同種移植激活的宿主樹突狀細胞能介導免疫耐受

1、同種移植激活的宿主樹突狀細胞能介導免疫耐受                 作者:許奇齊，李玫，王松霞，薛殷彤【摘要】 目的 依據(jù)T細胞的發(fā)育機制理論，誘導針對移植物特抗原的異性免疫耐受。方法 先用致死劑量的射線，將受者的T細胞及干細胞去除，形成了一個不具干細胞、前T細胞和T細胞的受者模型，稱受者模型。同時經(jīng)同種皮膚移植制造正常的受者對供者器官的免疫排斥反應的模型，稱模型。從模型中經(jīng)免疫磁珠分選取得被供者抗原所激活的、具有抗原提呈功能的

2、樹突狀細胞，與正常的事先準備好的受者骨髓細胞在體外混合后回輸至受者模型中。受者完成免疫造血功能重建后，再對其行同種皮膚移植。分5組，分別觀察移植皮片的存活時間，并常規(guī)病理組織切片和流式細胞分析檢測。結(jié)果 由T細胞發(fā)育的上游誘導產(chǎn)生特異性的免疫移植耐受，比較對照組，實驗組皮片存活時間顯著延長（P0.005），流式細胞分析和病理組織學分析差異也有顯著性。結(jié)論 在所建立的模型和系統(tǒng)中，能誘導移植物特異性的免疫耐受，也進一步驗證了胸腺的陰性選擇理論。【關鍵詞】 樹突狀細胞；移植；耐受；胸腺；T細胞發(fā)育Induction of transplantation tolerance with allogra

3、ft-activated host dendritic cells【Abstract】 Objective The negative thymic selection is critical for the maturation of bone marrow derived cells to T cells.Negative selection occurs in thymic medulla and is normally mediated by bone marrow derived APC，like dendritic cells (DC) or macrophages.Immunodo

4、minant allopeptide-pulsed host dendritic cells can successfully induce transplantation tolerance.Methods Host dendritic cells were activated by allo-skin transplantation on day -10 to present the donor-specific antigens.Murine recipients of allogeneic skin grafts on day 0 were given transfusion of t

5、hese activated dendritic cells and isogeneic bone marrow cells after lethal irradiation.Results Transfusion of donor-antigen-specific activated host dendritic cells plus isogeneic bone marrow cells led to prolonged skin allograft survival in recipients treated with lethal irradiation.In contrast，bon

6、e marrow cells transfusion alone failed to induce donor-specific tolerance.Conclusion In the absence of chronic immunosuppression，transfusion of donor antigens activated dendritic cells can prolong skin allograf'' >同種移植激活的宿主樹突狀細胞能介導免疫耐受 t survival markedly.【Key words】1 材料與方法1.1 動物 雌性BALB/

7、c（H2d，受者）、雄性C57BL/6（H2b，供者）和雄性129（H2k，特異性對照供者）鼠，由北京大學醫(yī)學部動物中心提供，均為6周齡，全部的動物都飼養(yǎng)于北京大學醫(yī)學部實驗動物部SPF-II級動物房。1.2 試劑硫酸新霉素和小鼠淋巴細胞分層液HISTOPAQUER-1083購自Sigma-Aldrich，Inc公司。DynabeadsR小鼠pan T (Thy 1.2)磁珠標記的抗體購自Dynal，Inc.公司。PE標記抗小鼠CD4抗體，F(xiàn)ITC標記抗小鼠CD8抗體由北京大學醫(yī)學部免疫學系提供。DMEM和PBS由北京大學人民醫(yī)院提供。1.3 激活并分選宿主樹突狀細胞 為激活宿主樹突狀細胞（D

8、Cs），在分選細胞前的第天，給BALB/c宿主動物行同種異體皮膚移植，皮片供者為C57BL/6鼠。然后于收獲細胞的當天處死這些BALB/c宿主動物，取它們的脾臟，通過HISTOPAQUER-1083小鼠淋巴細胞分層液離心分層收獲單核細胞，再使用DynabeadsR小鼠pan T (Thy 1.2)磁珠抗體通過陰性分選去除小鼠Thy 1.2陽性的細胞，最終得到含激活DCs的小鼠脾細胞，用DMEM調(diào)整細胞濃度到3.0×107 cells/ml。1.4 宿主骨髓細胞分選 用注射器使用DMEM沖洗BALB/c宿主動物的股骨和脛骨骨髓腔，收集細胞，離心洗滌一遍，然后用DMEM調(diào)整細胞濃度到5.

