液相色譜法測(cè)定腦膜炎球菌結(jié)合物原液中殘余二甲亞砜.docxVIP

1、論著液相色譜法測(cè)定腦膜炎球菌結(jié)合物原液中殘余二甲亞硯傅元欣，雒麗紅，馮瀟，馬慶華，魏然(蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，蘭州730046)摘要：目的建立并驗(yàn)證腦膜炎球菌結(jié)合物原液中殘余二甲亞硯的檢測(cè)方法。方法采用液相色譜法，使用Kro.masilC18柱(250mmx4.6mm),25%甲醇溶液為流動(dòng)相,二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定腦膜炎球菌結(jié)合物原液中殘余二甲亞碉。結(jié)果二甲亞硯在l100m#L的范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)廠大于0.999,線性關(guān)系良好，平均回收率為94%114%、變異系數(shù)為0.46%0.89%,最小定量限為l.0mg/L,遠(yuǎn)低于藥典規(guī)定。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便易行,結(jié)果準(zhǔn)確。關(guān)

2、鍵詞:腦膜炎球萌結(jié)合物原液;二甲亞很;高效液相色譜中圖分類號(hào)：0657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1005-5673(2013)04-0031-06DeterminationoftheresidualcontentofDMSOinmeningococcalconjugatesbulkofA,C,YandW135byHPLCFUYuan-xin,LUOLi-hong,FENGXiao,MaQing-hua,WEIRan(hinzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Lld.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineering

3、Research,Lanzhou730046,China)Abstract:ObjectiveToestablishamethodfordeterminationoftheresidualdimethylsulfoxide(DMSO)inmeningococcalconjugatesbulkofA,C,YandW135.MethodsHPLCwasusedinthistest.ThecontentofDMSOwasanalyzedwithKromasilC18column(250mmx4.6mm),themobilephasewas25%methanol,anddiodearraydetect

4、orwasusedasdetector.ResultsAgoodlinercorrelationwasobtainedovertherangeof1-100mg/L,r>0.999.TheaveragerecoveryofDMSOwas94%-114%andtheaverageCVwas0.46%-0.89%.ThemethodcanquantifytheDMSOwithaminimumamountof1.0mg/Lforthesensitivityatleast1()timeshigherthanthatofnoiseassay.Thisconcentrationwasmuchlowe

5、rthanthelimitconcentrationinpharmacopeia.ConclusionsThismethodwaseasilyoperativeandaccurateforprecisedetermination.Keywords:MeningococcalconjugatesbulkofA,C,YandW135;DMSO;HPLC二甲亞砌i(Dimethylsulfoxide,簡(jiǎn)稱DMSO)是一*種既含有親水亞硯基團(tuán)又含兩個(gè)疏水甲基的兩性有機(jī)小分子。這種兩性特征賦予其兩種有價(jià)值的特性:既有水溶性乂可溶解大量的親脂性化合物,這些特性使DMSO在生物化學(xué)領(lǐng)域中被廣泛當(dāng)作溶劑使用。

6、在四價(jià)腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗生產(chǎn)制造過(guò)程中,DMSO也作為溶劑使用，中華人民共和國(guó)藥典)(2010年版)三部將其列為第三類溶劑限制使用，其使用限度為0.5%，即5000mg/L?？际崭迦掌冢?013-04-11；修回日期：2013-(M-27作者簡(jiǎn)介:傅元欣(1984.)，女，醫(yī)學(xué)生物學(xué)工程師，主要從事生物制品質(zhì)量控制工作。慮到該類溶劑對(duì)人體的危害以及在終產(chǎn)品中殘留的可能性,DMSO的檢測(cè)也成為質(zhì)控之一?，F(xiàn)行藥典中并沒有針對(duì)制品中DMSO的檢測(cè)方法，可資借鑒的有關(guān)DMSO殘留量的測(cè)定方法有反滴定法、元素分析法、微庫(kù)侖測(cè)硫法、氣相色譜法等。因DMSO是極性物質(zhì)，如果采用氣相色譜法測(cè)定其含量,

7、進(jìn)樣器溫度選擇困難，且色譜柱污染嚴(yán)重。目前也有部分人采用液相色譜法檢測(cè)a。反相色譜以非極性鍵合相為固定相，如C18。流動(dòng)相通常以水為基礎(chǔ)，加入多種有機(jī)溶劑與之混合。DMSO是一種親脂有機(jī)溶劑，可采用反相液相色譜法進(jìn)行分析?？筛鶕?jù)DMS。在色譜柱上的特定保留時(shí)間對(duì)其進(jìn)行定性及定量分析。試驗(yàn)使用高效液相色譜法，建立了腦膜炎球菌結(jié)合物原液中殘留DMSO的檢測(cè)方法，并進(jìn)行了方法驗(yàn)證，獲得較為滿意的試驗(yàn)結(jié)果。1材料與方法1.1材料1.1.1儀器設(shè)備HP105。高效液相色譜儀，二級(jí)管陣列檢測(cè)器，均購(gòu)自美國(guó)惠普公司。KromasilCl8柱（250nimx4.6mm），瑞典Krornasil公司。Agile

