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1、凝血酶預(yù)處理對海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用 作者:楊文瓊,孫圣剛,童萼塘摘要目的:研究凝血酶預(yù)處理(TPC)對大劑量凝血酶(TM)誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的影響,闡明TPC的保護(hù)作用。方法:海馬神經(jīng)元分別經(jīng)生理鹽水(Sham組)、小劑量TM(TPC組)及凝血酶受體激活肽(TRAP組)預(yù)處理48 h后再加大劑量TM作用24 h。TUNEL法及流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞數(shù)和凋亡百分率,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測神經(jīng)元Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果:與Sham組比較,TPC組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和凋亡百分率明顯降低(P0.01),Bcl-2表達(dá)上調(diào),Bax表達(dá)明顯下調(diào)(P0.01)。與Sham組比較,TRAP預(yù)處理組

2、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和凋亡百分率明顯降低(P0.01),Bcl-2表達(dá)上調(diào),Bax表達(dá)明顯下調(diào)(P0.01)。TRAP預(yù)處理組與TPC組相比差異無顯著性(P0.05)。結(jié)論:TPC可抑制TM導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡,激活PAR-1,促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)和降低Bax的表達(dá),可能是TPC抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。關(guān)鍵詞凝血酶預(yù)處理;細(xì)胞凋亡;Bcl-2;Bax;蛋白酶激活受體-1The Effect of Thrombin Preconditioning on the Apoptosis of Hippocampal Neurons Abstract:Objective To investigate th

3、e effect of thrombin preconditioning(TPC)on the apoptosis of hippocampal neurons and explore the potential mechanisms. Methods Hippocampal neurons were pretreated with saline,1U/ml TM and 5mol/L thrombin receptor activating peptides(TRAP)for 48h before exposed to 40U/ml TM,respectively.The number of

4、 apoptotic cells and apoptotic rate of neurons were measured by terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) mediated dUTP-biotin nick end-labeling(TUNEL)method and Flow cytometry.Bcl-2 and Bax protein expression were measured by immuocytochemical method.Results The number of apoptotic cells and apop

5、totic rate of neurons were decreased significantly in TPC group(P0.01).Bcl-2 protein expression was increased, Bax protein expression was decreased significantly in TPC group(P0.01).Compared to Sham group,the number of apoptotic cells and apoptotic rate of neurons were decreased significantly in TRA

6、P group(P0.01).Bcl-2 protein expression was increased,Bax protein expression was decreased significantly in TRAP group(P0.01).There was no significant difference in TRAP group and TPC group(P0.05).Conclusion TPC could inhibit neuron apoptosis induced by TM.The mechanism of neuroprotective effect of

7、TPC may be through activating PAR-1,up-regulating Bcl-2 protein expression and down-regulating Bax expression.Key words:Thrombin preconditioning;Apoptosis;Bcl-2;Bax;Protease activated receptor-1作為血腫成分中最特殊的物質(zhì),凝血酶在腦出血腦損傷中的作用倍受關(guān)注1。研究發(fā)現(xiàn),雖然大劑量凝血酶可導(dǎo)致腦損傷和細(xì)胞凋亡,但低濃度的凝血酶卻具有神經(jīng)保護(hù)作用。經(jīng)過小劑量凝血酶預(yù)處理后,凝血酶和腦內(nèi)血腫所致的腦水腫可減

8、輕,大鼠大腦中動脈梗塞模型中的梗塞面積明顯減小2,3,這種現(xiàn)象被稱為凝血酶預(yù)處理(Thrombin Preconditioning,TPC)或凝血酶誘導(dǎo)的腦耐受。為了探討凝血酶預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)機(jī)理,本實驗采用小劑量凝血酶預(yù)處理原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元,結(jié)合TUNEL法、流式細(xì)胞術(shù)及免疫細(xì)胞化學(xué)等方法,研究凝血酶預(yù)處理的保護(hù)作用及其機(jī)制。1材料和方法1.1材料新生SD大鼠80只(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供),凝血酶(Sigma公司),凝血酶受體激活肽(TRAP,武漢協(xié)和醫(yī)院心血管研究所合成),DMEM培養(yǎng)基,B27促生長劑(Gibco),神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE),Bcl-2、Bax

9、小鼠單克隆抗體(Santa Cruz),TUNEL試劑盒(Roche公司),SP免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)。1.2方法 1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,包括方差分析、t檢驗等,結(jié)果以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(xs)表示, 以P0.05為差異有顯著性意義。2結(jié)果2.1TUNEL染色結(jié)果Sham組可見較多凋亡細(xì)胞(27.3%),TPC組(4%)與TRAP組(4.5%)凋亡陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少。2.2細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞儀檢測觀察亞G1峰即特征性凋亡峰的出現(xiàn),計算該細(xì)胞占總細(xì)胞的百分?jǐn)?shù),即凋亡百分率。Sham組中凋亡百分率較高(29.30%),明顯高于TPC組與TRAP

