動物細胞工程試驗講義(學(xué)生版)

1、實驗一細胞培養(yǎng)用品的清洗、消毒與滅菌體外人工培養(yǎng)的細胞缺乏抗感染能力,所以能否防止污染是決定培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。即便使用設(shè)備完善的實驗室,若實驗者粗心大意,技術(shù)操作不規(guī)范,也會導(dǎo)致細胞污染。無菌技術(shù)原理是阻止無菌的、未被污染的物體與任何有菌的、被污染的物體相接觸。任何直接或間接地與培養(yǎng)細胞相接觸的物體必須經(jīng)過嚴格的清洗和消毒程序。1.實驗?zāi)康恼莆占毎囵B(yǎng)中所使用的器械的清洗與消毒方法。2.實驗原理清洗時采用化學(xué)藥劑清除物體表面污垢的方法,它是借助清潔劑對物體表面污染物或覆蓋層進行化學(xué)轉(zhuǎn)化、溶解、剝離以達到脫脂、除銹和去污的效果。消毒是指殺死病原微生物(但不一定能殺死細胞芽孢的方法。通常用化學(xué)方法來

2、達到消毒的作用。滅菌可除去或殺滅物體中全部微生物。應(yīng)根據(jù)微生物的種類、污染狀況、被污染物體的性質(zhì)與狀態(tài),選擇單獨或組合滅菌方法。能否達到滅菌的目的,通常要采用無菌實驗法進行判定。對滅菌操作時采用的溫度、壓力等能否適合滅菌的條件,必須得到十分的確認。在滅菌條件選定后,還要進行滅菌效果的確認,以保證使用的各種滅菌條件適合于要殺滅的目標菌。滅菌的程度受滅菌的時間與滅菌劑強度的制約。滅菌常用的方法有化學(xué)試劑滅菌法、射線滅菌法、干熱滅菌法、濕熱滅菌法和過濾除菌法等?？筛鶕?jù)不同的需求,采用不同的方法,如培養(yǎng)基滅菌一般采用濕熱滅菌法,空氣滅菌則采用過濾除菌法。3.實驗準備儀器設(shè)備:超凈工作臺、超聲清洗器、高

3、壓滅菌鍋、干燥箱、過濾器、紫外燈、0.22um 微孔濾膜、電磁爐、電子分析天平、鋁箔、試管刷等。實驗材料:玻璃器皿(三角瓶、燒杯、量筒、試劑瓶塑料器皿(離心管、吸頭等、眼科剪刀、眼科鑷、金屬飯盒、報紙等。主要試劑:75%乙醇、鹽酸、0.2%的新潔爾滅、高錳酸鉀、重鉻酸鉀、濃硫酸、次氯酸鈉(NaClO、洗滌劑、蒸餾水、去離子水等。4.試驗方法4.1 玻璃器皿的清洗(1浸泡:初次使用和培養(yǎng)用的玻璃器皿都需要先用清水浸泡,水要完全進入器皿中,不要留有氣泡。新使用的器皿,用清水沖洗后放入鹽酸溶液(5%中浸泡過夜。(鹽酸浸泡主要是為了中和其中的堿性物質(zhì)。(2刷洗:浸泡后的玻璃器皿要用軟毛刷蘸洗滌劑刷洗,

4、以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)。(刷洗次數(shù)太多,會損害器皿表面光澤度,所以要選擇軟毛刷,切不可使用含沙粒的去污粉。(3浸酸:刷洗不掉的極微量雜質(zhì)要用硫酸和重鉻酸鉀清洗液浸泡,它們經(jīng)過強氧化作用后,可被除掉。(清洗液具有腐蝕性,使用時要帶耐酸性手套。新配制的清洗液為棕紅色,遇有機溶劑或水分增加時變成綠色,表明其失效。浸泡時,放入器皿要緩慢,防止發(fā)生迸濺。器皿要充滿清潔液,浸泡時間不應(yīng)少于6h,一般浸泡過夜。(4沖洗:將經(jīng)過上述步驟處理的玻璃器皿用清水沖洗5-10遍,放入蒸餾水中漂洗3-5遍?？馗?用牛皮紙包好。然后置于干燥箱中,50度烤干,備用。(流水清洗時水流應(yīng)保持不斷,每次應(yīng)將水灌滿器皿并倒干

