高級(jí)生化復(fù)習(xí)題之蛋白質(zhì)部分

1、第二部分：蛋白質(zhì) -橄欖枝第一章 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及研究技術(shù)1. 氨基酸的分類按R 基團(tuán)的極性分類a. 具有非極性或疏水R基團(tuán)的氨基酸8種，丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸/蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、纈氨酸b. 具有極性不帶電荷R基團(tuán)的氨基酸7種，絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、酪氨酸c. R基團(tuán)帶負(fù)電荷的氨基酸(酸性氨基酸)2種（pH高于3時(shí)帶負(fù)電荷），天冬氨酸、谷氨酸d. R基團(tuán)帶正電荷的氨基酸(堿性氨基酸)3種（在生理pH時(shí)帶正電荷），精氨酸(胍基)、組氨酸(咪唑基)、賴氨酸(-氨基)第21、22種氨基酸 硒代半胱氨酸、吡咯賴氨酸2. 概念：蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)

2、構(gòu)、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)的超二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域、三級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)：指氨基酸在肽鏈中的排列順序。注意：蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)結(jié)構(gòu)的區(qū)別：蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)包括肽鏈的數(shù)目、末端氨基酸殘基組成、氨基酸排列順序及二硫鍵位置等內(nèi)容。二級(jí)結(jié)構(gòu)：指多肽鏈主鏈有規(guī)律的折疊和盤繞，是多肽鏈主鏈局部的空間排列。維系二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力是氫鍵。主要包括-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲等類型。超二級(jí)結(jié)構(gòu)：在各種作用力的平衡下，若干相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的，在空間上可辨認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體，充當(dāng)三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)件，稱為超二級(jí)結(jié)構(gòu)，也稱模體（motif）。主要包括組合、

3、組合和組合等類型。結(jié)構(gòu)域：對(duì)于較大的蛋白質(zhì)分子，多肽鏈往往形成幾個(gè)緊密的球狀構(gòu)象，這些球狀結(jié)構(gòu)之間以松散的肽鏈相連，這些球狀構(gòu)象被稱為結(jié)構(gòu)域。三級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助各種次級(jí)鍵和二硫鍵，通過(guò)盤繞折疊，形成具有特定肽鏈走向的緊密球狀構(gòu)象，稱為三級(jí)結(jié)構(gòu)。維持三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力：氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、范德華力、二硫鍵。四級(jí)結(jié)構(gòu)：具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的球狀蛋白質(zhì)以非共價(jià)鍵彼此締合，形成一個(gè)高度有序的功能型聚集體，稱為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。其是亞基的非共價(jià)締合。3. 蛋白質(zhì)序列測(cè)定的一般策略蛋白質(zhì)序列測(cè)定的一般步驟：（1）測(cè)序前的準(zhǔn)備工作：包括純化蛋白質(zhì)、測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量、末端氨基酸殘基的分析、確定蛋白質(zhì)的肽鏈數(shù)目或亞基

4、數(shù)目、測(cè)定其氨基酸組成、配基的確定（2）序列測(cè)定：包括用至少兩種不同方法斷裂多肽鏈并分離小肽段、測(cè)定每個(gè)小肽段的序列（3）多肽鏈的結(jié)構(gòu)重建：包括確定完整多肽鏈的序列、確定二硫鍵的位置、酰胺的位置蛋白質(zhì)序列測(cè)定的一般策略：1 測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目2 拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈（寡聚蛋白質(zhì)）3 斷開(kāi)多肽鏈內(nèi)的二硫橋4 分析每一多肽鏈的氨基酸組成5 鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端殘基6 裂解多肽鏈成較小的片段7 測(cè)定各肽段的氨基酸序列8 重建完整多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu) 確定半胱氨酸殘基間形成的S-S交聯(lián)橋的位置4. 列舉出三種測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法。（1） 圓二色性光譜法圓二色性：當(dāng)振幅相等并同步的

