腫瘤細胞凋亡交流2

1、1、 細胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測1 光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡（1） 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。（2） 染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA

2、的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋，終濃度為10 ug/ml。 Hoechst 33258染色 1原理 Hoechst 33258和Hoechst 33342均為非嵌人性熒光染料。它們在活細胞中 DNA聚AT序列富集區(qū)域的小溝處與DNA結(jié)合?；罴毎蚬潭毎蓮牡蜐舛热芤褐?攝取該染料。從而使細胞核著色。故又把此類染料稱為DNA探針。Hoechst 33342和Hoechst 33258均可溶于水并在水溶液中保持穩(wěn)定。Hoechsr-DNA的激發(fā)和發(fā)射波長分別550nm和460n

3、m。在熒光顯微鏡紫外光激發(fā)時，Hoechst-DNA發(fā)出亮藍色熒光。 2溶液的配制 (1)Hoechst 33258儲存液 Hoechst 33258 lmg 001molLPBS(pH 74) 5ml (2)Hoechst 33258工作液(終濃度為05ugml) Hoechst 33258濃縮液 125ul 001molLPBS(pH 74) 50ml 3操作程序 (1)細胞懸液或培養(yǎng)單層細胞等標(biāo)本，用醋酸乙醇或Carnoy固定液固定； (2)001molLPBS漂洗5分鐘； (3)Hoechst 33258工作液染色，室溫15分鐘； (4)001molLPBS漂洗3次，每次5分鐘； (5

4、)用甘油與PBS比例為1：9的混合液或水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。 結(jié)果：該染料為DNA的特異性熒光探針，細胞核呈亮藍色熒光DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為10 ug/ml。結(jié)果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；a期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；b期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體(圖1)。3 透射電子顯微鏡觀察結(jié)果評判：凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。凋亡期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內(nèi)染

5、色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)；a期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體2、 磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為3536KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流

6、式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。方法1 懸浮細胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細胞（0.51×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反應(yīng)5min后，加入400ul Binding Bu

7、ffer，立即用FACScan進行流式細胞術(shù)定量檢測（一般不超過1h）， 同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。2 貼壁培養(yǎng)的細胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細胞。3 爬片細胞染色：同上，最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察。結(jié)果 圖4、圖5注意事項1. 整個操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞。2. 操作時注意避光，反應(yīng)完畢后盡快在一小時內(nèi)檢測。圖4圖53、 線粒體膜勢能的檢測線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位DYmt的下降，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事

8、件，它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodideDiOC6（3）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負性的增高或降低。方法：將正常培養(yǎng)的細胞和誘導(dǎo)凋亡的細胞加入使用終濃度為Rho

9、damine 123（1mM）或終濃度為DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式細胞計檢測細胞的熒光強度。注意事項1 始終保持平衡染液中pH值的一致性，因為pH值的變化將影響膜電位。2 與染料達到平衡的細胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結(jié)合，降低染料的濃度，引起假去極化。 4、 DNA片斷化檢測細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50300kbp長的DNA大片段, 或180200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細胞

10、經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。1. 大分子染色體DNA片段的測定細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50300kbp長的DNA大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時，即達到分辨力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而

11、通過凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此，細胞凋亡早期產(chǎn)生的50300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常采用脈沖電泳技術(shù)可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當(dāng)電場方向改變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動。DNA分子量越大，這種重排所需要的時間就越長。當(dāng)DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時，DNA就可以按其分子量大小分開。參考文獻 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced ap

12、optosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-30392 DNA Ladder 測定方法：收獲細胞（1107）沉淀?細胞裂解液?13000rpm5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，2h?蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h?1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA，4°C過夜?14000rpm15min?最后將沉淀溶解在

13、TE buffer中，加DNA Loading Buffer?1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色并照相。結(jié)果：圖6參考文獻 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-55073 凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析方法：收集細胞?70%冷乙醇（in PBS）4°C固定過夜?PBS洗滌，1000rpm10min?RNase A（0.5mg/ml）37&

14、#176;C消化30min?PI（50mg/ml）染色，室溫避光15min?FACScan分析DNA亞二倍體的形成及細胞周期的變化。結(jié)果：圖84. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)優(yōu)點：敏感度高，適合于檢測少量樣本，小部分凋亡細胞。如臨床活組織檢測8五 TUNEL法細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷

