《基因工程基本實(shí)際操作程序》導(dǎo)學(xué)案

1、基因工程基本實(shí)際操作程序?qū)W(xué)案1.1.簡(jiǎn)述基因工程原理及基本操作程序。簡(jiǎn)述基因工程原理及基本操作程序。2.2.明確獲取目的基因的方法。明確獲取目的基因的方法。3.3.掌握將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法。掌握將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法。4.4.掌握目的基因檢測(cè)與鑒定的方法。掌握目的基因檢測(cè)與鑒定的方法。一、目的基因的獲取1.從基因文庫(kù)中獲取所有一部分基因文庫(kù)種類2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因(1)含義:是一項(xiàng)在生物體外 的核酸合成技術(shù)。(2)原理: 。(3)過(guò)程:第一步,加熱至9095 DNA解鏈為 ;第二步,冷卻至 ,引物與兩條單鏈DNA ;第三步,加熱至7075 , 從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合

2、成。(4)特點(diǎn): 形式擴(kuò)增。3.人工合成法:如果基因較小, 又已知,可以通過(guò) 用化學(xué)方法直接人工合成。復(fù)制特定DNA片段結(jié)合DNA雙鏈復(fù)制單鏈核苷酸序列DNA合成儀5560 熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)指數(shù)111.組成:目的基因、 、 、標(biāo)記基因。2.功能:使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以 給下一代;使目的基因能夠 和發(fā)揮作用。3.啟動(dòng)子:位于基因的首端,是 酶識(shí)別和結(jié)合的部位,能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。4.終止子:位于基因的尾端,功能是終止 。5.標(biāo)記基因:鑒別受體細(xì)胞中是否含有 ,從而將符合要求的受體細(xì)胞篩選出來(lái)。終止子遺傳啟動(dòng)子RNA聚合目的基因轉(zhuǎn)錄121415181716表達(dá)

3、13二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 1.基因工程的基本步驟中,哪幾步用到了限制酶?哪幾步涉及堿基的互補(bǔ)配對(duì)?答案：答案： 第一、二步用到了限制酶; 第一、二、四步涉及堿基的互補(bǔ)配對(duì)。 2.啟動(dòng)子與起始密碼子,終止子與終止密碼子有何區(qū)別?答案：答案： 簡(jiǎn)單地說(shuō),啟動(dòng)子和終止子都是一段特殊的DNA序列,屬于基因的非編碼區(qū),分別位于編碼區(qū)的上游和下游,負(fù)責(zé)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。而起始密碼子和終止密碼子都是mRNA上的三聯(lián)體堿基序列,分別決定翻譯的起始和終止。啟動(dòng)子DNA分子上能與RNA聚合酶結(jié)合并形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的區(qū)域。起始密碼子蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中被核糖體識(shí)別并與起始tRNA互補(bǔ)配對(duì)的三個(gè)堿基序列。終止子轉(zhuǎn)錄過(guò)程

4、中能夠終止RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的DNA序列,使RNA合成終止。終止密碼子蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中終止肽鏈合成的信使核糖核酸的三個(gè)堿基序列。知識(shí)點(diǎn)一知識(shí)點(diǎn)一:目的基因的獲取目的基因的獲取 目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。如:與生物抗逆性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)的基因、與毒物降解相關(guān)的基因,以及與工業(yè)所需用酶相關(guān)的基因等。 答案：答案：1.你對(duì)目的基因的概念是怎樣理解的? 基因組文庫(kù)包含某種生物的全部基因,而部分基因文庫(kù)只包含某種生物的部分基因;基因組文庫(kù)中的基因含有外顯子和內(nèi)含子,而部分基因文庫(kù)中的基因沒(méi)有;部分基因文庫(kù)中的基因在物種間可

5、以交流,而基因組文庫(kù)中的基因只有部分可以。2.簡(jiǎn)要說(shuō)明基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)之間的區(qū)別。答案：答案： 3.請(qǐng)列表比較目的基因幾種獲取方法的過(guò)程及優(yōu)缺點(diǎn)?方法基因文庫(kù)的構(gòu)建PCR技術(shù)擴(kuò)增人工合成基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)過(guò)程優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn) 供體細(xì)胞中的DNA限制酶許多DNA片段插入載體導(dǎo)入受體菌群(基因組文庫(kù))外源DNA擴(kuò)增,產(chǎn)生特定性狀分離目的基因蛋白質(zhì)的氨基酸序列推測(cè)mRNA的核苷酸序列推測(cè)結(jié)構(gòu)基因的脫氧核苷酸序列目的基因目的基因DNA單鏈DNA大量目的基因mRNA反轉(zhuǎn)錄單鏈DNA合成雙鏈DNA(cDNA)插入載體導(dǎo)入受體菌群(cDNA文庫(kù))分離目的基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng),