5、兩束左、右圓偏振光通過(guò)光活性物質(zhì)時(shí)，由于該物質(zhì)對(duì)這兩束光的吸收不同（對(duì)振幅減少不同），從而使左、右圓偏振光變成了橢圓偏振光，這種光學(xué)效應(yīng)稱為圓二色性。蛋白質(zhì)的圓二色性光譜只與構(gòu)象有關(guān)圓二色性曲線：以摩爾橢圓度或吸光率之差為縱坐標(biāo)，波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)作出的曲線，稱為圓二色性曲線（圓二色性光譜、CD光譜）（2） 紫外差光譜法生色基團(tuán)：分子中能夠在紫外區(qū)吸收光的基團(tuán)稱為生色基團(tuán)；差光譜：發(fā)色團(tuán)的微環(huán)境決定于蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，構(gòu)象改變則微環(huán)境發(fā)生變化，發(fā)色團(tuán)的紫外吸收光譜也將隨之變化，包括吸收峰的位置、強(qiáng)度和譜形狀等。變化前后兩個(gè)光譜之差稱差光譜。一般來(lái)說(shuō)，環(huán)境極性增大，引起吸收峰向短波長(zhǎng)方向移動(dòng)，稱為藍(lán)移

6、。環(huán)境極性減小，引起吸收峰向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)，稱為紅移。測(cè)定：雙光束紫外分光光度計(jì)兩個(gè)濃度相同只是條件（pH、溶劑、離子濃度或溫度）不同的蛋白質(zhì)樣品分別裝在參考杯和試驗(yàn)杯中。種類：溶劑微擾差光譜、pH差光譜、變性差光譜（3） 熒光光譜法測(cè)定：測(cè)定蛋白質(zhì)分子的自身熒光。向蛋白質(zhì)分子的特殊部位引入熒光探測(cè)劑，然后測(cè)定熒光探測(cè)劑的熒光。蛋白質(zhì)中能發(fā)射熒光的氨基酸殘基：Trp（色氨酸）、Tyr（酪氨酸）、Phe（苯丙氨酸）（4） 激光拉曼光譜法（5） 氫同位素交換法5. 比較X-衍射法和核磁共振法測(cè)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的優(yōu)缺點(diǎn)。X-射線晶體衍射的優(yōu)越性：技術(shù)比較成熟 能夠達(dá)到非常高的分辨率, 1埃 占已知結(jié)

7、構(gòu)的80%以上,目前所有重要的蛋白幾乎都是X射線方法解出的 幾乎沒(méi)有分子量的限制, 200萬(wàn)以上 晶體含約40%-60%水,基本上可視為自然狀態(tài)下的結(jié)構(gòu),如酶晶體有活力 收集數(shù)據(jù)快,可以全自動(dòng)化 可以長(zhǎng)出膜蛋白晶體核磁共振（NMR）在生物大分子上應(yīng)用優(yōu)越性： 不需要結(jié)晶； 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測(cè)定,原子分辨率下的結(jié)構(gòu)與功能研究； 動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu):溶液中,研究分子柔性與運(yùn)動(dòng)性及其它分子相互作用,測(cè)出一系列比較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)； 復(fù)合物結(jié)構(gòu)測(cè)定,分子識(shí)別； 膜蛋白結(jié)構(gòu),已成功地用于菌視紫質(zhì)及有機(jī)溶劑中細(xì)菌F1F0ATP酶的F0膜功能區(qū)的C單元的結(jié)構(gòu)解析。核磁共振（NMR）的缺點(diǎn)：必須同位素標(biāo)記；數(shù)據(jù)處理復(fù)雜；目前最

8、大MW 30KD, 260個(gè)殘基；要求蛋白沒(méi)有聚合，而且折疊良好，蛋白濃度高，量大，比較穩(wěn)定；沒(méi)有X-線衍射的分辨率高, 核磁譜儀非常昂貴。第二章 蛋白質(zhì)制備原理和研究技術(shù) 1.根據(jù)分子量大小分離蛋白質(zhì)的方法及原理聚丙烯酰胺凝膠電泳原理（1） 不連續(xù)體系 上、下兩層凝膠孔徑不同；緩沖液離子組成和pH值不同；pH值不連續(xù)形成不連續(xù)的電位梯度（2） 三種效應(yīng) 電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過(guò)程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種：化學(xué)聚合法和光聚合法。化學(xué)聚合以過(guò)硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過(guò)程

9、中，TEMED催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：SDS：陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑：如巰基乙醇，二硫蘇糖醇（DTT)，能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。SDS強(qiáng)還原劑：?jiǎn)误w蛋白質(zhì)或亞基的多肽鏈處于展開(kāi)狀態(tài)， SDS以其烴鏈與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈結(jié)合成復(fù)合體。一定條件下，SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為1.4g SDS/1g蛋白質(zhì)，相當(dāng)于每?jī)蓚€(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)SDS分子。2.根據(jù)蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)不同

