培訓(xùn)課件：菌落總數(shù)的測(cè)定GB47892-2010-

1、食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定菌落總數(shù)測(cè)定Gb4789.2-2010平板計(jì)數(shù)法 一、定義 1 菌落菌落（colony）： 是指細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上經(jīng)培養(yǎng)后生長(zhǎng)繁殖而形成的能被肉眼所識(shí)別的生長(zhǎng)物集落，它是由數(shù)以萬計(jì)的相同細(xì)菌集聚而成的。2菌落總數(shù)：菌落總數(shù)：是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下( (如如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和時(shí)間培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和時(shí)間) )培養(yǎng)后，所得培養(yǎng)后，所得1g或或1mL檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。以檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。以 CFU/g（mL）來表示。）來表示。 a 在GB4789.2-2010的培養(yǎng)條件下所得結(jié)果，只包括一群在平板計(jì)數(shù)瓊脂

2、上生長(zhǎng)的嗜中溫需氧或兼性厭氧菌的菌落總數(shù)。b 按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定，即在需氧情況下， 36 1培養(yǎng)482 h，能在平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng)發(fā)育的細(xì)菌菌落總數(shù)。所以厭氧或微需氧菌、有特殊營(yíng)養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細(xì)菌，由于現(xiàn)有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長(zhǎng)。C 菌落總數(shù)并不表示實(shí)際中的所有細(xì)菌總數(shù)，也不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類，只包括一群在計(jì)數(shù)平板瓊脂中生長(zhǎng)發(fā)育、嗜中溫的需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落總數(shù)，所以有時(shí)被稱為雜菌數(shù)、需氧菌數(shù)等。 3、區(qū)分定義：細(xì)菌總數(shù) 指一定數(shù)量或面積的食品樣品經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚砗?，在顯微鏡下對(duì)細(xì)菌進(jìn)行直接計(jì)數(shù)。其中包括各種活菌數(shù)和尚未消失的死菌數(shù)。細(xì)菌總數(shù)也稱細(xì)菌直接顯微鏡數(shù)。通

3、常以1 g或1 mL樣品中的細(xì)菌總數(shù)來表示。 4 菌落總數(shù)測(cè)定的衛(wèi)生學(xué)意義 食品本身的新鮮程度加工儲(chǔ)存運(yùn)輸過程中是否受到污染衛(wèi)生質(zhì)量衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)：必須配合大腸菌群的檢驗(yàn)和其他病原菌項(xiàng)目的檢驗(yàn)，才能做出比較全面準(zhǔn)確的評(píng)定。-菌落總數(shù)主要作為判別食品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動(dòng)態(tài)，以便對(duì)被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供依據(jù)。-食品中細(xì)菌菌落總數(shù)越多，則食品含有致病菌的可能性越大，食品質(zhì)量越差；菌落總數(shù)越小，則食品含有致病菌的可能性越小。須配合大腸菌群和致病菌的檢驗(yàn)，才能對(duì)食品做出較全面的評(píng)價(jià)。 二、試驗(yàn)材料1、食品檢樣 2、培養(yǎng)基和試劑 2.1平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基； 2.2

4、無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液 3、設(shè)備和器具 無菌培養(yǎng)皿、無菌吸管/移液槍及無菌槍頭、電磁爐、均質(zhì)器、電子天平、恒溫培養(yǎng)箱、生物安全柜、冰箱、蒸汽滅菌器等。 三、試驗(yàn)流程 1、檢樣 2、做幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液3、選擇23個(gè)適宜稀釋度各1 mL,分別加入滅菌平皿內(nèi) 4、平皿內(nèi)傾注1520 mL瓊脂培養(yǎng)基，混勻 5、36 1培養(yǎng)482小時(shí)或（242）小時(shí)6、記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的各平板菌落數(shù)量7、 計(jì)算菌落總數(shù) 報(bào)告 菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序圖檢樣：25g（ml）樣品加入225ml稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇23個(gè)適宜樣品勻液，各取1mL分別加入無菌培養(yǎng)平皿內(nèi)每皿內(nèi)加入適量（15-20ml）培養(yǎng)基(PCA

5、)，混勻，培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)36482h報(bào)告 四、試驗(yàn)步驟 1樣品的稀釋樣品的稀釋：1.1固體和半固體樣品：稱取25g （mL）樣品至盛有225mL磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min10000r/min均質(zhì)1min2min，或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min2min，制成1:10的樣品勻液。如樣品ph值較低，建議使用磷酸鹽緩沖液，以免影響培養(yǎng)基的凝膠強(qiáng)度。1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品至盛有225mL磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。常見做法：以無菌操作取