15、酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。5、 Caspase-3活性的

16、檢測 (1 2 3 三種方法同時使用還是一種即可？)（Hoechst-PI 法在流式細胞儀上檢測 VS Caspase 3 法在流式細胞儀兩種方法的差異性）Caspase家族在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。1 Western blot 分析

17、Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶poly（ADP-ribose）polymerase，PARP等的裂解。方法：收集細胞PBS洗滌抽提細胞裂解液蛋白定量SDS-PAGE電泳硝酸纖維素膜或PVDF膜轉(zhuǎn)移5%脫脂奶粉封閉，室溫1.52h或4°C過夜Caspase-3多抗或單抗室溫反應(yīng)12h或4°C過夜TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，510min/次HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG或AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫反應(yīng)12h TBS-T洗3次， 510min/次?ECL顯影或NBT/BCIP顯色。結(jié)果：圖

18、9-1、圖9-22 熒光分光光度計分析原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一特點，設(shè)計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯(lián)時，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。方法：收獲細胞正?；虻蛲黾毎?PBS洗滌?制備細胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）?37°C反應(yīng)1h?熒光分光光度計（Polarstar）分析熒光強度（激發(fā)光波長380n

19、m，發(fā)射光波長為430-460nm）。結(jié)果：圖103 流式細胞術(shù)分析方法：收獲細胞正?；虻蛲黾毎?PBS洗滌?加Ac-DEVD-AMC?37°C反應(yīng)1h?UV流式細胞計分析caspase-3陽性細胞數(shù)和平均熒光強度。結(jié)果：圖11圖92圖10圖116、 凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析TFAR19（PDCD5）是由本研究室在國際上首先報導(dǎo)的一個擁有自己知識產(chǎn)權(quán)的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素（FITC）標(biāo)記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現(xiàn)

20、快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，伴隨著細胞核形態(tài)學(xué)的變化，持續(xù)較長時間，在凋亡小體中仍然可見。同時我們發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義，不同細胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達和核轉(zhuǎn)位。這為研究細胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提供了一種新的技術(shù)和指標(biāo)。（一）TFAR19蛋白的細胞定位分析材料試劑：FITC標(biāo)記的單克隆抗體，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2%

21、 Tween 20），胎牛血清，熒光細胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip頭，移液器。儀器：低溫水平離心機, 37°C水浴箱，熒光顯微鏡，共聚焦激光掃描顯微鏡，流式細胞計方法：1 懸浮細胞的染色：（1）收獲正常和誘導(dǎo)凋亡的細胞（0.51106），PBS洗2次，1000rpm10min。（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm10min。（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm10min。（4）加入200ml胎牛血清，室溫反應(yīng)30min。（5）加入5m

22、l FITC標(biāo)記的TFAR19單抗（終濃度為1：40），4°C反應(yīng)30min（6）熒光細胞洗液洗2次，1000rpm10min。結(jié)果觀察：將細胞沉淀滴片，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細胞中的定位。同時用流式細胞計定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強度。圖122：貼壁細胞的原位染色（1） 貼壁生長的對數(shù)期細胞鋪在24孔或6孔板中（內(nèi)有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長，待長到50%80%滿時，凋亡誘導(dǎo)劑處理細胞。（2） 將不同時間點處理的細胞進行免疫熒光染色，染色步驟同上。（3） 將染色的爬片細胞放于一張滴有少量甘油（5ml）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察

23、TFAR19在細胞中的定位。結(jié)果觀察：圖133：臨床病理切片的染色、檢測。4：原代細胞的培養(yǎng)、檢測。5：分析TFAR19蛋白在人體內(nèi)各組織器官的分布及定位（二）TFAR19蛋白的表達與臨床疾病1 ELISA法檢測正常人和疾病狀態(tài)下，以及疾病的不同時期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平。材料和試劑：1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸鹽Buffer2. 洗滌液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 203. 封閉液： 3%BSA（用洗滌液配制）4. 酶標(biāo)抗體的稀釋：用封閉液稀釋5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g檸檬酸 0.51gDDW 100ml6. 顯色液（現(xiàn)配現(xiàn)用）：底物Buffer 10mlOPD 2mg30% H2O2 2ml7. 終止液 2Mol/L H2SO48. 重組人TFAR19, HRP標(biāo)記的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISAReader（OD490nm），洗板機操作步驟1. 用包被Buffer稀釋的重組人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well,