6、可產(chǎn)生自然界中不存在的新基因工作量大,盲目性大,專一性差操作過(guò)程較麻煩,技術(shù)要求高適用范圍狹小相同點(diǎn)原理原料條件不同點(diǎn)解旋方式場(chǎng)所酶結(jié)果4.請(qǐng)比較PCR技術(shù)與DNA復(fù)制的異同點(diǎn),補(bǔ)充完成下表。比較項(xiàng)目PCR技術(shù)DNA復(fù)制在短時(shí)間內(nèi)形成大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子DNA雙鏈復(fù)制(堿基互補(bǔ)配對(duì))四種游離的脫氧核苷酸模板、ATP、酶等解旋酶催化DNA在高溫下變性解旋體外復(fù)制主要在細(xì)胞內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)含有的DNA聚合酶知識(shí)總結(jié)知識(shí)總結(jié) 區(qū)分基因、基因文庫(kù)、目的基因區(qū)分基因、基因文庫(kù)、目的基因1.1.基因是有遺傳效應(yīng)的基因是有遺傳效應(yīng)的DNADNA片段片段, ,是控制性狀的遺傳物質(zhì)的基

7、本結(jié)構(gòu)和功是控制性狀的遺傳物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位能單位, ,基因的脫氧核苷酸序列代表遺傳信息?；虻拿撗鹾塑账嵝蛄写磉z傳信息。2.2.基因文庫(kù)是將含有某種生物不同基因的許多基因文庫(kù)是將含有某種生物不同基因的許多DNADNA片段片段, ,導(dǎo)入受體菌的導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存群體中儲(chǔ)存, ,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因, ,叫作基因叫作基因文庫(kù)。文庫(kù)。3.3.目的基因是基因工程操作中需要的外源基因目的基因是基因工程操作中需要的外源基因, ,它是它是編碼某種蛋白編碼某種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。1.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的是什么?知識(shí)點(diǎn)二知識(shí)點(diǎn)二:基

8、因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建 構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的是使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并可以遺傳給下一代,同時(shí),使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。答案：答案： 2.基因表達(dá)載體由哪些組分組成?各組分起什么作用? (1)基因表達(dá)載體的組分:目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因。(2)各組分的作用:目的基因控制蛋白質(zhì)的合成或起調(diào)控作用;啟動(dòng)子是一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段,位于基因的首端,是mRNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位,有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA;終止子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段,位于基因的尾部,能使轉(zhuǎn)錄在所需的地方停止下來(lái);標(biāo)記基因是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因,從而將含有目的基因

9、的細(xì)胞篩選出來(lái)。答案：答案： 3.基因表達(dá)載體是在何處如何構(gòu)建的?基因表達(dá)載體在體外構(gòu)建,方法如下:答案：答案： 4.將目的基因與載體混合并用DNA連接酶處理后,會(huì)出現(xiàn)幾種結(jié)果?怎樣從中篩選出所需要的重組質(zhì)粒? (1)會(huì)出現(xiàn)三種結(jié)合方式:目的基因與載體結(jié)合;目的基因與目的基因結(jié)合; 載體與載體結(jié)合。 (2)利用質(zhì)粒中含有的一些標(biāo)記基因如抗生素基因等所賦予的重組質(zhì)粒的特性進(jìn)行篩選。答案：答案： 知識(shí)總結(jié)知識(shí)總結(jié)1.1.載體與基因表達(dá)載體的區(qū)別載體與基因表達(dá)載體的區(qū)別: :二者都有標(biāo)記基因二者都有標(biāo)記基因, ,但基因表達(dá)載體在但基因表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。載體

10、基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。2.2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心。基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心。3.3.由于受體細(xì)胞和導(dǎo)入方式存在差異由于受體細(xì)胞和導(dǎo)入方式存在差異, ,所以基因表達(dá)載體的構(gòu)建不能所以基因表達(dá)載體的構(gòu)建不能千篇一律。千篇一律。4.4.用同一種限制酶切割目的基因和載體的目的是為了獲得相同的黏性末用同一種限制酶切割目的基因和載體的目的是為了獲得相同的黏性末端端, ,用不同的限制酶切割目的基因和載體的目的是為了防止自身用不同的限制酶切割目的基因和載體的目的是為了防止自身環(huán)化。環(huán)化。1.轉(zhuǎn)化:目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi),并且在受體細(xì)胞內(nèi) 和表達(dá)的過(guò)程。2.導(dǎo)