5、凈,以去除殘余的洗滌劑。干燥器皿時不要擺放過緊,以免阻礙熱空氣的流通。4.2 塑料制品的清洗(1器皿用后立即用流水沖洗或浸泡于自來水中過夜。(2用2%NaOH溶液或含NaClO的蒸餾水浸泡過夜。(3然后用自來水沖洗,如用NaOH溶液浸泡的,還需再用5%鹽酸浸泡15-30min。(如果殘留附著物,可用紗布或棉簽刷洗。(4用盛有50-60度蒸餾水的超聲波儀,超聲波清洗30min。(5用蒸餾水沖洗3-5遍,放入烘箱中50度烤干,備用。4.3手術(shù)器械的清洗手術(shù)器械等用酒精棉球擦拭干凈,確保器械上面沒有污染物,裝入鋁制飯盒中,用報紙包裹好。4.4高壓蒸汽滅菌將所有清洗干凈的玻璃器皿、塑料制品以及手術(shù)器械

6、包裹好放入高壓滅菌鍋中,常用滅菌條件為壓力0.15MPa,溫度121度,15-30min。(蒸汽溫度達到121度,能將耐熱的芽孢在30min 內(nèi)全部殺死。滅菌時,消毒物品不能裝得過滿,以保證鍋內(nèi)氣體流通。4.5無菌培養(yǎng)室的消毒(1用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次(拖布要專用,然后打開紫外燈照射消毒30-50min.(2用75%乙醇擦洗超凈工作臺臺面,然后用紫外燈消毒30min。(3在無菌環(huán)境下進行培養(yǎng)或做其他無菌工作時,首先要點燃酒精燈。以后一切操作,如安裝吸管冒、打開或封閉瓶口等,都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。5.注意事項與建議(1消毒時超凈工作臺臺面上用品不要過多或重疊放置,否則會遮擋紫外

7、線,降低消毒效果。(2金屬器械不能再外焰中燒得時間過長,以防金屬退火,燒過的金屬鑷要待冷卻后才能挾取組織,以免造成組織損傷。(3濕熱滅菌后的器皿應(yīng)在干燥箱中60°C烘干,待器皿完全干燥并經(jīng)75%乙醇噴灑消毒后再移到無菌操作間使用。(4吸取營養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼,因為殘留在吸管頭中的營養(yǎng)液會燒焦想成碳膜,再用時會把有害物質(zhì)帶入營養(yǎng)液中。(5膠塞經(jīng)過火焰時也不能時間過長,以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體,危害培養(yǎng)細胞。(6玻璃器皿使用后應(yīng)立即投入清水中浸泡;刷洗、酸泡后的器皿要用流水振蕩沖洗,不得殘留洗滌劑、清潔液;煮沸前的水面要高于器皿5cm。(7膠塞洗刷的重點部位是膠塞使用面,應(yīng)用軟毛刷

8、逐個刷洗。在使用過程中,膠塞不能與培養(yǎng)液接觸,以防未洗凈的膠塞污染培養(yǎng)液和細胞。干熱滅菌的器皿應(yīng)在烘箱溫度降至60°C以下再打開取出,經(jīng)75%乙醇噴灑消毒后再移到無菌操作間使用。(8帶有螺口蓋的血清瓶或試劑瓶只能濕熱滅菌,滅菌時瓶蓋用鋁箔紙或牛皮紙包裹,滅菌過程中瓶蓋應(yīng)稍擰松,以利于濕熱氣體進入瓶內(nèi),滅菌結(jié)束后待玻璃瓶冷卻后將蓋擰緊。也可以將玻璃瓶和瓶蓋分開各自包裹滅菌,玻璃部分干熱滅菌,塑料部分濕熱滅菌。(9細胞培養(yǎng)用器皿最好專門用于細胞培養(yǎng),不要與其他實驗混用。6. 實驗報告簡述細胞培養(yǎng)用的玻璃器皿與塑料器皿的清洗和消毒流程。7. 思考題(1細胞培養(yǎng)中如果使用橡膠制品該如何清洗消

