ILK在cGVHD狼瘡樣小鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用

1、ILK在cGVHD狼瘡樣小鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用         08-11-21 15:47:00     作者：黃霞，王美美    編輯：studa20【摘要】  目的 觀察整合素連接激酶（ILK）在慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼瘡樣小鼠腎臟中的表達(dá)，探討其在狼瘡腎炎腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用。方法 建立cGVHD狼瘡樣小鼠模型，將小鼠分成正常對(duì)照組(A組)、12周模型組(B組) 和16周模型組(C組)，每組

2、6只。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法、western blot、免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)ILK 、E-鈣粘蛋白和-平滑肌肌動(dòng)蛋白（-SMA）mRNA和蛋白在腎組織中的表達(dá)。結(jié)果 RT-PCR和western blot方法分別檢測(cè)到B、C兩組小鼠腎組織ILK、-SMA mRNA和蛋白表達(dá)較A組升高(P均0.01)， E-鈣粘蛋白表達(dá)降低(P均0.01)。ILK蛋白和mRNA表達(dá)與-SMA表達(dá)呈正相關(guān)（r分別為0.83，0.86，P均0.01），與E-鈣粘蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.84，-0.89，P均0.01）。免疫組化結(jié)果表明，與A組相比，B、C兩組小鼠腎小管及間質(zhì)均可見(jiàn)ILK、

3、-SMA蛋白顯著表達(dá)，而E-鈣粘蛋白的表達(dá)顯著減少。結(jié)論 cGVHD狼瘡樣小鼠腎組織中ILK蛋白及mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，可能通過(guò)介導(dǎo)腎小管上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而參與了狼瘡腎炎腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。 【關(guān)鍵詞】  移植物抗宿主??；狼瘡腎炎；粘蛋白類(lèi)；腎小管；小鼠；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)Abstract:  Objective  To determine the expression of integrin-linked kinase (ILK) in renal tissue of mice with chronic graft versus host disease (cGVHD

4、) lupus nephritis and its relationship with the epithelial-mesenchymal transition.  Methods  cGVHD lupus nephritis mice models were conducted. All the mice were divided into three groups: group A (control group, n=6), group B (12-week model group, n=6) and group C (16-week model group, n=6

5、).  The mice were killed twelve weeks later (group B) or sixteen weeks later (group C), respectively. The protein and mRNA expressions of ILK, alpha-SMA and E-Cadherin in kidney were detected by using immunohistochemistry, western blot and RT-PCR, respectively.  Results  The  pro

6、tein and mRNA expression of E-cadherin were significantly down-regulated (P<0.01) in group B and group C compared with group A, while expressions of ILK and  alpha-SMA were up-regulated, respectively (P<0.01). The protein and mRNA expressions of ILK were positively correlated with alpha-S

7、MA (r=0.83, and 0.86, all P<0.01), but  adversely associated with E-cadherin (r=-0.84, and -0.89, all P<0.01).  Conclusion  The elevating expression of ILK may play an important role in the process of lupus nephritis through mediating the epithelial-mesenchymal transition.  

8、;   Key words:  graft versus host disease; lupus nephritis; mucins; kidney tubules; mice; animal experimentation狼瘡腎炎（lupus nephritis，LN）是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus， SLE）最常見(jiàn)臨床表現(xiàn)之一，其病理改變具有多樣性及不均一性，以腎小球、腎血管、腎間質(zhì)的損害為主要特征，后期可發(fā)展為腎小球硬化、纖維性新月體、間質(zhì)纖維化及其腎小管萎縮等。與其他慢性腎臟疾病一樣，腎臟纖維化是各型LN進(jìn)展到終

9、末期的必經(jīng)階段。腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，近年來(lái)一些研究提示整合素連接激酶（integrinlinked kinase，ILK）可能是介導(dǎo)EMT的關(guān)鍵因子1，但是在LN中EMT的形成以及ILK與EMT關(guān)系的研究報(bào)道尚少。我們以慢性移植物抗宿主?。╟hronic graft versus  host disease，cGVHD）狼瘡樣小鼠為模型，觀察不同時(shí)期ILK、E-鈣粘蛋白和-平滑肌肌動(dòng)蛋白(-SMA)在腎組織中的表達(dá)，并探討ILK在狼瘡腎炎腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用

10、。1  材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  810周齡（C57BL/6J×DBA/2）F1代雜交雌性小鼠（以下稱(chēng)F1代鼠）及46周齡DBA/2雌性小鼠購(gòu)自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心，體重（19.99±1.99）g，SPF級(jí)。1.2  模型的建立與分組  按隨機(jī)設(shè)計(jì)原則將F1代鼠分為正常對(duì)照組（A組）、12周模型組（B組）及16周模型組（C組），每組6只小鼠。建立cGVHD狼瘡樣小鼠模型。取DBA/2小鼠脾臟、胸腺、淋巴結(jié)細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液（約60%脾細(xì)胞、30%胸腺細(xì)胞及10%淋巴結(jié)細(xì)胞）。分別于第0、3、7、10天注射于模型組F1