10、分離的方法及原理等電聚焦電泳：基本原理：利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電點(diǎn)不同，在一個(gè)穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH梯度中進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離和分析。根據(jù)建立pH梯度原理的不同，可分為：（1）載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦：在電泳支持介質(zhì)中加入載體兩性電解質(zhì)，通過(guò)直流電壓在正負(fù)極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)和線性的pH梯度。蛋白質(zhì)在pH梯度凝膠中受電場(chǎng)力作用下泳動(dòng)，它的分離僅僅決定于其本身的等電點(diǎn)，是一個(gè)“穩(wěn)態(tài)”過(guò)程。蛋白質(zhì)分子一旦到達(dá)它的等電點(diǎn)位置，分子所帶凈電核為零，就不能再遷移。因此蛋白質(zhì)在與其本身pI相等的pH位臵被聚焦成窄而穩(wěn)的區(qū)帶。這種效應(yīng)稱之為“聚焦效應(yīng)”，它保證了蛋白質(zhì)分離的高分辨率。（2）固

11、相pH梯度等電聚焦：利用一系列具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物滴定時(shí)，在滴定終點(diǎn)附近形成pH梯度并參與丙烯酰胺的共價(jià)聚合，從而形成固定的、不隨環(huán)境電場(chǎng)等條件變化的pH梯度。雙向電泳：雙向電泳大都指第一向?yàn)榈入娋劢梗诙驗(yàn)樘荻萐DS電泳。樣品經(jīng)過(guò)電荷和質(zhì)量?jī)纱畏蛛x后，可以得到分子的等電點(diǎn)、分子量等信息。分離的結(jié)果不是帶，而是點(diǎn)。3.親和層析純化帶有組氨酸標(biāo)簽（或GST標(biāo)簽）重組蛋白的原理和方法金屬螯合層析：利用固定相偶聯(lián)的配基亞胺基二乙酸（IDA)與二價(jià)金屬離子發(fā)生螯合作用，該金屬離子又與蛋白質(zhì)分子中的某些含有巰基或咪唑基的氨基酸結(jié)合。利用這種特性進(jìn)行層析分離的方法，稱為金屬螯合層析。金屬螯

12、合層析用途很廣，尤其是分離某些重組蛋白的末端帶有組氨酸標(biāo)簽的生物大分子極為有利。利用His Tag標(biāo)簽進(jìn)行親和層析：a. 構(gòu)建表達(dá)載體，使目的基因帶上His Tag標(biāo)簽b. 表達(dá)帶有His Tag標(biāo)簽的目的蛋白c. 用Ni Sepharose HP（GE Healthcare ）等介質(zhì)親和純化目標(biāo)蛋白4.測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法和原理5.鹽溶和鹽析的概念及原因鹽溶：低濃度時(shí)中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象稱為鹽溶(salting in)。鹽析：當(dāng)溶液的離子強(qiáng)度增加到足夠高，例如飽和或半飽和的程度，很多蛋白質(zhì)可以從水溶液中沉淀出來(lái)，這種現(xiàn)象稱為鹽析(salting out)。鹽溶的原因：低濃度

13、鹽存在時(shí)，蛋白質(zhì)分子吸附少量相反電荷的鹽離子后，雙電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)與水分子之間的相互作用卻加強(qiáng)，因此增加了蛋白質(zhì)的溶解性。鹽析的原因：水的活度降低（1）原來(lái)溶液中大部分甚至全部的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水；（2）原來(lái)被迫與蛋白質(zhì)表面的疏水基團(tuán)接觸的水分子被移去溶劑化鹽離子，疏水基團(tuán)被暴露，疏水相互作用使蛋白質(zhì)聚集而沉淀。6.親和層析的概念及一般程序親和層析概念：利用生物大分子的生物學(xué)特異性，即生物分子與其配體之間所具有的專一性親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。一般程序：1. 選擇被分離蛋白質(zhì)的配體（關(guān)鍵），將配體以適當(dāng)?shù)男问竭B接到支持物上（如瓊脂糖）。2. 將支持物配體絡(luò)合物以適當(dāng)?shù)木?/p>