9、0×106 cells/ml。1.5 受者動物的準備 在接受皮膚移植前的第天，BALB/c受者首先接受900rad致死量的伽瑪射線照射，射線源為北京大學醫(yī)學部鈷-60照射室，然后于照射后的h內(nèi)，每只BALB/c受者，通過尾靜脈，或者輸入1.0×106骨髓細胞，或者輸入1.0×106骨髓細胞和5.0×106激活的宿主DCs細胞的混合細胞。1.6 移植和耐受誘導 在回輸細胞后的第天，不同處理的BALB/c受者給予同種異體皮片移植，取自小鼠尾巴的皮膚剪裁成大小為0.9cm×0.9cm的皮片11，如表所示，接受來自C57BL/6鼠的皮片的動物作為耐受誘

10、導組，接受來自129鼠的皮片的動物作為特異性對照組。1.7 病理組織學分析 于空白對照組排斥的時間，即皮片移植后第天取材，取材部位是移植皮片及其周邊范圍內(nèi)的皮膚組織，在北京大學干細胞中心處做石蠟切片，HE染色，光鏡分析。1.8 流式細胞分析 分別于皮片移植術后第、天取移植受者外周血，溶解紅細胞后，使用標記抗小鼠CD4抗體和標記抗小鼠CD8抗體，雙標直染；然后使用FACScan (Becton Dickinson)行流式細胞分析外周血CD4+或者CD8+T細胞以及兩者的比例。1.9 統(tǒng)計學分析 采用SAS軟件，使用配對檢驗來比較各組      間皮片存活時

11、間差異，P0.05認為差異有顯著性。2 結(jié)果2.1 致死量照射后宿主動物的免疫造血功能重建 實驗組受者動物（BALB/c鼠）在移植前30天，首先給予致死量伽瑪射線（900rad）照射，同時在6h內(nèi)通過尾靜脈混合回輸激活的DCs（去除T細胞的脾細胞）和同基因骨髓細胞，或者僅回輸同基因骨髓細胞；隨后受者動物將開始免疫造血功能重建。30天后進行小鼠尾部皮片移植（供者分別為C57鼠和特異性對照129鼠）。在照射后的3個月的觀察期間， ( 同種移植激活的宿主樹突狀細胞能介導免疫耐受(3) ) 各組動物均存活良好。2.2 接受回輸激活的DCs的移植模型中，皮片存活時間延長 如表1所示，不同分組間，皮片存活

12、時間存在明顯差異。其中，組0為受者未接受任何特殊處理，直接行皮片移植的結(jié)果，其皮片中數(shù)存活時間（MST）為11天；組1為受者經(jīng)致死量伽瑪射線照射后給予激活的DCs和同基因骨髓細胞經(jīng)免疫造血功能重建30天后，行皮片移植的結(jié)果，MST=20天；兩者相比，組1受者皮片存活時間明顯延長，統(tǒng)計學分析為差異有顯著性（P0.005）。圖1為第11天組0（左）和組1（右）的移植皮片的照片，組0受者的移植皮片完全被排斥脫落，而組1的皮片存活良好；圖2為組1受者移植皮片第15(A)，17(B)，19(C)，21(D)，23(E)天的照片，可見第21天前皮片均生長良好，第23天時皮片顏色加深，出現(xiàn)邊緣結(jié)痂，排斥的跡

13、象。注：受者鼠在皮片移植前天給予900rad致死量伽瑪射線照射，同時如表1所示，于照射后h內(nèi)回輸不同的細胞。表中的計算基于次不同的實驗結(jié)果；*P0.005組和組間；P0.0001組和組間。MST，Median Survival Time，即中數(shù)存活時間。DC，指經(jīng)同種移植激活的樹突狀細胞，即BALB/c小鼠先接受同種皮片移植（供者為C57鼠），10天后取脾細胞，經(jīng)淋巴細胞分層液分層離心得到單核細胞，并用磁珠標記的抗小鼠pan-T抗體陰性分選去除細胞后得到的細胞。BMC，為同品系的BALB/c小鼠骨髓細胞2.3 激活的DC細胞誘導供者特異性移植耐受 為證實激活的DC細胞誘導的是供者特異性的耐受，

14、我們?nèi)o關的供者129鼠的尾部皮片，如表1組3所示，與組1相比，受者的處理完全相同，但皮片來自無關的129鼠，該移植皮片在第10天均被完全排斥，MST=10天，與組1相比，差異有顯著性（P0.001）。相反，供者照射后僅給予骨髓細胞，產(chǎn)生的耐受是非特異性的，如組2、組4所示，受者對C57鼠和129鼠的皮片均產(chǎn)生耐受，兩者MST均達到28天，差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。2.4 移植皮片部位病理組織學分析 如圖3所示，第11天，組0(A)，組3（C）受者皮片完全被排斥，鏡下觀察見大量炎癥細胞浸潤，組0(A)皮片和受者移植部位相分離；相反，此時組1(B)皮片生長良好，鏡下見移植皮片和受者移植部位

