殼聚糖水凝膠作為藥物載體在藥物控釋方面應(yīng)用的研究

1、殼聚糖水凝膠作為藥物載體在藥物控釋方面應(yīng)用的研究1.立項依據(jù) 在自然界中，多糖分布極為廣泛，它是一種天然的聚合物，具有獨特的結(jié)構(gòu)和特殊的特性，多糖物質(zhì)在人們的生活的各個方面發(fā)揮著重要的作用。甲殼素（chitin)是一種堿性多糖，也是地球上第二大天然再生資源（纖維素的含量第一），其分布廣泛，存在于甲殼動物（如蝦、蟹等的外殼）、藻類等低等植物及微生物（菌類的細胞壁）中。甲殼素的C-2位的羥基被乙酰基取代，同植物纖維素的結(jié)構(gòu)相似，它在地球上的含量極為豐富，每年自然界的生成量可多達1000億噸。甲殼素呈無定形的白色或淡黃色固體粉末，按其來源不同，分為和兩種構(gòu)型，其分子鏈以螺旋形式平行排列，分子中有大量

2、的乙酰基和羥基，分子內(nèi)氫鍵作用較強，具有十分緊密的晶體結(jié)構(gòu)，不溶于烯酸、堿、水和一般的有機溶劑，只能溶解于強酸以及少數(shù)有機溶劑中。甲殼素為N-乙酰-D-葡萄糖胺的聚糖，其結(jié)構(gòu)式為： 由于其良好的生物相容性、低毒性，對酶的敏感性，在用作制備水凝膠材料方面，引起人們廣泛的興趣。在這些高分子中，多糖還具有其獨特的優(yōu)點，如無免疫原性，無傳播動物源病菌的潛在危險性等。其中的一個多糖就是殼聚糖。 殼聚糖（chitosan)是由2-乙酰氨基葡萄糖和2-氨基葡萄糖和通過-1,4糖苷鍵連接而成，結(jié)構(gòu)與纖維素類似，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為： 甲殼素在強堿性環(huán)境下，可通過脫乙酰而得到殼聚糖，殼聚糖是甲殼素最為重要的衍生物。殼

3、聚糖具有其他天然高分子材料的優(yōu)點，又不會引發(fā)免疫反應(yīng)。殼聚糖（CS）不同于其他多糖，其分子結(jié)構(gòu)中存在氨基，可被質(zhì)子化，能形成聚電解質(zhì)絡(luò)合物。殼聚糖是一種無毒、可生物降解、具有良好的生物相容性及良好的生物粘附性的天然高分子材料，在生物醫(yī)藥，環(huán)境工程以及生物技術(shù)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，使之成為藥物控制釋放領(lǐng)域中的理想載體。將殼聚糖羧甲基化，可制備得到水溶性很好的羧甲基殼聚糖(CMCS)，一方面羧基的引入極大提高了殼聚糖在水中的溶解性，另一方面，羧甲基殼聚糖分子中既含有氨基又含有羧基，是一種兩性高分子聚合物，應(yīng)用比殼聚糖更加廣泛。甲醛、戊二醛、馬來酸酐、鈣離子等常用來作為制備殼聚糖系水凝膠的交聯(lián)劑。但甲

4、醛、戊二醛等的毒性較大，這影響了水凝膠在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。而經(jīng)鈣離子交聯(lián)得到的水凝膠機械性能較差，而且容易與體內(nèi)的陽離子(如鈉離子等)發(fā)生離子交換，使水凝膠迅速崩解，從而使凝膠中負載的藥物快速釋放，影響藥物的緩釋效果。 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)是一種無毒的肽鍵縮合劑，本身并沒有成為交聯(lián)的一部分，常作為氨基和羧基的交聯(lián)。為了避免有毒的交聯(lián)劑的使用，拓寬羧甲基殼聚糖在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，所以本研究以水溶性好的羧甲基殼聚糖(CMCS)為原料，以EDC為交聯(lián)劑，制備得到新型的EDC/羧甲基殼聚水凝膠。 水凝膠是由帶有親水性基團 (COOH、OH、CONH2)的水溶性單

5、體通過聚合反應(yīng)并以物理或化學(xué)交聯(lián)的方式所形成的具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的高分子聚合物。水凝膠能顯著地溶脹與水中或者生物體液中溶脹并能保持大量水分而不被溶解。近年來，智能水凝膠引起了科研者的大量關(guān)注，因為智能水凝膠能夠感知周圍環(huán)境如溫度、磁場、電場、pH、離子強度等刺激的微小變化并對環(huán)境刺激產(chǎn)生響應(yīng)特性。水凝膠的響應(yīng)性能是通過凝膠的可逆體積相變來實現(xiàn)的，并使它在傳感器、人造肌肉、藥物控制釋放、組織工程、催化體系、酶的固定等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。 由于傳統(tǒng)的給藥方式有口服和注射等，使治療藥物的毒性不僅存在于腫瘤部位，而且會散布于身體的各個部位，對正常身體部位產(chǎn)生一定程度的損傷。同時由于藥物濃度在體內(nèi)廣泛