6、檢樣25g（mL），放于225mL滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液 的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適量的玻璃珠）或均質(zhì)袋內(nèi)，經(jīng)充分振蕩或拍擊制成1:10的均勻稀釋液。1.3、用1 mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液的試管內(nèi)（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使之混合均勻，制成1:100的稀釋液。 1.4 按上述操作制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。1.5、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計(jì)，選擇23個(gè)適宜稀釋度（液體樣品可包括原液），分別在制作10倍遞增稀釋的同時(shí)，以吸取該稀

7、釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。 同時(shí)分別取1ml空白稀釋液（不含樣品），加入兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。 1.6、稀釋液移入平皿后，及時(shí)將冷卻至46平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約1520ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使其混合均勻。 （二）培養(yǎng)1.1瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，361培養(yǎng)48h2h。水產(chǎn)品301培養(yǎng)72h3h。1.2如樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4毫升），凝固后培養(yǎng)。（三）菌落記數(shù) 菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-formingunits，cfu）表示。做平板菌落數(shù)記錄時(shí)，可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大

8、鏡或菌落計(jì)數(shù)器檢查，以防遺漏。記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間，應(yīng)立即計(jì)數(shù)。如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于04，但不要超過24h。 計(jì)數(shù)規(guī)則計(jì)數(shù)規(guī)則 1 1 選取菌落數(shù)在選取菌落數(shù)在30cfu300cfu之間、無蔓延菌落之間、無蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于低于30cfu的平板記錄具體菌落數(shù)；的平板記錄具體菌落數(shù)；大于大于300cfu的可記錄為多不可計(jì)；的可記錄為多不可計(jì)；每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。計(jì)數(shù)規(guī)則計(jì)數(shù)規(guī)則2 2：有較大片狀菌落生長(zhǎng)的平板，不宜采用，應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度

9、的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而另一半平板菌落分布又很均勻，則可以計(jì)算分布均勻的半個(gè)平板上的菌落數(shù)，再乘以2，以代表一個(gè)平板的菌落數(shù)。計(jì)數(shù)規(guī)則計(jì)數(shù)規(guī)則3 3：當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界限的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界限的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)。則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)。注意：如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算，不要把鏈上生長(zhǎng)的每一個(gè)菌落分開計(jì)數(shù)。 四、結(jié)果與報(bào)告 1、菌落總數(shù)的計(jì)算方法： 1.1 若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。u1.2

10、、N：樣品中菌落數(shù)C：含適宜范圍CFU的平板菌落數(shù)之和n1：適宜范圍菌落數(shù)的第一稀釋度（低稀釋度）平板個(gè)數(shù) n2：適宜范圍菌落數(shù)的第二稀釋度（高稀釋度）平板個(gè)數(shù) d：第一稀釋度（低稀釋度）公式使用的前提：有兩個(gè)連續(xù)稀釋度在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)公式使用的前提：有兩個(gè)連續(xù)稀釋度在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)（30300個(gè)菌落數(shù)）個(gè)菌落數(shù)）菌落總數(shù)計(jì)算公式的改變統(tǒng)計(jì)學(xué)依據(jù)：平板菌落數(shù)越多，結(jié)果越具有代表性；（不考慮稀釋倍數(shù)和培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)狀況等）取樣量越大，結(jié)果越具有代表性；（同等取樣條件、排除其他方面的干擾因素）計(jì)算范例12500024727102 . 254410)21 . 0(2353324423222dnnCN)

11、1.0(21計(jì)算范例22400024238101 . 250910)11 . 0(23324423222dnnCN)1.0(21，而本例中，1n2n211.3、若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均300，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可以記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。即：所有平板菌落數(shù)均300，則計(jì)最高稀釋度平板的菌落數(shù)1.4、若所有稀釋度平板菌落數(shù)均30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。即：所有平板菌落數(shù)均30 ，則計(jì)最低稀釋度平板的菌落數(shù)1.5、若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長(zhǎng)，則以1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。 即：樣品原液和所有稀釋度平板均

12、無菌生長(zhǎng)，以300或300，有些30，則以最接近30300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。五菌落總數(shù)的報(bào)告方法 1、菌落數(shù)在 100CFU時(shí)，按四舍五入原則修約，以整數(shù)報(bào)告。2、菌落數(shù) 100CFU時(shí)，第3位數(shù)字按四舍五入修約后，取前面兩位有效數(shù)字，后面用0代替位數(shù)，也可用10的指數(shù)形式來表示，按四舍五入原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。3、若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。 4、 若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢測(cè)結(jié)果無效。 5、稱重取樣以CFU/g 為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL 為單位報(bào)告。 記錄方式樣品樣品稀釋液及稀釋液及菌落數(shù)菌落數(shù)選擇稀選擇稀釋度釋度報(bào)告報(bào)告(CFU/