8、nt化學(xué)工作站,Agilent公司。1.1.2試劑及試驗(yàn)材料DMSO,Sigma公司。甲醇，一級(jí)色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司。Milli-Q級(jí)超純水（電阻率為18MQcm）,Mil.lipore公司。四價(jià)腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗A群、C群、Y群、W135群?jiǎn)蝺r(jià)原液，蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司第一研究室提供。1.2方法1.2.1樣品制備標(biāo)準(zhǔn)品的配制：準(zhǔn)確稱取0.05gDMSO加水定容至50mL,超聲振蕩5min,即為1000mg/L對(duì)照品儲(chǔ)備液;供試品配制：分別將A群、C群、Y群和W135群腦膜炎球菌結(jié)合物單價(jià)原液用3K的超濾離心管離心（8000r/min,30min），將離心后的

9、液體取出，待測(cè)。1.2.2色譜條件的確定檢測(cè)波長(zhǎng)的確定:對(duì)DMSO進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)吸收強(qiáng)度選擇合適的檢測(cè)波長(zhǎng)；儀器試驗(yàn)參數(shù)的設(shè)置：采用KromasilC18柱（250mmx4.6mm），硅膠顆粒大小5呻，流動(dòng)相為甲醇-水（25:75）混合溶液,流速為1.0mL/min,進(jìn)樣體積20pX,收集時(shí)間5min,柱溫為常溫。1.2.3檢測(cè)方法的驗(yàn)證專屬性試驗(yàn):分別用水、A群、C群、Y群和W135群腦膜炎球菌結(jié)合物單價(jià)原液的離心液作為待測(cè)品，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定。再以20mg/L的DMSO工作液為待測(cè)品，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定;標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立、線性范圍的確定及線性驗(yàn)證:將1000mg/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液分別

10、稀釋成質(zhì)量濃度為1、5、10、20、50、80、100mg/L對(duì)照品工作液，按色譜條件依次進(jìn)行測(cè)定，不同時(shí)間重復(fù)測(cè)定5次，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù);回收率試驗(yàn):將DMSO對(duì)照品儲(chǔ)備液分別用A群、C群、Y群和W135群腦膜炎球萌結(jié)合物單價(jià)原液（每個(gè)群的原液選擇三批）配制成1、40、80mg/L三個(gè)質(zhì)量濃度作為待測(cè)品（36個(gè)待測(cè)品），按確定色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定。同樣操作重復(fù)5次，每次每個(gè)待測(cè)品均按確定色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率;重復(fù)性試驗(yàn)：將DMSO對(duì)照品儲(chǔ)備液分別稀釋成10.50.80mg/L三個(gè)質(zhì)量濃度，每個(gè)質(zhì)量濃度在確定的色譜條件下分別測(cè)定10次，計(jì)算變異系數(shù);最小定量限度的測(cè)定

11、：在確定的色譜條件下測(cè)定遞減量的DMSO,以滿足信噪比S/N=10為前提，準(zhǔn)確度和精密度都能達(dá)到要求時(shí)能夠定量測(cè)定出DMSO的最低量為最小定量限。1.2.4單價(jià)腦膜炎球菌結(jié)合物原液樣品測(cè)定按確定色譜條件對(duì)8批單價(jià)腦膜炎球菌結(jié)合物原液樣品進(jìn)行測(cè)定。2結(jié)果2.1色譜條件中檢測(cè)波長(zhǎng)的確定對(duì)DMSO進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)其最大吸收在205.6nm,其后吸收值迅速下降，僅在270nm處有很小的吸收。使用270nm的波長(zhǎng)對(duì)DMSO進(jìn)行檢測(cè)，1mg/L的對(duì)照品未出峰，方法的靈敏度很低。使用205nm的檢測(cè)波長(zhǎng)，流動(dòng)相中的甲醇雖然有吸收，但吸收值非常低，即使是1mg/LDMSO的吸收相對(duì)于甲醇的吸收也要高出很多