9、毒?(2為什么使用過的器皿要立即浸泡在含有消毒液的蒸餾水中?實驗二小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)1.實驗?zāi)康?1了解小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離原理。(2掌握小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離的貼壁篩選法。2.實驗原理小鼠骨髓基質(zhì)中存在著間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell, MSC是一種除造血干細胞以外,具有多向分化潛能的干細胞,可以向骨、軟骨、肌肉、皮膚、脂肪等多種細胞類型分化。骨髓間充質(zhì)干細胞具有易在體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)和擴增及免疫原性等特性,被認為在基因治療、細胞治療、組織工程等領(lǐng)域具有廣泛臨床應(yīng)用前景。從骨髓中分離MSC的方案主要有:1.根據(jù)骨髓MSC的底物黏附特性來實現(xiàn)分離的貼壁篩

10、選法;2. 根據(jù)MSC與其他細胞密度不同來分離的密度梯度離心法;3.根據(jù)細胞大小不同或者根據(jù)細胞表面的一些特殊標志來分離的流式細胞儀分選法。本實驗根據(jù)干細胞在低血清培養(yǎng)基中有貼壁優(yōu)勢,定期換液去除不貼壁細胞,從而達到純化及擴增MSC的目的。3.實驗準備實驗設(shè)備:超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、水平吊桶離心機、倒置相差顯微鏡、水浴鍋(37、無菌培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶、移液槍、無菌吸頭、無菌15mL離心管、血細胞計數(shù)板、計數(shù)器、記號筆。實驗試劑:含10%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基、PBS緩沖液、75%乙醇。實驗材料:健康4周齡BALB/c品系小鼠、培養(yǎng)瓶。準備工作:(1將需用的玻璃、塑料以及手術(shù)器械清

11、洗干凈,高壓滅菌,烘干備用。(2配置1L PBS溶液,分裝,高壓滅菌,晾至室溫后放入4°冰箱保存?zhèn)溆?配方如下:KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, NaCl 8.0g, Na2HPO4-12H2O 2.89g, pH 7.2-7.4 (藥品分析純(3生長培養(yǎng)基的配制:無菌條件下配置,-MEM(Gibco82%,FBS(Gibco, 1009915%, NEAA (sigma, M7145 1%,青霉素和鏈霉素(100X,吉諾,151401%,L-Glutanine(100X, Gibco,25030 1%, bFGF(RD,終濃度4ng/ml。4.實驗方法(1紫外線照射細胞

12、培養(yǎng)室和超凈工作臺至少30min滅菌。進入細胞培養(yǎng)室之前,用肥皂清洗雙手,擦干并噴灑75%乙醇,穿無菌服、戴無菌帽。把裝有培養(yǎng)液、PBS液的離心管放入37水浴鍋內(nèi)預(yù)熱15-20min。(2健康4周齡BALB/c雌性小鼠,頸椎脫臼法處死,75%乙醇浸泡5min。(小鼠處死后再消毒乙醇中浸泡時間不能太短,否則起不到消毒作用,也不能時間太長,時間長乙醇經(jīng)口鼻及肛門進入體內(nèi),影響細胞培養(yǎng)效果。(3取出小鼠,移入細胞培養(yǎng)室內(nèi),置于超凈工作臺上,無菌條件下取出股骨和脛骨,解剖刀去除多余的肌肉組織,兩端剪斷暴露骨髓腔。用1mL注射器吸取少量DMEM/F12培養(yǎng)基,從骨髓腔的一頭插入,將沖出骨髓,然后將股骨和

13、脛骨夾碎,以培養(yǎng)基反復(fù)沖洗,將沖洗液收集至無菌離心管中,制備細胞懸液。(為了避免沖起許多氣泡,應(yīng)緩慢沖,沖洗的次數(shù)不應(yīng)太多。(4用血細胞計數(shù)板對細胞懸液進行計數(shù),細胞計數(shù)后用含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸細胞,調(diào)整細胞濃度至有核細胞5X106個/mL,以2X106個/cm2密度接種至培養(yǎng)瓶中,置于37、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(524h后首次全部更換培養(yǎng)液去除未貼壁細胞,此時貼壁生長的MSC數(shù)量較少,分散存在,呈稍扁的梭形。以后每3d全量換液,隨著MSC的迅速擴增,十多天以后有較大的細胞克隆生長出來。(6等細胞克隆80%90%融合時傳代,吸出培養(yǎng)基,以PBS緩沖液洗2