6、分布，到達腫瘤部位的藥物濃度就會變小，可能導(dǎo)致其低于藥物的治療濃度，以致使它達不到應(yīng)有的效果。溫敏性載藥水凝膠可以對藥 物的釋放起到一定的緩釋作用，使藥物釋放變得緩慢；也可以根據(jù)病變部位與正常組織不同而識別病變器官，從而有選擇性地進攻，使藥物濃度更有效地分布，增強藥物治療效果，同時達到原位控制治療，減小藥物的毒副作用，因此，制備能夠負載藥物并具有藥物緩釋性能的藥物載體，在臨床醫(yī)學(xué)和制藥學(xué)中是非常需要的。智能水凝膠由于其能夠在相對苛刻的條件下，保護藥物并將藥物在原位緩慢釋放藥物而倍受青睞。2.項目研究的內(nèi)容和方案 由于殼聚糖具有良好的生物活性和生物相容性等優(yōu)良特點，因此被廣泛的應(yīng)用于生物醫(yī)藥等領(lǐng)

7、域。然而殼聚糖的親水性較差，僅能溶解在酸性介質(zhì)溶液中，不溶于水，不溶于中性和堿性的環(huán)境中，限制了其子在生物領(lǐng)域和生物大分子藥物傳輸遞送上的應(yīng)用。由于殼聚糖分子具有豐富的活性羥基和氨基基團，通過化學(xué)方法，對其分子進行修飾，制備殼聚糖衍生物，這不僅提高了殼聚糖的溶解性，同時新引入的取代基團也增加了殼聚糖新的活性特點和性能。通過羧基化反應(yīng)對殼聚糖結(jié)構(gòu)進行改性：由于殼聚糖上的羥基或氨基可與氯代烷酸（氯乙酸）、乙醛酸等反應(yīng)，將極性的羧酸基團引入分子鏈上。羧甲基殼聚糖的制備原理圖如下（1）： 圖（1）其中羧甲甲基化研究比較廣泛，由于羧基基團和殼聚糖反應(yīng)位置的不同，在反應(yīng)中，可以生成量子羧甲基殼聚糖，分為：

8、O-羧甲基殼聚糖(O-CM-Chitosan)、N-羧甲基殼聚糖(N-CM-Chitosan)和N,O-羧甲基殼聚糖(N,O-CM-Chitosan)。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)Ha-Na NaS等首先將殼聚糖用亞硝酸鈉(NaN02)和硼氫化鈉(NaBH4）降解得到到低分子量的殼聚糖(LMCS)；然后將低分子量的殼聚糖用60的氫氧化鈉堿化處理后，和氯乙酸反應(yīng)制備得到了低分子量的羧甲基殼聚糖(LM-O-CMCS)，其具有很好的水溶性和低的細胞毒性。根據(jù)Qingping Song在90的條件下，用氯乙酸代替相對昂貴的乙醛酸，和殼聚糖反應(yīng)4h，制備得到了N-羧甲基殼聚糖(N-CM-Chitosan),同時取代

9、度高達1.32以上。本文以EDC為交聯(lián)劑，活化羧甲基殼聚糖為單體，加入引發(fā)劑過二硫酸銨，使殼聚糖上的羧基和自身的氨基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)制備得到EDC/羧甲基殼聚糖水凝膠，水凝膠交聯(lián)原理圖如下（2）。通過傅立葉紅外光譜、X衍射和掃描電鏡對EDC/羧甲基殼聚糖水凝膠結(jié)構(gòu)進行了表征。通過單因素實驗測定了交聯(lián)劑和殼聚糖衍生物溶液濃度對凝膠時間的影響以及測定相應(yīng)的溶脹度，系統(tǒng)研究了EDC/羧甲基殼聚糖水。 圖（2）實驗中采用制備的羧甲基殼聚糖水凝膠包裹順鉑藥物，測試了其水凝膠在不同pH條件下體外釋藥性。將所制備的羧甲基殼聚糖水凝膠放置在不同pH環(huán)境下(pH=2鹽酸溶液和pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液)，觀察其溶脹

10、率，可以看出所制備的羧甲基殼聚糖水凝膠具有良好的pH敏感性。同時將載藥干凝膠置于pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中研究釋藥動力學(xué)，同時對水凝膠的藥物釋放過程進行模擬，由于水凝膠的釋藥過程大致可分為內(nèi)擴散和外擴散兩個主要步驟，即藥物從水凝膠的內(nèi)部擴散到水凝膠的表面，再從水凝膠的表面擴散到接受液中。關(guān)于水凝膠的釋藥過程尚無合適的理論機制去描述，而是用一些經(jīng)驗方程來擬合。常用的有零級、一級動力學(xué)方程、Higuchi 方程、Peppas半經(jīng)驗方程、Ritger-Peppas經(jīng)驗方程等。本研究根據(jù)所得實驗數(shù)據(jù)規(guī)律，對一級動力學(xué)模型進行適當修正后來對羧甲基殼聚糖水凝膠的釋放藥物過程的描述。 3.項目目標（1）