11、入植物細(xì)胞的方法: 、基因槍法、 。農(nóng)桿菌特點(diǎn):易感染 植物和 植物;Ti質(zhì)粒上的 可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞,并且整合到受體細(xì)胞 上。3.導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法: 注射技術(shù)。4.導(dǎo)入微生物細(xì)胞的常用處理方法:用 處理受體細(xì)胞,使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),這種細(xì)胞稱為 。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法維持穩(wěn)定裸子染色體的DNAT-DNA19202121242322雙子葉25三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞顯微26感受態(tài)細(xì)胞28Ca2+271.檢測(cè)及方法(1)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了 ,采用DNA分子雜交技術(shù)。(2)檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了 ,采用分子雜交技術(shù)。(3)檢測(cè)目的基因是

12、否翻譯成蛋白質(zhì),采用 雜交技術(shù)。2.鑒定:除了分子檢測(cè)外,還需要進(jìn)行 水平的鑒定,如抗蟲、抗病鑒定等。目的基因個(gè)體生物學(xué)mRNA293031四、目的基因的檢測(cè)與鑒定抗原抗體321.轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)是什么?常見(jiàn)的轉(zhuǎn)化方法有哪些?知識(shí)點(diǎn)三知識(shí)點(diǎn)三:將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)是目的基因整合到受體細(xì)胞染色體基因組中。不同受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法不同,分別如下:答案：答案： 受體細(xì)胞種類方法植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法動(dòng)物細(xì)胞顯微注射法微生物細(xì)胞Ca2+處理法2.早期基因工程操作都用原核生物作為受體細(xì)胞,試分析原核生物作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。 原核生物細(xì)胞具有一些其他生物沒(méi)

13、有的特點(diǎn),如繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少等,因此,早期基因工程操作都用原核生物作為受體細(xì)胞。答案：答案： 3.請(qǐng)歸納總結(jié)各種導(dǎo)入方法的轉(zhuǎn)化過(guò)程。 (1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法:目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞穩(wěn)定維持和表達(dá)。(2)顯微注射法:目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷?受精卵)顯微注射受精卵發(fā)育新性狀動(dòng)物。(3)Ca2+處理法:Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子。答案：答案： 1.為什么要有“目的基因的檢測(cè)與鑒定”這一步驟?知識(shí)點(diǎn)四知識(shí)點(diǎn)四:目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因的檢測(cè)與鑒定 因?yàn)槟康幕蚴欠裾嬲迦胧荏w細(xì)胞的DNA中,是否能夠在受體

14、細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá),只有通過(guò)檢測(cè)、鑒定才能得知。答案：答案： 類型 步驟檢測(cè)內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子檢測(cè)第一步目的基因是否進(jìn)入 是否成功顯示出雜交帶第二步目的基因是否 是否成功顯示出雜交帶第三步目的基因是否 是否成功顯示出雜交帶 鑒定包括抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn),以確定是否有抗性以及抗性的程度;基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性比較,以確定功能是否相同等2.如何進(jìn)行目的基因的檢測(cè)?結(jié)合下表完成檢測(cè)與鑒定內(nèi)容和方法的比較。受體細(xì)胞DNA分子雜交(DNA和DNA之間)轉(zhuǎn)錄出mRNA翻譯出蛋白質(zhì)分子雜交技術(shù)(DNA和mRNA之間)抗原抗體雜交個(gè)體水平知識(shí)總結(jié)知識(shí)總結(jié)外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的理論基礎(chǔ)外源基因

15、在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的理論基礎(chǔ)1.1.基因是控制生物性狀的遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)單位和功能單位?；蚴强刂粕镄誀畹倪z傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)單位和功能單位。2.2.遺傳信息的傳遞和表達(dá)都遵循中心法則的信息流動(dòng)方向。遺傳信息的傳遞和表達(dá)都遵循中心法則的信息流動(dòng)方向。3.3.生物界共用一套遺傳密碼。生物界共用一套遺傳密碼。例例1 1下列關(guān)于基因文庫(kù)的說(shuō)法,錯(cuò)誤的是()。 A.可分為基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù) B.cDNA文庫(kù)屬于部分基因文庫(kù) C.在基因組文庫(kù)構(gòu)建中不需要用到限制酶和DNA連接酶 D.同種生物的cDNA文庫(kù)基因數(shù)量較基因組文庫(kù)基因數(shù)量少C【解析】基因組文庫(kù)構(gòu)建中需用到限制酶和DNA連接酶。技巧歸納技巧歸納1

16、.1.在理解基因文庫(kù)的概念時(shí)一定要明確在理解基因文庫(kù)的概念時(shí)一定要明確: :雖然基因文庫(kù)中含有某種生雖然基因文庫(kù)中含有某種生物的全部基因物的全部基因, ,但基因文庫(kù)不是直接保管某種生物的基因但基因文庫(kù)不是直接保管某種生物的基因, ,而是保管受而是保管受體菌體菌, ,某種生物的基因是在受體菌中得到保管的。某種生物的基因是在受體菌中得到保管的。2.2.由于人工合成的目的基因沒(méi)有非編碼系列由于人工合成的目的基因沒(méi)有非編碼系列, ,故其在與載體重組時(shí)故其在與載體重組時(shí)必須加入啟動(dòng)子和終止子。必須加入啟動(dòng)子和終止子。例例2 2科學(xué)家在培育抗蟲棉時(shí),起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中,然后導(dǎo)入棉

