復(fù)習(xí)重組DNA技術(shù)應(yīng)用

1、復(fù)習(xí)重組DNA技術(shù)應(yīng)用v重組重組DNA技術(shù)（技術(shù)（基因工程技術(shù)基因工程技術(shù)） 在體外對不同來源的在體外對不同來源的DNA分子經(jīng)重新組合形分子經(jīng)重新組合形成重組體，并導(dǎo)入宿主細胞建立無性繁殖體系成重組體，并導(dǎo)入宿主細胞建立無性繁殖體系的過程。的過程。v又稱：DNA克隆，分子克隆，或基因工程基因工程?；靖拍罨靖拍顅DNA重組：重組： 不同來源的不同來源的DNA分子，通過磷酸二酯鍵連接分子，通過磷酸二酯鍵連接而重新組合成新的而重新組合成新的DNA分子的過程。分子的過程。v克隆：克?。?指由一個細胞經(jīng)過無性繁殖形成子代群體的指由一個細胞經(jīng)過無性繁殖形成子代群體的過程。過程。第一節(jié)第一節(jié) 工具酶工具

2、酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶DNA聚合酶聚合酶DNA連接酶連接酶工具酶工具酶逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶堿性磷酸酶等堿性磷酸酶等第一節(jié)第一節(jié) 工具酶工具酶v 限制性內(nèi)切酶概念：限制性內(nèi)切酶概念： 一類能夠有選擇的識別雙鏈一類能夠有選擇的識別雙鏈DNA分子中的分子中的特定核苷酸序列，并在識別位點及其周圍切割雙特定核苷酸序列，并在識別位點及其周圍切割雙鏈鏈DNA中磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶。中磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶。 簡稱限制酶，大多從細菌中發(fā)現(xiàn)。簡稱限制酶，大多從細菌中發(fā)現(xiàn)。第一節(jié)第一節(jié) 工具酶工具酶（一）分類（一）分類 限制性內(nèi)切酶分為三種類型限制性內(nèi)切酶分為三種類型 I、 型型 ：不常用：不常用 型：具有高度

3、特異性的型：具有高度特異性的DNA裂解點，裂解點， 是基因工程中最重要的工具酶。是基因工程中最重要的工具酶。CTTAAGGCAATT例：例：EcoRI 酶切位點酶切位點限制性內(nèi)切酶（限制性內(nèi)切酶（ restriction endonuleasesrestriction endonuleases ）：從特殊）：從特殊的酶切位點將的酶切位點將DNADNA分子切開分子切開 5，G AATTC 3， 3，CTTAA G 5， 切口類型：切口類型：例：Hpa I 5，GTT AAC 3， 3，CAA TTG 5，平末端平末端:粘末端粘末端3，突出末端突出末端:5，突出末端突出末端:例：EcoR I 5，

4、G AATTC 3， 3，CTTAA G 5， 例：Pst I5，CTGCA G 3，3，G ACGTC 5，粘性末端：錯開突出的單鏈粘性末端：錯開突出的單鏈末端，很容易與互補的末端，很容易與互補的單鏈單鏈末端末端 配對粘合起來，因此稱為粘性末端配對粘合起來，因此稱為粘性末端 。限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶第一節(jié)第一節(jié) 工具酶工具酶vDNA連接酶連接酶 連接酶（連接酶（ ligase ligase ）：能夠催化雙鏈）：能夠催化雙鏈DNADNA分子中相鄰的分子中相鄰的3 3- -OHOH和和5 5- -P P末端之間形成磷酸二酯鍵末端之間形成磷酸二酯鍵, ,使使DNADNA分子連分子連接起來的酶接起

5、來的酶. . 例如：例如： T4-DNAT4-DNA連接酶連接酶第一節(jié)第一節(jié) 工具酶工具酶逆轉(zhuǎn)錄酶（逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptasereverse transcriptase） 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶 其他工具酶其他工具酶 用于通過用于通過PCRPCR對對DNADNA分子的特定序列進行體外合成擴增分子的特定序列進行體外合成擴增第二節(jié)第二節(jié) 重組重組DNA常用載體常用載體v載體載體 是攜帶目的是攜帶目的DNA片斷進入宿主細胞進行擴增和表達的運載工具，片斷進入宿主細胞進行擴增和表達的運載工具，本質(zhì)是一段核苷酸序列。本質(zhì)是

6、一段核苷酸序列。 載體的條件載體的條件 1. 自我復(fù)制能力 2. 具有多個酶切位點，供外源基因插入 3. 具有合適的篩選標志 4. 分子量不宜過大 第二節(jié)第二節(jié) DNA重組載體重組載體v常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體和病毒載體等。v按用途有克隆載體、表達載體一、質(zhì)粒載體 細菌染色體外具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀細菌染色體外具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。分子。質(zhì)粒載體條件質(zhì)粒載體條件1.具有松弛型復(fù)制子具有松弛型復(fù)制子2.存在數(shù)個限制性酶切位點，存在數(shù)個限制性酶切位點，便于目的便于目的DNA插入插入3.具有篩選標志具有篩選標志4.分子量相對較小分子量相對較小復(fù)制起始復(fù)制起始點點AMP抗性抗性pB