11、通過化學(xué)修飾，改善殼聚糖的結(jié)構(gòu)，制備具有良好親水性的羧甲基殼聚糖；（2） 通過聚合反應(yīng)，制備新型EDC/羧甲基殼聚糖水凝膠；（3） 通過包埋，使抗癌藥物順鉑包埋在已制備的新型EDC/羧甲基殼聚糖水凝膠，同時研究其pH敏感性；（4） 制備的藥物進行體外釋放研究。4.擬解決的關(guān)鍵問題由于殼聚糖親水性較差，不溶于水，僅能溶解在酸性溶液中，限制了其在生物領(lǐng)域和生物大分子藥物傳輸遞送上的應(yīng)用。同時殼聚糖分子含有大量的羥基和氨基，對其分子進行修飾，制備水溶性好、親水性強的殼聚糖衍生物可有效改善這一問題。然而殼聚糖分子在進行羧基化的過程中出現(xiàn)多個羧甲基殼聚糖異構(gòu)體，是產(chǎn)率降低，同時所得的殼聚糖不夠單一，給后

12、期實驗的水凝膠結(jié)構(gòu)的分析帶來困難。由于羧甲基殼聚糖是殼聚糖羧基化的產(chǎn)物，能較為廣泛pH范圍內(nèi)能完全溶解，然而pH的變化是通過殼聚糖中游離羧基，氨基進行控制的，通過控制羧甲基殼聚糖單體的量，研究制備的新型pH敏感性EDC/羧甲基殼聚糖水凝膠，同時對水凝膠的藥物釋放過程進行模擬有一定的困難，因為關(guān)于水凝膠的釋藥過程尚無合適的理論機制去描述，而是用一些經(jīng)驗方程來擬合。常用的有零級、一級動力學(xué)方程、Higuchi 方程、Peppas半經(jīng)驗方程、Ritger-Peppas經(jīng)驗方程等。由于研究過程中誤差很大，對經(jīng)驗方程的確定有難度。5.可行性分析據(jù)文獻報道，殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中存在大量的活性氨基和羥基基團，通

13、過羧基化反應(yīng)，使殼聚糖在堿性NaOH水溶液中，與氯乙酸進行羧基化反應(yīng)。羧甲基殼聚糖是殼聚糖羧基化的產(chǎn)物，能較為廣泛pH范圍內(nèi)能完全溶解，這是因為羧甲基殼聚糖是殼聚糖羧化得到的一種兩性聚電解質(zhì)，水凝膠中存在大量的羧基、氨基以及羥基基團，在不同的pH環(huán)境條件下具有不同的解離程度，從而導(dǎo)致所制備的水凝膠具有良好pH敏感性。由于凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中富含氨基基團，pH減小時，氨基被質(zhì)子化，靜電作用和親水作用加強，使得水凝膠更易吸水溶脹；pH增大后，殼聚糖鏈中游離的氨基增多，與殼聚糖鏈上羥基的氫鍵作用增強，使得殼聚糖分子鏈間發(fā)生卷曲纏結(jié)，導(dǎo)致整個水凝膠失水退溶脹。包埋有順鉑的pH敏感性的羧甲基殼聚

14、糖水凝膠納米粒子，被作為負載化學(xué)治療藥物的載體合成出來，當藥物進入人體后，由于癌細胞周圍的pH要比正常細胞pH低，藥物可以能有選擇的在腫瘤區(qū)域中釋放，通過此想法希望羧甲基殼聚糖能夠被用來作為需在特定 pH 環(huán)境中控釋藥物的載體。6.特色與創(chuàng)新 本研究討論了殼聚糖的結(jié)構(gòu)改性，增加殼聚糖的水溶性，通過控制反應(yīng)條件，制備產(chǎn)物單一的羧甲基殼聚糖。在合成羧甲基殼聚糖水凝膠，通過加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)無毒，為了避免有毒的交聯(lián)劑的使用，拓寬羧甲基殼聚糖在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。同時羧甲基殼聚糖具有pH敏感性，可以將載有藥物的水凝膠能在體內(nèi)特定pH環(huán)境下進行藥物的緩慢釋放，從而

15、達到原位治療疾病的效果。7.預(yù)期研究結(jié)果 通過羧基化反應(yīng)合成改性后的殼聚糖，經(jīng)過聚合作用制備羧甲基殼聚糖水凝膠，測定其水凝膠的溶脹度比為改性的殼聚糖大，同時改性后的羧甲基殼聚糖在不同pH下的藥物釋放率的研究，發(fā)現(xiàn)載有順鉑的羧甲基殼聚糖水凝膠在pH小的藥物釋放率高于pH大的。 參考文獻：1. T. Shirakura, Taylor J. Kelson, Aniruddha Ray, Antonina E. Malyarenko, Raoul Kopelman. Hydrogel nanoparticles with thermally controlled drug release. ACS

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