14、次,以0.25%胰酶消化23min,用完全培養(yǎng)基終止消化后,1000r/min離心5min,棄上清后用完全培養(yǎng)液重新懸浮細胞,以1:2的比例接種于培養(yǎng)瓶中擴增培養(yǎng),置于37、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5.實驗結(jié)果骨髓間充質(zhì)干細胞體積較小,呈梭形或多角形,核質(zhì)比大。高密度時細胞通常平行排列或漩渦狀生長。6.注意事項與建議(1原代或傳代細胞中如觀察到少量成片雜細胞,可直接鏡下瓶底標記后,在超凈工作臺里面用吸管尖端機械刮除,吸出去掉。(2在細胞生長至密度較高時換液要輕柔,不要將液體直接吹向細胞,防止細胞漂起。7.實驗報告記錄骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)流程、結(jié)果及分析。8.思考題(1骨髓間充質(zhì)

15、干細胞有何特點?如何鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞?(2在骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)中如何去除雜細胞?實驗三原代小鼠胚胎成纖維細胞的制備及培養(yǎng)1.實驗?zāi)康恼莆招∈蟪衫w維細胞原代培養(yǎng)的方法和步驟,熟悉培養(yǎng)細胞的觀察方法,了解體外培養(yǎng)成纖維細胞的基本形態(tài)。2.實驗原理細胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。原代培養(yǎng),也叫初代培養(yǎng),是指由體內(nèi)取出組織,經(jīng)消化酶(常用胰蛋白酶或膠原酶、螯合劑(常用EDTA或機械方法處理,將其分散成單細胞,置于合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細胞得以生存、生長和繁殖,這一過程稱原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細胞離體時間短,遺傳性狀和體內(nèi)細胞相似,適于做細胞形態(tài)、功能和分化等研究。原代培養(yǎng)細胞移動性強,細胞分裂不旺盛

16、,存在異質(zhì)性細胞。3.實驗準備儀器設(shè)備:超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、水平吊桶離心機、倒置相差顯微鏡、水浴鍋(37、無菌培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶、移液槍、無菌吸頭、無菌15mL離心管、實體解剖顯微鏡、眼科剪刀、眼科鑷、廢液缸、計時器、血細胞計數(shù)板、計數(shù)器、記號筆。實驗材料:妊娠13.5d孕鼠。實驗試劑:DMEM高糖培養(yǎng)基、新生牛血清、200mmol/L谷氨酰胺、100X雙抗?jié)鈨σ骸?.25%胰蛋白酶、75%乙醇、PBS緩沖液。準備工作:(1將需用的玻璃、塑料以及手術(shù)器械清洗干凈,高壓滅菌,烘干備用。(2配置1L PBS溶液,分裝,高壓滅菌,晾至室溫后放入4°冰箱保存?zhèn)溆?配方如下:KCl 0.2

17、g, KH2PO4 0.2g, NaCl 8.0g, Na2HPO4-12H2O 2.89g, pH 7.2-7.4 (分析純(3生長培養(yǎng)基的配制:無菌條件下配置,DMEM(高糖,Gibco,1196572%,FBS(Gibco,10099 15%, NEAA (sigma, M7145 1%,青霉素和鏈霉素(100X,吉諾,151401%,L-Glutanine(100X, Gibco,25030 1%, -巰基乙醇(1000x, Gibco, 21985。(4獲得孕鼠:將1只雄性昆明鼠與3雌性昆明鼠于19:00-21:00之間合籠,第二日早8:00之前分別檢查雌鼠是否有陰栓,若有則該鼠記為

18、受孕0.5天,到受孕13.5-14.5天即可用。4.實驗步驟(1紫外線照射細胞培養(yǎng)室和超凈工作臺至少30min滅菌。進入細胞培養(yǎng)室之前,用肥皂清洗雙手,擦干并噴灑75%乙醇,換上鞋套,穿上無菌服,戴上無菌帽。(2取1只13.5d孕鼠頸椎脫臼法處死,在細胞培養(yǎng)室外,用75%乙醇浸泡3min左右。(小鼠處死后叜乙醇中消毒時間不能太短,否則起不到消毒作用,也不能時間太長,否則乙醇經(jīng)小鼠口鼻及肛門進入體內(nèi),影響細胞培養(yǎng)效果。(3從消毒乙醇中取出孕鼠,移入細胞培養(yǎng)室操作臺上,腹部朝上放于無菌10cm(直徑培養(yǎng)瓶皿上,剪開皮膚層、肌肉層,打開腹腔,將連接在子宮上的組織及脂肪剪去,將子宮取出,放到一個新的含