13、g,ml)10-210-310-4樣品樣品名稱名稱原始原始數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算公式計(jì)算公式報(bào)告報(bào)告平均平均 報(bào)告方式編號(hào)編號(hào)菌落總數(shù)菌落總數(shù)報(bào)告方式報(bào)告方式單位單位195.596CFU/g,或或CFU/ml（CFU大寫）大寫）216801700或1.7*1033均為蔓延菌落無均為蔓延菌落無法計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)報(bào)告報(bào)告“蔓延菌落蔓延菌落”4空白對(duì)照有菌空白對(duì)照有菌結(jié)果無效結(jié)果無效六、注意事項(xiàng) 1、無菌操作 操作中必須有“無菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的。所用剪刀、鑷子等器具也必須進(jìn)行消毒處理。樣品如果有包裝，應(yīng)用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。操作應(yīng)當(dāng)在超凈工作臺(tái)或經(jīng)過消毒處理的無菌室進(jìn)行。 2

14、、采樣的代表性 如系固體樣品，取樣時(shí)不應(yīng)集中一點(diǎn)，宜多采幾個(gè)部位。固體樣品必須經(jīng)過均質(zhì)或研磨，液體樣品須經(jīng)過振搖，以獲得均勻稀釋液。 3、稀釋液 樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水，或磷酸鹽緩沖液，后者對(duì)食品已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。如對(duì)含鹽量較高的食品（如醬油）進(jìn)行稀釋，可以采用滅菌蒸餾水。 4 檢樣稀釋：4.1檢樣稀釋時(shí)，應(yīng)以無菌操作稱取或量取有代表性在樣品25g（25mL）置225mL滅菌稀釋液中。固體樣品應(yīng)剪碎，以拍打式樣品處理器做成樣品懸液（1：10）。4.2根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)樣品污染情況的估計(jì)，再進(jìn)行10倍遞增稀釋。注意每遞增稀釋一次，必須另?yè)Q1支吸管，以保證樣品稀釋倍數(shù)的準(zhǔn)

15、確性。4.3從吸管筒內(nèi)取出滅菌吸管時(shí)，注意不要將管尖碰到手或其他沾污物可能觸及的部位。（如玻璃瓶口、試管品、仍留在容器內(nèi)的吸管的外露部分）。4.4進(jìn)行稀釋時(shí)應(yīng)注意取樣的準(zhǔn)確性。（如：吸入液體時(shí)應(yīng)先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端離開液面，將液體放至所需刻度。放液體時(shí)，不要讓吸管接觸稀釋液的液面，可沿管壁放入，避免吸管外粘附的食品殘?jiān)M(jìn)入稀釋液體中）。 5培養(yǎng)基傾注的溫度與厚度培養(yǎng)基傾注的溫度與厚度是實(shí)驗(yàn)正確與否的關(guān)鍵。a傾注的溫度：461左右（水浴內(nèi)保溫），溫度過高會(huì)造成已受損傷的菌細(xì)胞死亡，影響細(xì)菌生長(zhǎng)，過低瓊脂易于凝固而不能與菌液充分混勻。如無水浴，應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜。b傾注的厚度：

16、直徑9cm的平皿一般要求1520mL培養(yǎng)基，一般以15ml較為適宜。平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。若培養(yǎng)基太薄，在培養(yǎng)過程中還可能因水分蒸發(fā)而影響細(xì)菌的生長(zhǎng)。傾注時(shí)，培基底部如有沉淀物，應(yīng)將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計(jì)數(shù)觀察。6、為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻，可正反兩個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過20min，以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。 7、培養(yǎng)溫度一般為37（水產(chǎn)品的培養(yǎng)溫度，由于其生活環(huán)境水溫較低，故多采用30）。培養(yǎng)時(shí)間一般為48h，有些方法只要求24h的培養(yǎng)即可計(jì)數(shù)。培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)基失重不應(yīng)超過15。 8、為了避免食品中的微小顆?；蚺嗷械碾s質(zhì)與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時(shí)作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4環(huán)境中放置，以便計(jì)數(shù)時(shí)作對(duì)照觀察。9、培養(yǎng)條件一般樣品361/48h2h。水產(chǎn)品（指原生態(tài)、未加工水產(chǎn)品）301/72h3h10、必須做空白對(duì)照：檢測(cè)培養(yǎng)基、平皿、稀釋液的無菌程度。同時(shí)應(yīng)在工作臺(tái)內(nèi)打開一塊空白PCA（其暴露時(shí)間應(yīng)于檢樣時(shí)間