12、,對(duì)檢測(cè)無(wú)影響，所以選擇205nm的檢測(cè)波長(zhǎng)。2.2專屬性試驗(yàn)DMSO對(duì)照品溶液在1.2.2中描述的色譜條件下的保留時(shí)間為2.697min,與DMSO相鄰的負(fù)峰為水峰（圖1A、B）。A群、C群、Y群和W135群腦膜炎球菌結(jié)合物單價(jià)原液離心液在DMSO出峰處均未出峰（圖1C、I）、E、F）。由此可見,試驗(yàn)方法對(duì)腦膜炎球菌結(jié)合物原液中DMSO檢測(cè)特異，專屬性強(qiáng)。2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性驗(yàn)證試驗(yàn)取DMSO對(duì)照品溶液在1100mg/L范圍內(nèi)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。不同時(shí)間重復(fù)測(cè)定5次的相關(guān)系數(shù)見表1。結(jié)果表明在11。0mg/L范圍內(nèi)DMSO的濃度x與其色譜面積y呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999,方法的精

13、密度高，重復(fù)性好。2.4回收率試驗(yàn)2.4.1A群腦膜炎球菌結(jié)合物原液添加回收試驗(yàn)在A群腦膜炎球菌結(jié)合物離心液中分別添加低、中、高三個(gè)不同濃度的DMSO對(duì)照品溶液，回收率均在94%111%之間，回收率較好（表2）。2.4.2C群腦膜炎球菌結(jié)合物原液添加回收試驗(yàn)C群腦膜炎球菌結(jié)合物離心液中添加DMSO后,DMSO回收率在94%107%之間，回收率較好（表3）。KI*1/VIF<4/I(_-z(6544321(nvg通未舉svos蛋4321SVE)迥果嘗>32洗脫時(shí)間/minSVE)妥堊.5。1234.()5.().5o.5os2Q7.5.2.05050505052075211sVE)a

14、嘗洗脫時(shí)間/minA：20mg/LDMSO對(duì)照品溶液；B純水；CF分別為A、C、Y、W135群腦膜炎球菌結(jié)合物單價(jià)原液離心液。圖1專屬性試驗(yàn)色譜圖Fig.1Thechromatographydiagramofspecifictest表1線性驗(yàn)證試驗(yàn)Tab.1Linearityvalidationtestp(DMSO)DMSO色譜峰峰面積（mAU*；s)(mg/L)12345113.3613.8714.6513.6713.45576.4980.1472.1776.6175.6610151.17151.20147.71148.02149.6120300.47292.74297.37304,5829

15、7.3350780.08794.28779.12786.27775.99801213.221266.601221.701212.721235.141001548.881562.931538.421541.111556.37r0.999790.999870.999930.999990.99993表2A群腦膜炎球菌結(jié)合物原液添加DMSO回收率試驗(yàn)Tab.2TherecoveryofDMSOinmeningococcalconjugatebulkofgroupA批號(hào)理論質(zhì)量濃度實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度（mg/L）平均回收率(mg/L)J2345(%)11.071.141.021.111.071.08108.00

16、200804074039.7738.9739.4739.8239.4939.5098.768080.7979.9180.3180.7380.6980.49100.6111.111.181.071.061.121.11110.80200903024039.6039.6539.3039.6139.9939.6399.088079.0679.2579.3879.5379.4879.3499.1811.010.920.920.950.930.9594.60200905014040.1540.7240.2140.4740.7240.45101.148080.2379.9780.0180.0779.828

17、0.02100.03表3C群腦膜炎球菌結(jié)合物原液添加DMSO回收率試驗(yàn)Tab.3TherecoveryofDMSOinmeningococcalconjugatebulkofgroupC批號(hào)理論質(zhì)量濃度_實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度（mg/L）平均回收率(mg/L)12345(%)11.081.111.021.091.061.07107.00201012044039.4339.2739.8439.6439.4539.5398.828079.4578.9480.1579.3380.3279.6499.5511.021.031.061.071.021.04104.00200902014039.5639.7640.

18、3339.6439.9939.8699.648080.4779.9679.1680.0780.3880.01100.0111.010.920.920.950.930.9594.60200812054040.1540.7240.2140.4840.7240.46101.148080.2279.9780.0180.0879.8280.02100.032.4.3Y群腦膜炎球菌結(jié)合物原液添加回收試驗(yàn)Y群腦膜炎球菌結(jié)合物離心液中DMSO的添加回收率在95%106%之間（表4）。2.4.4W135群腦膜炎球菌結(jié)合物原液添加回收試驗(yàn)W135群添加DMSO回收試驗(yàn)結(jié)果如表5所列，可見其回收率在98%114%之

19、間°表4Y群腦膜炎球菌結(jié)合物原液添加DMSO回收率試驗(yàn)Tab.4TherecoveryofDMSOinmeningococcalconjugatebulkofgroupY批號(hào)理論質(zhì)量濃度實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度(m&/L)平均回收率(mg/L)12345(%)11.091.041.021.051.121.06106.40200912014038.1439.0938.6738.7939.9138.9297.308079.1677.2477.9177.3277.2177.7797.2111.031.081.071.051.021.05105.(X)200911014040.0739.6739

