微生物大小與數(shù)量的測定實驗報告

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上 山東大學(xué)實驗報告 2017年11月27日 _ _科 目：微生物學(xué)實驗 題 目：微生物大小與數(shù)量的測定 姓 名：丁志康一、 目的要求1. 學(xué)習(xí)并掌握用測微尺測定微生物大小的方法。2. 增強微生物細胞大小的感性認識。3. 明確血細胞計數(shù)板計數(shù)的原理。 4. 掌握使用血細胞計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。 二、 基本原理一）微生物大小的測定1. 微生物細胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據(jù)之一。微生物大小的測定，需要在顯微鏡下，借助于特殊的測量工具測微尺，包括目鏡測微尺和鏡臺測微尺。2. 鏡臺測微尺是中央部分可有精確等分線的載玻片，一般是將1mm等分為100格每

2、格長0.01mm（即10µm）。鏡臺測微尺并不直接用來測量細胞的大小，而是用于矯正目鏡測微尺每格的相對長度。3. 目鏡測微尺是一塊可放入接目鏡內(nèi)的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻度，有等分為50小格和100小格兩種。測量時，需將其放在接目鏡中的隔板上，用以測量經(jīng)顯微鏡放大后的細胞物象。由于不同顯微鏡或不同的目鏡和物鏡組合放大倍數(shù)不同，目鏡測微尺每小格所代表的實際長度也不一樣。因此，用目鏡測微尺測量微生物大小時，必須先用鏡臺測微尺進行校正，以求出該顯微鏡在一定大放大倍數(shù)的目鏡和物鏡下，目鏡測微尺每小格所代表的相對長度。然后根據(jù)微生物細胞相當(dāng)于目鏡測微尺的格數(shù)，即可計算出細胞的實際大小。

3、4. 球菌用直徑來表示其大小；桿菌則用寬和長的范圍來表示。如金黃色葡萄球菌直徑約為0.8µm，枯草芽孢桿菌大小為0.70.8×23µm。二）微生物數(shù)量的測定1. 微生物數(shù)量的測定有多種方法，本次試驗中使用顯微鏡直接計數(shù)法。顯微鏡直接計數(shù)法是將少量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計菌器)，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內(nèi)外常用的計菌器有：血細胞計數(shù)板、Peteroff-Hauser計菌器以及Hawksley計菌器等，它們都可用于酵母、細菌、霉菌孢子等懸液的計數(shù)，基本原理相同。后兩種計菌器由于蓋上蓋玻片后，總?cè)莘e

4、為0.02mm3，而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02mm，因此可用油浸物鏡對細菌等較小的細胞進行觀察和計數(shù)。（除了用這些計菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細菌學(xué)檢查。)顯微鏡直接計數(shù)法的優(yōu)點是直觀、快速、操作簡單。但此法的缺點是所測得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點，如結(jié)合活菌染色微室培養(yǎng)（短時間）以及加細胞分裂抑制劑等方法來達到只計數(shù)活菌體的目的。本實驗以血球計數(shù)板為例進行顯微鏡直接計數(shù)。2. 用血細胞計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)是一種常用的微生物計數(shù)方法。該計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個平臺

5、；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上3. 各列有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分為九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為lmm，則每一個大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計數(shù)室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)。（本次試驗所用血球計數(shù)板為25個中方格）4. 計數(shù)時，通常數(shù)隨機五個不相鄰中方格的總菌數(shù)

6、，然后求得每個中方格的平均值，再乘上25，就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。5. 設(shè)五個中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，所以對于25個中方格的計數(shù)板，1mL菌液中的總菌數(shù)n=A/5×25×104×B=50000A·B（個）。血球計數(shù)板三、 器材1. 菌種：大腸桿菌7d鞋面培養(yǎng)物，釀酒酵母24h液體合成培養(yǎng)基培養(yǎng)物。2. 儀器或其他用具：目鏡測微尺，鏡臺測微尺，載玻片，蓋玻片，顯微鏡，移液槍，血球計數(shù)板等。四、 操作步驟一）微生物大小的測定1. 裝目鏡測微尺取出右目鏡，把目鏡上的透鏡片旋下，將目鏡測微尺刻度朝下放在目鏡鏡

7、筒內(nèi)的隔板上，然后旋上目鏡透鏡，再將目鏡插入鏡筒內(nèi)。2. 校正目鏡測微尺（1） 放鏡臺測微尺 將鏡臺測微尺刻度面朝上放在顯微鏡載物臺上。（2） 校正 先用低倍鏡觀察，將鏡面測微尺有刻度的部分移至視野中央，調(diào)節(jié)焦距，當(dāng)清晰的看到鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度平行。利用移動器移動鏡臺測微尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，然后分別數(shù)出兩重合線之間鏡臺微尺和目鏡微尺所占的格數(shù)。（3） 計算 由于已知鏡臺測微尺每格長10µm，根據(jù)下列公式即可分別計算處在不同放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每格所代表的長度。目鏡測微尺每格長度（µm）= 用上述方法分別對低倍鏡