11、代鼠，每次注射給予細(xì)胞數(shù)約為50×106個(gè)。正常對(duì)照組于相同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)尾靜脈注射與單細(xì)胞懸液等體積的生理鹽水。于首次注射單細(xì)胞懸液之日起，于第12周末處死B組小鼠，于第16周末處死A組和C組小鼠。處死后立即取下腎臟，將腎包膜完全剝離后，一部分保存于-80以備提取總RNA和蛋白質(zhì)，另一部分固定于10%中性福爾馬林溶液中，經(jīng)石蠟包埋后切片進(jìn)行組織病理檢查及免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。1.3  組織病理切片  2m連續(xù)切片，至經(jīng)多聚賴氨酸包被的載玻片上，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水，分別行蘇木素伊紅（hematoxylineosin，HE）染色和Masson染色。1.4  免

12、疫組織化學(xué)  SP法進(jìn)行免疫組化染色。將腎組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，3%過(guò)氧化氫室溫孵育10min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波修復(fù)抗原，10%正常羊血清封閉，37孵育15min，分別滴加兔抗小鼠ILK抗體（150，Upstate公司）、兔抗小鼠E-鈣粘蛋白抗體（1100，Sigma公司）、兔抗小鼠-SMA抗體（1100，Santecruz 公司）4孵育過(guò)夜，再依次加入生物素偶聯(lián)的羊抗兔IgG抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素，各37孵育15min 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，顯微鏡下控制顯色，HE復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片鏡檢。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照

13、。1.5  western blot  取80保存的腎組織5080mg，加適量裂解液后勻漿，冰中靜置30min，離心，取上清，測(cè)蛋白濃度，加蛋白上樣緩沖液，煮沸4min，瞬時(shí)高速離心，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)膜情況，TBST洗膜，5BSA封閉，分別加入兔抗小鼠ILK抗體，兔抗小鼠E-鈣粘蛋白抗體、兔抗小鼠-SMA抗體、兔抗小鼠，室溫孵育1.5h，TBST洗膜，化學(xué)發(fā)光顯示結(jié)果。圖片掃描保存后用Totallab 2.01分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值數(shù)字化。以GAPDH為內(nèi)參，用目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參灰度值的比值代表目

14、的蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。1.6  逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)表  引物序列（略）PCR反應(yīng)體系5×PCR緩沖液10l，MgCl2(25mmol/L) 4l，dNTPs(10 mmol/L)1l，上下游引物各1l（10mol/L），cDNA模版1l，TaqDNA聚合酶（5U/l ）(TAKARA公司)0.25l，補(bǔ)足雙蒸水至50l。97預(yù)變性后，94變性30s，59退火50s，72延伸1min為一個(gè)循環(huán)，共38個(gè)循環(huán)后，72終末延伸7min。1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  計(jì)量資料采用±s表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間比較采

15、用檢驗(yàn)，兩變量間相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。2  結(jié)果2.1  腎臟病理改變  模型組腎小球系膜區(qū)增寬，基質(zhì)大量增生；小管多灶性萎縮，管腔內(nèi)可見(jiàn)蛋白管型及細(xì)胞管型，B組間質(zhì)大量單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)并有基質(zhì)沉積，C組細(xì)胞數(shù)減少并出現(xiàn)部分腎小管空泡化。Masson染色可見(jiàn)C組小鼠腎小球囊壁，腎小管間質(zhì)有明顯的膠原纖維沉積，B組膠原纖維較C型組少，主要位于腎小管間質(zhì)。A組腎組織未見(jiàn)明顯膠原沉積。2.2  免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果  見(jiàn)圖。ILK在A組腎小球及腎小管上皮細(xì)胞中無(wú)明顯表達(dá)，在B組小鼠腎組織小管及間質(zhì)中表達(dá)增強(qiáng)，而在C組小鼠腎組織中表達(dá)較B組進(jìn)一步增加。

16、E-鈣粘蛋白幾乎表達(dá)于A組所有上皮細(xì)胞中，而在B組、C組小鼠隨著腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，表達(dá)減弱。A組-SMA僅表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞和間質(zhì)少量成纖維細(xì)胞，B組小鼠腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)-SMA的表達(dá)開(kāi)始升高，C組小鼠腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)中-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加。A圖  A組腎小球及腎小管上皮細(xì)胞中無(wú)明顯表達(dá)；（略）           B圖  B組小鼠腎組織小管及間質(zhì)中表達(dá)增強(qiáng)；（略）             C圖