19、冷PBS(2%雙抗的10cm(直徑培養(yǎng)皿中,移至超凈工作臺。(PBS預(yù)冷可以有效保護細胞,防止細胞死亡,裝有冷PBS的培養(yǎng)皿裝置在冰袋上,保持低溫。(4用剪刀打開子宮壁,取出胚胎,將胚胎外的包膜小心去除,進一步去除胎鼠的頭部、尾部、四肢和各種內(nèi)臟。(5將胚胎再移入一個新的3.5cm(直徑培養(yǎng)皿中,用PBS洗3次。去除PBS,用彎頭虹膜剪將胚胎剪至13mm3大小組織塊,加入PBS清洗至溶液基本無色。將組織塊收集至15ml離心管,離心1000rpm,3分鐘。(6去上清液,加入0.25%Trypsin-EDTA(胰酶,室溫下消化510min,其間用移液器輕柔連續(xù)吹打,肉眼可以觀察到溶液渾濁變黏。(7

20、待大組織塊消失后加入等體積MEF培養(yǎng)液終止消化,用移液器輕輕吹打510次,使更多單細胞釋放出來,離心1000rpm,3分鐘,8001000r/min離心收集有細胞懸液的離心管5min,去除上清,加入培養(yǎng)液12mL(視細胞量,血細胞計數(shù)板計數(shù)。(8將細胞調(diào)整到5X105/mL左右,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,加入35mL完全培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)入二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。(9每日鏡下觀察細胞生長狀況。5.注意事項與建議(1雙抗和谷氨酰胺均為-20保存,配制細胞培養(yǎng)基時應(yīng)先將其從冰箱拿出融化,谷氨酰胺融化后仍為白色沉淀,需用手加溫并持續(xù)搖晃后方能完全溶解。(2PBS緩沖液應(yīng)提前分裝到50ml離心管后使用。(3在超凈工作

21、臺中,組織細胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久,以免溶液蒸發(fā)。(4凡在超凈工作臺外操作的步驟,各器皿需用蓋子蓋住,以防止細菌落入。(5胎鼠組織消化后收集細胞時可能帶有少量組織塊,接種后不會影響細胞的生長。6.實驗報告記錄原代細胞培養(yǎng)過程、注意事項及結(jié)果。7.思考題(1在胰酶消化胎鼠后會觀察到消化液出現(xiàn)粘稠現(xiàn)象,此種現(xiàn)象是何原因引起的,如何能夠降低消化后液體的黏稠程度?(2如何能夠提高原代細胞的產(chǎn)量?實驗四動物細胞的凍存與復(fù)蘇1. 實驗?zāi)康牧私怏w外培養(yǎng)細胞的液氮凍存與復(fù)蘇技術(shù)。2.實驗原理細胞的長期傳代培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)微生物污染或基因型改變等情況,導(dǎo)致具有優(yōu)良特性細胞系的丟失。為防止這些細胞的丟失,可以

22、將細胞快速冷凍并幾乎無限期保存在非常低的溫度下,如液氮中(-196。然而,當(dāng)溫度低于0時,細胞內(nèi)外水分都會結(jié)冰,所形成的冰呈針狀,會造成細胞膜和細胞器的嚴重損傷。因此,在凍存細胞時,要加入冷凍保護劑。常用的細胞冷凍保護劑為甘油和DMSO(二甲基亞砜,其保護機制是,在細胞冷凍懸液完全凝固之前,甘油或DMSO滲透到細胞內(nèi),在細胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的物質(zhì)的量濃度,降低細胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度,從而保護細胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷。同時,細胞內(nèi)水分也不會過分外滲,避免了細胞過分脫水皺縮。甘油和DMSO并不防止細胞內(nèi)結(jié)冰,在使用時,需要一定的時間進行預(yù)冷,讓甘油或DMSO等成分滲透到細胞內(nèi),在細胞內(nèi)外達