8、、高背景和油鏡進行校正，分別測出在低倍鏡、高倍鏡和油鏡下，兩重合線之間兩尺分別所占的格數(shù)，并用上述公式計算出不同倍鏡下目鏡測微尺每格所代表的長度。（觀察時光線不宜過強，否則難以找到鏡臺微尺的刻度；換高倍鏡和油鏡校正時，務(wù)必十分細心，防止接物鏡壓壞鏡臺微尺和損壞鏡頭。）3. 菌體大小的測定目鏡測微尺校正完畢后，取下鏡臺測微尺，換上細菌染色制片。先用低倍鏡和高倍鏡找到菌體后，換油鏡測定大腸桿菌的寬度和長度。測定時，通過轉(zhuǎn)動目鏡微尺和移動載玻片，測出大腸桿菌寬和長所占目鏡測微尺的格數(shù)。最后將所測得的格數(shù)乘以目鏡測微尺（用油鏡時）每格所代表的長度，即為該菌的實際大小。測定酵母菌時，先將酵母菌培養(yǎng)物制成

9、水浸片，然后用高倍鏡測出寬和長各占目鏡微尺的格數(shù)，最后，將測得的格數(shù)乘上目鏡微尺（用高倍鏡時）每格所代表的長度，即為酵母菌的實際大小。通常測定對數(shù)生長期菌體來代表該菌的大??；可選擇有代表性的35個細胞進行測定；細菌的大小需用油鏡測定，以減少誤差。4. 測定完畢 取出目鏡測微尺后將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測微尺和鏡臺測微尺分別用擦鏡紙擦拭干凈，放回盒內(nèi)保存。二）微生物數(shù)量的測定1. 菌懸液制備 以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙骸?鏡檢計數(shù)室 在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進行計數(shù)。3加樣品 將清潔干燥的血細胞計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用換上新槍頭的移液

10、槍移取少量搖勻的釀酒酵母菌懸液，之后由蓋玻片邊緣緩緩注入一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數(shù)室，一般計數(shù)室均能充滿菌液。（取樣時先要搖勻菌液；加樣時計數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。）4顯微鏡計數(shù) 加樣后靜止5min，然后將血細胞計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)。調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強弱適當(dāng)，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易看清楚計數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。5清洗血細胞計數(shù)板 使用完畢后，將血細胞計數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機吹干。之后鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀

11、物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。在計數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計數(shù)。一般樣品稀釋度要求細菌每小格內(nèi)約有510個菌體為宜，酵母菌每小格內(nèi)約有26個菌體為宜。每個計數(shù)室選5個中格(可選4個角和中央的一個中格)中的菌體進行計數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，可按照各人習(xí)慣記或者不記芽體，但要在結(jié)果中注明芽體數(shù)目是否算入。五、 實驗結(jié)果表8.1 目鏡測微尺的校準(zhǔn)結(jié)果物鏡類型放大倍數(shù)物鏡測微尺每格長度目鏡測微尺每格長度410m50m低倍鏡1020m高倍鏡405m油鏡1002m表8.2 大腸桿菌和酵母菌菌體大小的測量結(jié)果大腸桿菌酵母菌123平均觀察方式

12、123平均觀察方式長1.51.51.61.5油鏡直徑7877高倍鏡寬1.01.01.01.0測量結(jié)果1.5×1.0 m測量結(jié)果7 m表8.3 酵母菌數(shù)目的測定結(jié)果各中方格中菌數(shù)五中方格中總菌數(shù)A稀釋倍數(shù)B每毫升菌液中菌數(shù)n12345464542554423255.8×107六、 思考題(1)為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺微尺重新對目鏡測微尺進行校正？答：因為目鏡測微尺每一組的長度都是對應(yīng)一個特定的放大倍數(shù)，在更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡之后，整個顯微鏡所觀測到物體的整體放大倍數(shù)發(fā)生了改變，那么原來的目鏡測微尺的標(biāo)度就不再適用了，需要進行重新標(biāo)定。(2)在不

13、改變目鏡和物鏡測微尺，而改用不同放大倍數(shù)的物鏡來測定同一株細菌的大小時，其測定結(jié)果是否相同？為什么？答：基本相同。因為細菌的大小是由其本身確定的，若使用不同的放大倍數(shù)測定同一株細菌，只要目鏡測微尺的標(biāo)定長度是正確的，那么所測得的結(jié)果就是大體相同的，不過因為不同放大倍數(shù)下讀數(shù)的精確度不同以及讀數(shù)時本身所存在的誤差，可能會導(dǎo)致兩次不同放大倍數(shù)下的測量結(jié)果和精確度有一定的差別。(3)根據(jù)你的體會，說明用血細胞計數(shù)板計數(shù)的誤差主要來自哪些方面?應(yīng)如何盡量減少誤差、力求準(zhǔn)確? 誤差來源：刻度不清晰導(dǎo)致讀數(shù)不準(zhǔn)；濃度安排不合理導(dǎo)致過濃菌體有重疊或者過稀數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確；菌液中混有雜質(zhì)或氣泡導(dǎo)致視野受阻；視野中菌體分布不均勻，讀數(shù)差別大，不準(zhǔn)確等等。解決方案：使用之前用水洗凈并鏡檢確定沒有污物；滴加菌液時從蓋玻片邊緣滴加讓其緩緩滲入；滴加完菌液之后將血球計數(shù)板靜置5min使菌體沉淀；清理血球計數(shù)板時不可使用毛刷或者吸水紙，用沖洗后自然晾干；讀數(shù)時若發(fā)現(xiàn)菌體密度過稀或過濃應(yīng)及時調(diào)整稀釋倍數(shù)重新測量，以菌體數(shù)每小方格2-6個為宜（針對酵母菌來說）。(4)某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請設(shè)