14、沖夜裝在柱中。3. 蛋白質(zhì)混合物上到柱頂部。大多數(shù)蛋白質(zhì)徑直通過(guò)柱，能與配體相互作用的蛋白質(zhì)被阻留或被固定在柱上。4. 洗柱，除去不需要的蛋白質(zhì)。5. 用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑽皆谥系牡鞍踪|(zhì)洗下來(lái)。第三章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 1.牛胰核糖核酸酶A的變性和復(fù)性過(guò)程;牛胰核糖核酸酶A經(jīng)尿素和巰基乙醇處理由天然、有活性的狀態(tài)變?yōu)槿フ郫B狀態(tài)，二硫鍵被還原，失去活性；再經(jīng)除去尿素和巰基乙醇，又恢復(fù)天然構(gòu)象，二硫鍵重新形成，活性恢復(fù)。2.肌紅蛋白、血紅蛋白在進(jìn)化中形成的多肽微環(huán)境作用;（1）固定血紅素基；（2）保護(hù)血紅素鐵免遭氧化；（3）為氧氣分子提供一個(gè)合適的結(jié)合部位。3. 分析血紅蛋白與肌紅蛋白的氧結(jié)合曲線

15、對(duì)于肌紅蛋白得到的是一條雙曲線；而對(duì)于血紅蛋白得到的是一條S型曲線。一個(gè)肌紅蛋白分子只能結(jié)合一分子氧，而血紅蛋白卻可以結(jié)合四分子氧，所以描述氧結(jié)合血紅蛋白的方程比肌紅蛋白就更復(fù)雜。S型曲線表明當(dāng)?shù)谝粋€(gè)分子氧結(jié)合血紅蛋白時(shí)并不有利，可是一旦發(fā)生結(jié)合，就使得其它的氧分子更容易與余下的3個(gè)血紅素結(jié)合。4. 別構(gòu)效應(yīng)的概念大多數(shù)寡聚蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)它們的生物活性都是借助于亞基相互作用。多亞基蛋白質(zhì)一般具有多個(gè)結(jié)合部位，結(jié)合在蛋白質(zhì)分子的特定部位上的配體對(duì)該分子的其它部位所產(chǎn)生的影響（如改變親和力或催化能力）稱為別構(gòu)效應(yīng)。5. Bohr效應(yīng)的概念及生理學(xué)意義Bohr效應(yīng)的概念：增加CO2濃度（降低pH），能降

16、低Hb對(duì)氧的親和力，促進(jìn)氧從Hb的釋放，這種現(xiàn)象稱為Bohr效應(yīng)。Bohr效應(yīng)的生理意義：當(dāng)血液流經(jīng)組織特別是代謝迅速的肌肉時(shí)，由于這里pH較低，CO2 濃度較高，因此有利于血紅蛋白釋放O2，使組織比單純的pO2降低獲得更多的氧，而氧的釋放又促使Hb與H+和CO2的結(jié)合，以補(bǔ)償由于組織呼吸作用形成的CO2所引起的pH降低，起著緩沖血液pH的作用。當(dāng)血液流經(jīng)肺部時(shí)，由于肺pO2高，有利于Hb與O2結(jié)合并因此促進(jìn)H+和CO2的釋放，同時(shí)CO2的呼出有利于氧合血紅蛋白的生成。6. 鐮刀形細(xì)胞貧血病的分子機(jī)理正常的血紅蛋白是由兩條鏈和兩條鏈構(gòu)成的四聚體，其中每條肽鏈都以非共價(jià)鍵與一個(gè)血紅素相連接。鏈由

17、141個(gè)氨基酸組成，鏈由146個(gè)氨基酸組成。鐮刀型細(xì)胞貧血癥患者的血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)與正常人的血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)不同。其基因發(fā)生單一堿基突變，正常基因第6個(gè)密碼子為GAG，編譯谷氨酸突變后變?yōu)镚TG編譯纈氨酸，這種單個(gè)氨基酸的替代影響了血紅蛋白的正常合成，使其形態(tài)和性質(zhì)發(fā)生了變化，導(dǎo)致鐮刀型貧血癥。7. 抗原、半抗原、抗體的概念抗原：能引起免疫反應(yīng)的任何分子或病原體稱為抗原(antigen)半抗原：本身無(wú)抗原性，與載體蛋白結(jié)合后有了抗原性的物質(zhì)稱為半抗原(hepten)抗體（免疫球蛋白）：是動(dòng)物為反應(yīng)外來(lái)物質(zhì)的出現(xiàn)而合成的一種球蛋白。能與外來(lái)物質(zhì)專一地結(jié)合，從而消除外來(lái)物質(zhì)對(duì)機(jī)體的毒害作用。8