23、到平衡以起到充分的保護作用。目前DMSO的應(yīng)用較甘油更為廣泛,但DMSO在常溫下對細胞的毒性較大,而在4時,其毒性大大減弱,且仍能以較快速度滲透到細胞內(nèi)。所以,細胞凍存時DMSO平衡多在4下進行。而復(fù)蘇就是將細胞從低溫取出,以快速升溫的方法使細胞升到常溫,然后繼續(xù)培養(yǎng),凍存的細胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。3.實驗準備儀器設(shè)備:超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、水平吊桶離心機、倒置相差顯微鏡、水浴鍋(37、無菌培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶、移液槍、無菌吸頭、無菌15mL離心管、廢液缸、液氮凍存罐、血細胞計數(shù)板和蓋玻片,4、-20和-80冰箱。實驗試劑:DMEM高糖完全培養(yǎng)基、新生牛血清、0.25%胰蛋白酶、

24、75%乙醇、PBS緩沖液、臺盼藍溶液(0.4%溶解于PBS、DMSO。(DMSO純度應(yīng)為試劑級等級,無菌且無色(以0.22um微孔濾膜過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品,以510mL小體積分裝,4避光保存。實驗材料:原代小鼠胚胎成纖維細胞、無菌離心管/培養(yǎng)瓶、2mL凍存管、酒精棉球和擦鏡紙。4.實驗步驟4.1細胞凍存(1紫外線照射細胞培養(yǎng)室和超凈工作臺至少30min滅菌。進入細胞培養(yǎng)室之前,用肥皂清洗雙手,擦干并噴灑75%乙醇,換上鞋套,穿上無菌服,戴上無菌帽。把裝有完全培養(yǎng)基、PBS緩沖液的離心管放入37水浴鍋內(nèi)預(yù)熱1520min。(2凍存液的配制:在15mL離心管中,將新鮮DMEM高糖培養(yǎng)基、新生牛

25、血清、DMSO按7:2:1的比例混合,混勻后置于4冰箱中。(3冷凍前一日更換半量或全量培養(yǎng)基,觀察細胞生長情形。將細胞密度達80%以上的原代小鼠胚胎成纖維細胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出,在超凈工作臺中將培養(yǎng)液吸出,用預(yù)熱的PBS洗滌兩次,每次加1mL,吸掉PBS后,加入0.25%Trypsin-EDTA胰蛋白酶,在37培養(yǎng)箱中靜置孵育1min。(欲冷凍保存的細胞應(yīng)處于對數(shù)生長期且存活率高的狀態(tài)。加入胰蛋白酶的體積以液面蓋住細胞為宜。(4在倒置鏡下觀察被消化的細胞,如果細胞收縮,并且邊緣變亮,相互之間不再連接成片,在超凈工作臺中加入1ml新鮮含血清培養(yǎng)液終止消化,輕輕吹打,使細胞脫壁,制備單細胞懸液

26、,然后吸到15ml離心管中。(5以25ul臺盼藍溶液稀釋25uL細胞懸液;用血細胞計數(shù)板計數(shù)并計算細胞存活率(至少應(yīng)該在90%以上,計算細胞總數(shù)。(血細胞計數(shù)板和蓋玻片應(yīng)提前用酒精棉球和擦鏡紙擦干凈。(6將上述15ml離心管進行配平,低速8001000r/min離心5min,在超凈工作臺中將上清吸掉,加入冷凍保護液,使細胞密度為1X1061X107個/mL,然后輕輕吹打,將沉淀重懸,移至2ml凍存管中,蓋緊蓋子,并在管子上標注細胞名、代數(shù)、時間及操作人。(冷凍保護液最好提前配制,因為DMSO在稀釋時會釋放出大量的熱量,對細胞造成損傷。(7分級冷凍:先將凍存管放入4冰箱中約20min;將凍存管置

27、于冰箱冷凍室(-20約30min;用繩子將凍存管置于液氮罐的液氮的氣液相間放置過夜;最后將凍存管放置于液氮內(nèi)的盒子中,可以長久保存。(在將細胞凍存管投入液氮時,動作要小心、輕巧,以免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。若液氮濺出,可能對皮膚造成凍傷。操作過程中最好戴防凍手套、面罩,穿工作衣。(8在記錄本上做好凍存記錄,記錄內(nèi)容包括凍存日期、細胞名、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況、凍存位置及操作人員。4.2細胞復(fù)蘇(1將培養(yǎng)液置于37水浴鍋中回溫,回溫后噴以75%乙醇并擦干,移入無菌操作臺內(nèi)。(2將細胞凍存管從液氮中取出,用鑷子夾住放入37水浴鍋中,水不要沒過蓋子,快速來回晃動,在12min內(nèi)將細胞解凍,以75