20、.8439.9239.8439.8799.678080.0680.1879.7679.8479.779.9199.8910.920.940.970.960.960.9595.00200912014040.2640.0340.4539.9740.4740.24100.598080.4780.6180.4779.5480.0780.23100.29表5W135群腦膜炎球菌結(jié)合物原液添加DMSO回收率試驗(yàn)Tab.5TherecoveryofDMSOinmeningococcalconjugatebulkofgroupW135批號(hào)理論質(zhì)量濃度_(mg/L)實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度(mg/L)-平均回收率(%)12

21、34511.121.001.071.071.071.07106.60200909014039.7140.6740.2939.8239.9640.09100.238079.9479.5979.8380.7380.8180.18100.2311.141.121.181.121.111.13113.40200911024039.5139.1839.6739.8239.0139.4498.608079.9480.3780.3880.7980.1880.33100.4211.001.010.990.951.071.00100.40201004014040.0140.2739.539.6240.239.9

22、299.808079.9581.2279.4180.1779.6580.25100.312.5重復(fù)性試驗(yàn)10次試驗(yàn)，結(jié)果見表6。從結(jié)果中可知試驗(yàn)的重復(fù)分別選取W.5O.8Omg/L三個(gè)質(zhì)量濃度各做性較好,CV值最大不超過(guò)1%。表6不同質(zhì)量濃度DMSO重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Tab.6Therepeatabletestwithdifferentmassconcentration理論質(zhì)量濃度測(cè)定值同D3%(mg/L)123456789101010.1410.1810.2310.1810.1410.0510.029.959.9910.050.895049.8749.4550.5149.9249.4149.5249

23、.3249.5149.2749.850.768080.3579.8280.4379.9880.4980.6480.9380.8980.7480.750.462.6最小定量限比大于10(見表7),此時(shí)水峰的影響可忽略,并且準(zhǔn)當(dāng)DMSO的質(zhì)量濃度為1mg/L時(shí)，系統(tǒng)的信噪確度和精密度都滿足要求，則最小定量限為1mg/L。表7DMSO質(zhì)量濃度為1mg/L時(shí)系統(tǒng)信噪比Tab.7ThesystemSNRwhenthemassconcentrationofDMSOwas1mg/L檢測(cè)次數(shù)信噪比111.7214.6313.9412.9513.2616.5715.0815.6916.21014.32.78批單

24、價(jià)腦膜炎球菌結(jié)合物原液樣品測(cè)定8批單價(jià)腦膜炎球菌結(jié)合物原液樣品直接超濾離心，濾出液中DMSO的殘余量均小于線性范圍的最低點(diǎn)1mg/L,見表8。表8單價(jià)腦膜炎球菌結(jié)合物原液樣品測(cè)定Tab.8ThedetectingofDMSOinmeningococcalconjugatebulkofA,C,YandW135樣品批號(hào)DMSO殘余量(mg/L)PSA-TT201103006<1PSA-TF201104007<1PSC-TT201104002<1PSC-TT201103001-2<1PSY-T1201101002<1PSY-TT201104004<1PSW-T12

25、01104003<1PSW-T1201104004<13討論DMSO在中華人民共和國(guó)藥典(2010年版)三部中歸為第三類溶劑限制使用，因此對(duì)制品中DMSO殘余的控制就尤為重要。DMS。作為兩性有機(jī)小分子與水具有高度的混合性，因而使水負(fù)峰與DMSO的峰完全分離具有很大的困難。試驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)改變流速和向流動(dòng)相中加入三氟乙酸都不能提高水峰與DMS。的分離度，兩個(gè)峰始終相鄰。只有使用甲醇來(lái)配制DMSO對(duì)照品時(shí)可以將兩者分開,但由于腦膜炎球菌結(jié)合物原液中不含甲醇，因而對(duì)于實(shí)際樣品的檢測(cè)沒有意義，因此依舊使用超純水來(lái)配制DMSO對(duì)照品。方法中水負(fù)峰雖與DMSO峰相鄰很近但兒乎不影響DMSO的定量分析，并且腦膜炎球菌結(jié)合物原液經(jīng)超濾離心去除大分子后對(duì)DMSO的出峰也沒有影響，因而此方法可運(yùn)用于腦膜炎球菌結(jié)合疫苗中殘留DMSO的測(cè)定。對(duì)于其他制品中殘余DMSO的質(zhì)量控制，如果制品本身對(duì)DMSO