18、. 免疫熒光標(biāo)記的原理（一般步驟）a用化學(xué)方法將熒光素(fluorescein)與抗體結(jié)合，但不影響抗原-抗體結(jié)合的活性；b用熒光抗體處理固定過(guò)的標(biāo)本，在熒光顯微鏡下觀察熒光的出現(xiàn)，可用以鑒定標(biāo)本中的抗原，并進(jìn)行抗原的定位。c用高密度顆粒，如鐵蛋白，膠體金與抗體偶聯(lián)，然后利用電鏡觀察對(duì)結(jié)合部位進(jìn)行高分辨率觀測(cè)。9. 酶聯(lián)免疫的應(yīng)用酶聯(lián)免疫操作步驟（抗抗型）：a待測(cè)樣品中的蛋白質(zhì)吸附到惰性表面，通常使用96#的聚苯乙烯塑料板。b表面加非特異性蛋白質(zhì)溫育，封閉未被蛋白質(zhì)覆蓋的部位。c用含抗待測(cè)蛋白質(zhì)的抗體（一抗）溶液處理。d洗去未結(jié)合的抗體并與二抗溫育。與二抗共價(jià)連接的酶可催化無(wú)色或無(wú)熒光底物變成

19、有色或熒光產(chǎn)物。e通過(guò)測(cè)量顏色和熒光的密度來(lái)確定樣品中抗原的含量。酶聯(lián)免疫的應(yīng)用a定量生物樣品中相應(yīng)抗原的數(shù)量；b易于檢測(cè)，可以定量少于10-9g的專一抗原蛋白。10. 免疫印跡(Western blotting)的原理及一般步驟原理：將混合抗原樣品在凝膠板上進(jìn)行單向或雙向電泳分離, 然后取固定化基質(zhì)膜與凝膠相貼。在印跡紙的自然吸附力、電場(chǎng)力或其它外力作用下, 使凝膠中的單一抗原組份轉(zhuǎn)移到印跡紙上, 并且固相化。最后應(yīng)用免疫覆蓋液技術(shù)如免疫同位素探針或免疫酶探針等, 對(duì)抗原固定化基質(zhì)膜進(jìn)行檢測(cè)和分析?；静襟E：免疫印跡法基本上可分為凝膠電泳、轉(zhuǎn)移、封閉、一抗、酶標(biāo)二抗、底物顯色等步驟。第四章

20、蛋白質(zhì)相互作用的研究方法免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） 以抗體和抗原之間的特異結(jié)合為基礎(chǔ)，研究蛋白質(zhì)相互作用； 當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體來(lái)免疫沉淀X，那么與X在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。酵母雙雜交（Yeast Two-hybrid System）原理：酵母的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4，在N端有一個(gè)由147個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合域(DNA binding domain，BD)，C端有一個(gè)由113個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域(transcription activation domai

21、n，AD)。GAL4分子的DNA結(jié)合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。但是，單獨(dú)的DNA結(jié)合域和單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄激活域都不能起作用，兩者只有當(dāng)結(jié)合在一起或者空間上比較接近時(shí)，才能具有完整的轉(zhuǎn)錄激活因子的功能。雙分子熒光互補(bǔ)(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)原理：利用黃色熒光蛋白(YFP)作為報(bào)告基因，將熒光蛋白分割成兩個(gè)不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標(biāo)蛋白連接。如果兩個(gè)目標(biāo)蛋白因?yàn)橄嗷プ饔枚拷?，就使得熒光蛋白的兩個(gè)分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基團(tuán)而發(fā)出熒光。在熒光顯微鏡下，通過(guò)直接觀察熒光變化就能確定兩個(gè)目標(biāo)蛋白質(zhì)是否具有相互作用，并且在最接近活細(xì)胞生理狀態(tài)的條件下觀察到其相互作用發(fā)生的時(shí)間、位置、強(qiáng)弱、所形成蛋白質(zhì)復(fù)合體的穩(wěn)定性，以及細(xì)胞信號(hào)分子對(duì)其相互作用的影響等。噬菌體展示技術(shù)原理：噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時(shí),外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。Pull-down技術(shù)原理：Pull-down技術(shù)是將已帶有標(biāo)記的餌蛋白（如生物素標(biāo)記、