中，如做間接標(biāo)記法，可設(shè)置與一抗無(wú)關(guān)的試驗(yàn)，即在試驗(yàn)中不加一抗而只加上帶有熒光標(biāo)記的其次抗體作為陰性對(duì)比管，作為陰性對(duì)比。²