28、%乙醇擦拭冷凍管外部,移入無菌操作臺內(nèi)。然后再超凈工作臺中打開蓋子,將管內(nèi)細胞液移入到15ml離心管中,然后往離心管中慢慢滴加2ml無血清DMEM高糖培養(yǎng)液,輕輕吹打管子底下,使底部細胞懸浮起來。(取出凍存管時,勿將管口對人,以防止管子蓋得不嚴,造成液氮氣化時將管子炸開?；販厮俣冗^慢時,細胞內(nèi)往往重新形成較大冰晶而造成細胞損傷?；販貢r造成的細胞損傷非?？?往往在極短的時間內(nèi)發(fā)生。無血清DMEM高糖培養(yǎng)基滴加速度要緩慢,如果滴加速度過快,則在細胞內(nèi)外滲透壓改變太快,造成細胞膜的損傷,影響細胞的活力。(3將上述細胞懸液8001000r/min離心5min,在超凈工作臺中吸掉上清,加入1mL新鮮含血

29、清培養(yǎng)液重懸沉淀,將細胞懸液移至一個新的培養(yǎng)瓶中,再補加2mL培養(yǎng)液,來回輕輕晃動培養(yǎng)液,使細胞分布均勻,移至二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。(424h后,將培養(yǎng)瓶從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出,吸掉培養(yǎng)瓶,加入2mL PBS,輕輕搖晃,吸出,重復(fù)一次,加入3mL新鮮培養(yǎng)液,送回二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。(許多冷凍保護劑,如DMSO,在低溫下能保護細胞,但在常溫下卻對細胞有害,因此在細胞復(fù)溫后應(yīng)及時洗滌冷凍保護劑。(5用倒置顯微鏡檢查細胞存活率及細胞密度,如果細胞密度過高,應(yīng)及時進行傳代。5注意事項與建議(1冷凍前及復(fù)蘇細胞操作均應(yīng)盡量快速,延長暴露在DMSO中的時間對細胞有害,而低溫冷凍過程需要逐步降低溫

30、度。(2嚴格遵守液氮操作規(guī)則(即戴上合適的手套和護目鏡,液氮對眼睛極為有害。(3自液氮或干冰容器中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊,由于熱脹冷縮過程此時蓋子易松掉。(4細胞活化后,約需數(shù)日,或繼代一至二代,其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常。6實驗報告記錄細胞凍存和復(fù)蘇流程、結(jié)果及分析。7思考題(1為什么細胞在對數(shù)生長期凍存效果最好?(2在細胞復(fù)蘇時為什么24h后要換液?動物細胞計數(shù)與存活實驗 1. 實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)掌握細胞計數(shù)、細胞存活和死亡的鑒定方法，學(xué)習(xí)鑒定細胞的活力情況。 實驗原理 培養(yǎng)細胞在接種到培養(yǎng)器皿時需要有一定密度的活細胞才能生長良好， 在細胞接種或凍 存等操作前通常要進行細胞計數(shù)。

31、細胞計數(shù)的原理和方法與血細胞計數(shù)相同。 血細胞計數(shù)板 2 一般有兩個計數(shù)室，每個計數(shù)室中細刻 9 個 1mm 大正方形，其中中央的正方形再細刻 25 個小格，深度均為 0.1mm。當(dāng)計數(shù)室上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形體積為 1.0X10-4mL。 使用時，對中間正方形內(nèi)的細胞進行計數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以 104，即為每毫升細胞懸 液中的細胞數(shù)目。 在原代細胞培養(yǎng)過程中，機械處理和胰酶消化造成部分細胞死亡；在藥物測試過程中， 加入藥物尅引起細胞死亡；對細胞的冷凍保存過程中，凍存和復(fù)蘇也會引起部分細胞死亡。 因而，在細胞培養(yǎng)實驗過程中，通常需要分析細胞群體中細胞存活和死亡的情況。臺盼藍是 一種