10、組(4.5%,5.59%,P0.01)。TRAP組凋亡百分率與TPC組相比差異無顯著性(P0.05)。2.3TPC對神經(jīng)元Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響Sham組Bcl-2表達(dá)較少,TPC組明顯升高,與Sham組相比存在顯著差異(P0.01)。TRAP組Bcl-2亦上升,與TPC組相比差異無顯著性(P0.05),見表1。Sham組有大量Bax陽性表達(dá)。TPC組Bax蛋白表達(dá)與Sham組相比明顯降低(P0.01)。TRAP組與TPC組相比差異無顯著性(P0.05),見表1。表1TPC對海馬神經(jīng)元Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響(略)注:與Sham組比較,*P0.013討論凝血酶是絲氨酸蛋白酶家

11、族中最重要的成員之一,由無活性的凝血酶原產(chǎn)生。1 ml的全血可產(chǎn)生約12 nmol的凝血酶。腦損害如腦出血和腦損傷導(dǎo)致血液進(jìn)入腦實質(zhì),凝血酶原裂解立即產(chǎn)生大量的凝血酶。在頭部穿透傷、出血性中風(fēng)、腦血管瘤、動靜脈畸形破裂等腦血管疾病發(fā)生中,血液中的凝血酶可直接進(jìn)入腦組織,凝血酶亦可能在治療中風(fēng)和神經(jīng)外科手術(shù)時進(jìn)入腦組織。凝血酶與神經(jīng)細(xì)胞接觸后將激發(fā)一系列的病理生理反應(yīng),大劑量凝血酶會對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。資料顯示,小劑量的凝血酶可保護(hù)神經(jīng)元免于缺氧和-myloid所致的毒性損害6-8。Masada等在大鼠大腦中動脈閉塞模型中發(fā)現(xiàn),TPC組在皮質(zhì)區(qū),基底節(jié)區(qū)腦水腫明顯減輕,梗死體積明顯縮小,神經(jīng)

12、缺損嚴(yán)重程度明顯減輕,水蛭素可抑制上述作用。因此,凝血酶預(yù)處理保護(hù)作用機(jī)制的探討可為腦出血的臨床治療提供新的研究方向。我們前述研究顯示大劑量凝血酶可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡9-10,用1 U/ml凝血酶預(yù)處理后再加入大劑量凝血酶,TUNEL和流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)TPC組凋亡細(xì)胞數(shù)和凋亡百分率較Sham組明顯減少,提示凝血酶預(yù)處理可減輕大劑量凝血酶所致的細(xì)胞凋亡。Bcl-2和Bax都是與凋亡密切相關(guān)的基因,它們的作用是相互拮抗的,Bcl-2能抑制細(xì)胞凋亡,而Bax則介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。二者之比決定細(xì)胞對各種引起細(xì)胞凋亡刺激的敏感性,影響著細(xì)胞的生存和死亡11。凝血酶預(yù)處理的抗細(xì)胞凋亡的機(jī)制目前尚未清楚。本

13、實驗用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測Bcl-2及Bax的表達(dá),發(fā)現(xiàn)生理鹽水預(yù)處理組Bcl-2蛋白的表達(dá)較低,TPC組Bcl-2的表達(dá)與Sham組比較明顯增加,說明TPC可上調(diào)Bcl-2的表達(dá)。而TPC組Bax的表達(dá)較Sham組明顯減少,提示TPC可抑制Bax的表達(dá),對抗凝血酶的作用。凝血酶通過激活PAR-1受體,參與一系列的病理生理過程。PAR-1受體激活后產(chǎn)生跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo),引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子的移動和蛋白磷酸化,產(chǎn)生一系列效應(yīng)12。本實驗用5 mol/L的凝血酶受體激活肽預(yù)處理海馬神經(jīng)元,同樣可以減輕大劑量凝血酶引起神經(jīng)元凋亡的作用,并且凋亡調(diào)控因子的變化與TPC相似,即可促進(jìn)Bcl-2表達(dá)及抑制Bax

14、的表達(dá),提示凝血酶預(yù)處理過程中有凝血酶受體的激活。綜上所述,本實驗顯示凝血酶預(yù)處理可以抑制凝血酶誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,其可能機(jī)制是激活PAR-1,上調(diào)Bcl-2的表達(dá)及下調(diào)Bax的表達(dá),從而抑制細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步深入研究凝血酶預(yù)處理中各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及因子的相互關(guān)系,闡明凝血酶預(yù)處理的保護(hù)作用機(jī)制,可能對腦出血的防治提供新的啟示。參考文獻(xiàn)1Lee KR,Colon GP,Betz AL,et al.Edema from intracerebral hemorrhage: the role of thrombinJ.J Neurosurg,1996,84(1):91-96.Xi G,Keep RF,Hua

15、Y,et al.Attenuation of thrombin-induced brain edema by cerebral thrombin preconditioningJ.Stroke,1999,30(6):1 247-1 255.Masada T,Xi G,Hua Y,et al.The effects of thrombin preconditioning on focal cerebral ischemia in ratsJ.Brain Res,2000,867(1-2):173-179.Rosenberg GA,Mun-Bryce S,Wesley M,et al.Collag

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