15、沒有脫離傾向，也未 ,同種移植激活的宿主樹突狀細胞能介導免疫耐受(4) 見明顯炎癥細胞浸潤。2.5 實驗組的免疫學功能狀態(tài)的流式細胞分析結(jié)果 分別于皮片移植術后第11、19、23天，取組0、組1移植受者外周血，用流式細胞分析外周血CD4+或者CD8+T細胞以及兩者的比例。如表2所示，于第11天，組0和組1間，CD4+、CD8+細胞以及兩者的比例差異有顯著性；第11、19、23天，CD4+、CD8+細胞以及兩者的比例在組1受者組內(nèi)差異也有顯著性（P0.01）?？梢娫诿庖咧亟ㄟ^程中，組1的CD4+輔助性T細胞于移植后30天，在比例和絕對數(shù)目上已經(jīng)完全恢復；從CD4+/CD8+細胞比值看，骨髓移植后

16、，比值明顯升高了，一方面是CD4+的T細胞比例增加了，同時，CD8+T細胞比例減少了，CD8+的T細胞減少的幅度超過了CD4+的T細胞增加的幅度，結(jié)果CD4+/CD8+的比值，組1與組0相比，增加了3倍左右。在完全排斥的23天，其值達到最高峰（7.87）。注：于第11天，組0和組1間，CD4+、CD8+細胞以及兩者的比例差異有顯著性；第11、19、23天，CD4+、CD8+細胞以及兩者的比例在組1受者組內(nèi)差異也有顯著性3 討論皮膚移植是非常嚴格的移植排斥動物模型，皮膚是全身各種器官組織中最容易被排斥的組織，而且皮膚移植直觀，操作相對簡單11，所以我們選擇它作為動物模型。在不使用系統(tǒng)性免疫抑制劑

17、的情況下，我們在小鼠皮膚移植模型中成功誘導供者特異性免疫耐受，使皮片存活時間明顯延長，對于C57BL/6來源的皮片，其MST達20天；相反，對于無關129鼠來源的皮片，其MST=10天?？赡艿哪褪軝C制是復雜的：（1）可能是由于經(jīng)同種移植激活的DCs攜帶供者特異性抗原，經(jīng)尾靜脈回輸進入受鼠體內(nèi)，然后隨血液循環(huán)歸巢到受者胸腺中，提呈供者抗原參與陰性選擇過程，使受者在免疫重建過程中，大部分供者反應性的T淋巴細胞在胸腺水平經(jīng)陰性選擇由誘導凋亡克隆清除和克隆無能等機制去除掉，從而誘導對供者皮片的耐受，同時，在免疫重建的過程中，受者能保持對其他抗原的正常免疫應答；（2）也可能是供者抗原進入胸腺后，誘導調(diào)節(jié)

18、性T細胞Treg細胞對供者產(chǎn)生特異性的免疫耐受。（3）還可能是由于同種移植激活的DCs攜帶供者特異性抗原進入體內(nèi)后，激活同種反應性T細胞回流入胸腺所致。從組3的結(jié)果可知，接受了致死量照射的受鼠在經(jīng)過30天的免疫重建后，于第10天就完全排斥了無關129鼠的皮片，一方面說明該耐受誘導方案的特異性；同時也表明，受鼠具備了完整的免疫功能，流式細胞分析的結(jié)果也進一步證實了受鼠的免疫功能，如表2所示，在免疫重建過程中，組1的CD4+輔助性T細胞于移植后30天，在比例和絕對數(shù)目上已經(jīng)完全恢復；從CD4/CD8細胞比值看，由于外周CD4/CD8的比值是由胸腺的微環(huán)境決定的，胸腺的輸出對于該比值有決定性的影響，

19、在正常的成年小鼠，其值介于24之間12；骨髓移植后，比值明顯升高了。由于CD4+的細胞識別MHC Class II分子和外源性的抗原肽形成的復合體，因此推斷可能是由于同種激活的DCs攜帶同種異型抗原分子進入胸腺后，一方面通過胸腺的陰性選擇誘導細胞毒性的CD8+T細胞凋亡，因此外周CD8+T細胞的比例減少了近一半；同時，由于該方案誘導的是不完全的耐受，其MST=20天，移植術后不可避免的發(fā)生排斥反應，將導致了CD4+的T細胞數(shù)目增加，在完全排斥的23提 （，。）天，其值達到最高峰。皮膚移植有高排斥性且操作簡單，是良好的移植動物模型，但是在臨床上多為自體皮膚移植，因此，我們也設想在今后的實驗中嘗試

20、心臟移植、腎臟移植等其他的移植模型來進一步驗證實驗結(jié)果，期待能對將來的臨床實體器官移植提供更有意義的參考；對于激活的DC細胞呈遞的供者抗原，我們也希望能在今后的實驗中進一步提取、純化，以期待分析誘導移植耐受的優(yōu)勢表位；同時，我們也在設計進一步的實驗來驗證前文所述的誘導該免疫耐受方案的可能機制。(致謝：感謝北京大學人民醫(yī)院肝病研究所的魏來教授，高燕教授提供指導和實驗的部分場所；叢旭老師提供實驗的技術支持)                              1 Sou