32、無毒或低毒的生物燃料，不能透過活細胞的細胞膜。而當(dāng)細胞死亡，細胞膜破壞，臺盼 藍能夠進入細胞而著色。因而，通過臺盼藍染色可區(qū)分死細胞與活細胞?？偧毎谢罴毎?占的百分比叫做細胞活率，通過檢查活率，可以了解細胞的存活及損傷情況。 2. 3. 實驗準備 儀器設(shè)備：超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、水平吊桶離心機、倒置相差顯微鏡、移液槍、 無菌吸頭、無菌 15mL 離心管、血細胞計數(shù)板及蓋玻片、離心管。 實驗材料：原代小鼠胚胎成纖維細胞懸液。 實驗試劑：0.4%臺盼藍、75%乙醇、PBS 緩沖液。 （0.4%臺盼藍染液配制：稱取 0.4g 臺盼 藍，加蒸餾水至 100mL，0.22um 濾膜過濾除菌和雜

33、質(zhì)，4保存?zhèn)溆谩?） 4. 實驗步驟 紫外線照射細胞培養(yǎng)室和超凈工作臺至少 30min 滅菌。進入細胞培養(yǎng)室之前，用肥皂 清洗雙手，擦干并噴灑 75%乙醇，換上鞋套，穿上無菌服，戴上無菌帽。 4.1 細胞計數(shù) （1） 將血細胞計數(shù)板及蓋玻片用酒精棉球和擦鏡紙擦拭干凈，并將蓋玻片蓋上計數(shù) 板上。 （2） 將細胞懸液混勻，吸出少許，自血細胞計數(shù)板計數(shù)室上方凹槽加入，使懸液充 滿蓋玻片和計數(shù)板之間，靜止 3min。 （3） 放于倒置顯微鏡下，選擇 10 倍物鏡觀察，計算計數(shù)板中央大格細胞總數(shù)，壓線 細胞只計算左側(cè)和上方的，每 1mm2 的細胞數(shù)在 100 個以內(nèi)。 （如果視野內(nèi)的細 2 胞過多（10

34、0 個/mm ）,只需要計算中心大方格對角線上的 5 個小方格，得到 的細胞數(shù) X5。如果細胞密度過大，需對細胞懸液稀釋后計數(shù)。 ） （4） 按下式計算細胞數(shù) 每毫升細胞數(shù)=中央大格細胞總數(shù) X10 000 X 稀釋倍數(shù) 4.2 細胞活力檢測 （1） 將細胞懸液 0.2mL 加入離心管中。 （2） 加入 0.2mL 0.4%臺盼藍染液，染色 23min。 （3） 吸取少許懸液涂于載玻片上，加入蓋玻片。 （4） 鏡下取 5 個任意視野分別記錄死細胞和活細胞數(shù)，計算細胞活力。 死細胞能被臺盼藍染上藍色，鏡下可見深藍色的細胞，活細胞不被染色，鏡下 呈無色透明狀。 5 注意事項與建議 （1） 細胞計數(shù)

35、時鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算，若細胞團占 10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。 （2） 細胞活力分析和細胞計數(shù)可以同時進行。細胞進行臺盼藍染色后，先記活細胞數(shù)，再 記細胞總數(shù)，可以得出單位體積內(nèi)的活細胞數(shù)和單位體積內(nèi)的細胞總數(shù)。 哺乳動物細胞的傳代培養(yǎng) 1. 實驗?zāi)康?（1） 了解哺乳動物傳代細胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識。 （2） 通過觀察，學(xué)會使用鏡檢判定體外細胞生長的狀況。 （3） 熟練掌握動物細胞的傳代培養(yǎng)方法。 2. 實驗原理 當(dāng)原代培養(yǎng)的細胞或者細胞株持續(xù)生長、繁殖，造成密度過大、生存空間不足時，就要 進行傳代，稱之為傳代培養(yǎng)。把原代培養(yǎng)的細胞連續(xù)傳代即稱為細胞系。從原代或傳代 培養(yǎng)的細胞中選擇出具有特殊性質(zhì)或特征的細胞，使其克隆化，并在以后的連續(xù)培養(yǎng)中 保持這種特殊性質(zhì)或特征，即稱為細胞株。傳代培養(yǎng)時，通常是以一定的比例將細胞轉(zhuǎn) 移到另外的培養(yǎng)容器中進行擴大培養(yǎng)。細胞按照是否貼壁生長可以分為 3 類：1.貼壁細 胞，此類細胞貼壁較牢，采用酶消化法進行傳代；2.半貼壁半懸浮細胞，此類細胞呈貼 壁狀態(tài)生長，但貼壁不牢，傳代時可直接將其吹打下來；3.懸浮細胞，可通過離心收集 細胞，然后去除上清，再重新接種。傳代培養(yǎng)也是