17、花的受精卵中,結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲基因首端),導(dǎo)入棉花受精卵,長(zhǎng)成的棉花植株還是沒(méi)有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端),導(dǎo)入棉花受精卵,結(jié)果長(zhǎng)成的植株有了抗蟲能力。請(qǐng)回答下列問(wèn)題:(1)由以上過(guò)程推知,作為目的基因的載體應(yīng)具備的結(jié)構(gòu)是 。(2)基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程是在(細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外)進(jìn)行的,需要的工具有。啟動(dòng)子具有 的作用。(3)當(dāng)蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因和質(zhì)?；旌虾?在DNA連接酶的作用下會(huì)有幾種結(jié)合方式?分別是什么?目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因細(xì)胞外限制酶和DNA連接酶驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRN

18、A三種結(jié)合方式,即抗蟲基因和載體結(jié)合、抗蟲基因和抗蟲基因結(jié)合、載體和載體結(jié)合(4)請(qǐng)繪出一個(gè)基因表達(dá)載體的模式圖?；虮磉_(dá)載體模式圖如下:【解析】在基因表達(dá)載體構(gòu)建的過(guò)程中需要限制酶切割質(zhì)粒,還需要DNA連接酶連接黏性末端;啟動(dòng)子是RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn),能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。技巧歸納技巧歸納1.1.繪制基因表達(dá)載體模式圖的要點(diǎn)繪制基因表達(dá)載體模式圖的要點(diǎn): :要將模式圖繪制成圓形要將模式圖繪制成圓形, ,因因質(zhì)粒是環(huán)狀的雙鏈質(zhì)粒是環(huán)狀的雙鏈DNADNA分子。要將組成基因表達(dá)載體的各組分都繪制分子。要將組成基因表達(dá)載體的各組分都繪制出出, ,包括復(fù)制原點(diǎn)、啟動(dòng)子、目的基因、終止子、標(biāo)記基因

19、。包括復(fù)制原點(diǎn)、啟動(dòng)子、目的基因、終止子、標(biāo)記基因。2.2.啟動(dòng)子啟動(dòng)子(DNA(DNA片段片段)起始密碼子起始密碼子(RNA),(RNA),終止子終止子(DNA(DNA片段片段)終止密碼終止密碼子子(RNA)(RNA)。3.3.用同一種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒后用同一種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒后, ,產(chǎn)生的黏性末端都相同產(chǎn)生的黏性末端都相同, ,用用DNADNA連接酶連接后連接酶連接后, ,可形成三種兩個(gè)可形成三種兩個(gè)DNADNA片段之間的連接產(chǎn)物片段之間的連接產(chǎn)物, ,不便不便于篩選于篩選, ,故通常用兩種不同的限制酶同時(shí)切割目的基因和質(zhì)粒故通常用兩種不同的限制酶同時(shí)切割目的基因和質(zhì)粒,D

20、NA,DNA連接酶作用后只能形成重組質(zhì)粒連接酶作用后只能形成重組質(zhì)粒, ,便于篩選。便于篩選。例例3 3關(guān)于將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的說(shuō)法中,正確的是()。A.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞采用最多的方法是花粉管通道法B.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞采用最多的方法是顯微注射技術(shù)C.為使大腸桿菌易吸收DNA分子,應(yīng)先用緩沖液進(jìn)行處理D.在顯微注射技術(shù)中,不需先構(gòu)建基因表達(dá)載體B【解析】將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法;為使大腸桿菌易吸收DNA分子,應(yīng)先用氯化鈣溶液進(jìn)行處理,使其成為感受態(tài)細(xì)胞;在顯微注射技術(shù)中,導(dǎo)入受體細(xì)胞的是構(gòu)建好的基因表達(dá)載體。技巧歸納技巧歸納1.1.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞前將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞前, ,都必須進(jìn)行目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建都必須進(jìn)行目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建, ,而不能直接導(dǎo)入目的基因。而不能直接導(dǎo)入目的基因。2.2.轉(zhuǎn)化過(guò)程也是一個(gè)基因重組的過(guò)程。轉(zhuǎn)化過(guò)程也是一個(gè)基因重組的過(guò)程。3.3.將目的基因?qū)雴巫尤~植物不采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。將目的基因?qū)雴巫尤~植物不采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。例例4 4目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后,是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性,只有通過(guò)鑒定和檢測(cè)才能知道。下列屬于目的基因檢測(cè)和鑒定的是()。檢測(cè)受體細(xì)胞是否有目的基