7、R3224363bpTet抗性抗性第三節(jié)第三節(jié) 重組重組DNA的基本步驟的基本步驟v重組重組DNA的基本過程的基本過程 一、目的基因的制備 二、載體的選擇與構(gòu)建 三、目的基因與載體的連接 四、重組DNA導(dǎo)入宿主細胞 五、重組DNA的篩選與鑒定 六、外源基因的表達、分離與純化第三節(jié)第三節(jié) DNA重組與鑒定重組與鑒定一、目的一、目的DNA片斷的制備片斷的制備來源：1 基因組基因組DNA (genomic DNA )2 cDNA (complementary DNA) 制備制備cDNA3人工合成人工合成DNA片段片段 人干擾素、胰島素、腦啡肽、血管緊張素、胸腺素人干擾素、胰島素、腦啡肽、血管緊張素、

8、胸腺素等等4PCR或逆轉(zhuǎn)錄酶或逆轉(zhuǎn)錄酶PCR擴增特定的擴增特定的 DNA片段或片段或cDNAv二、載體的選擇與構(gòu)建 根據(jù)實驗?zāi)康?，選擇合適的載體 質(zhì)粒質(zhì)粒 噬菌體噬菌體三、目的DNA片斷與載體的連接 粘性末端連接法粘性末端連接法 平末端連接法 同聚體加尾連接法 人工合成接頭連接法粘性末端連接效率高于平粘性末端連接效率高于平末端。末端。粘性末端連接載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連目的基因目的基因平末端連接平末端連接 同聚體加尾連接同聚體加尾連接 人工合成接頭連接人工合成接頭連接四、重組DN

9、A導(dǎo)入宿主細胞v 宿主細胞：宿主細胞： 原核細胞（大腸桿菌） 真核細胞(哺乳類動物細胞、酵母和昆蟲細胞)v 方式：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染方式：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染等v 方法：方法： 物理法：電穿孔，顯微注射法 化學(xué)法：CaCl2法，磷酸鈣法 生物法：脂質(zhì)體法 三、重組三、重組DNADNA分子導(dǎo)入宿主細胞分子導(dǎo)入宿主細胞轉(zhuǎn)化-重組DNA分子導(dǎo)入原核細胞轉(zhuǎn)染-重組DNA分子直接導(dǎo)入真核細胞感染-使用噬菌體或病毒將重組DNA分子導(dǎo)入細胞方式：方式：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染五、重組五、重組DNA的篩選與鑒定的篩選與鑒定 （一）根據(jù)載體的遺傳性狀進行篩選（一）根據(jù)載體的遺傳性狀進行篩選 （二）根據(jù)重組（二）根據(jù)重組DNA

10、的結(jié)構(gòu)特征進行篩選的結(jié)構(gòu)特征進行篩選（一）根據(jù)載體的遺傳學(xué)性狀進行篩選（一）根據(jù)載體的遺傳學(xué)性狀進行篩選 1. 抗生素抗性標志篩選抗生素抗性標志篩選 2. 抗性標志插入失活篩選抗性標志插入失活篩選3. -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選切接轉(zhuǎn)增檢 lacZ基因基因(編碼編碼-半乳糖苷酶半乳糖苷酶) X-gal X + gal (半乳糖半乳糖) (蘭色蘭色) X-gal: 5-bromo - 4 - chloro -3-indolyl -galactoside5溴溴- 4氯氯- 3吲哚吲哚 - -半乳糖半乳糖 (無色無色) 蘭色蘭色蘭色無色無色噬菌斑（噬菌斑（plaques）：）：

11、重組重組 蘭色噬菌斑蘭色噬菌斑 未重組未重組 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 常用的方法常用的方法: : 凝膠電泳凝膠電泳 限制性內(nèi)切酶圖譜限制性內(nèi)切酶圖譜 PCRPCR擴增擴增 核酸分子雜交核酸分子雜交 DNADNA序列分析序列分析（二）根據(jù)重組DNA的分子生物學(xué)特征進行鑒定v電泳、酶切分析：初步鑒定電泳、酶切分析：初步鑒定vPCRPCR擴增、分子雜交：比較明確的鑒定擴增、分子雜交：比較明確的鑒定v序列測定：最終鑒定序列測定：最終鑒定 （ 四）重組子的篩選與鑒定載體載體質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNADNA cDNAcDNA人工合成人工合成PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNADNA目的基因目的基因連接連接重組體重組體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染體外包裝，轉(zhuǎn)染重組體進入宿主重組體進入宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交重組重組DNADNA技術(shù)操作的主要步驟技術(shù)操作的主要步驟外源基因的表達外源基因的表達表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)