動(dòng)物細(xì)胞工程試驗(yàn)講義(學(xué)生版)

1、實(shí)驗(yàn)一細(xì)胞培養(yǎng)用品的清洗、消毒與滅菌體外人工培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏抗感染能力,所以能否防止污染是決定培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。即便使用設(shè)備完善的實(shí)驗(yàn)室,若實(shí)驗(yàn)者粗心大意,技術(shù)操作不規(guī)范,也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞污染。無菌技術(shù)原理是阻止無菌的、未被污染的物體與任何有菌的、被污染的物體相接觸。任何直接或間接地與培養(yǎng)細(xì)胞相接觸的物體必須經(jīng)過嚴(yán)格的清洗和消毒程序。1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆占?xì)胞培養(yǎng)中所使用的器械的清洗與消毒方法。2.實(shí)驗(yàn)原理清洗時(shí)采用化學(xué)藥劑清除物體表面污垢的方法,它是借助清潔劑對(duì)物體表面污染物或覆蓋層進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化、溶解、剝離以達(dá)到脫脂、除銹和去污的效果。消毒是指殺死病原微生物(但不一定能殺死細(xì)胞芽孢的方法。通常用化學(xué)方法來

2、達(dá)到消毒的作用。滅菌可除去或殺滅物體中全部微生物。應(yīng)根據(jù)微生物的種類、污染狀況、被污染物體的性質(zhì)與狀態(tài),選擇單獨(dú)或組合滅菌方法。能否達(dá)到滅菌的目的,通常要采用無菌實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行判定。對(duì)滅菌操作時(shí)采用的溫度、壓力等能否適合滅菌的條件,必須得到十分的確認(rèn)。在滅菌條件選定后,還要進(jìn)行滅菌效果的確認(rèn),以保證使用的各種滅菌條件適合于要?dú)绲哪繕?biāo)菌。滅菌的程度受滅菌的時(shí)間與滅菌劑強(qiáng)度的制約。滅菌常用的方法有化學(xué)試劑滅菌法、射線滅菌法、干熱滅菌法、濕熱滅菌法和過濾除菌法等?？筛鶕?jù)不同的需求,采用不同的方法,如培養(yǎng)基滅菌一般采用濕熱滅菌法,空氣滅菌則采用過濾除菌法。3.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備儀器設(shè)備:超凈工作臺(tái)、超聲清洗器、高

3、壓滅菌鍋、干燥箱、過濾器、紫外燈、0.22um 微孔濾膜、電磁爐、電子分析天平、鋁箔、試管刷等。實(shí)驗(yàn)材料:玻璃器皿(三角瓶、燒杯、量筒、試劑瓶塑料器皿(離心管、吸頭等、眼科剪刀、眼科鑷、金屬飯盒、報(bào)紙等。主要試劑:75%乙醇、鹽酸、0.2%的新潔爾滅、高錳酸鉀、重鉻酸鉀、濃硫酸、次氯酸鈉(NaClO、洗滌劑、蒸餾水、去離子水等。4.試驗(yàn)方法4.1 玻璃器皿的清洗(1浸泡:初次使用和培養(yǎng)用的玻璃器皿都需要先用清水浸泡,水要完全進(jìn)入器皿中,不要留有氣泡。新使用的器皿,用清水沖洗后放入鹽酸溶液(5%中浸泡過夜。(鹽酸浸泡主要是為了中和其中的堿性物質(zhì)。(2刷洗:浸泡后的玻璃器皿要用軟毛刷蘸洗滌劑刷洗,

4、以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)。(刷洗次數(shù)太多,會(huì)損害器皿表面光澤度,所以要選擇軟毛刷,切不可使用含沙粒的去污粉。(3浸酸:刷洗不掉的極微量雜質(zhì)要用硫酸和重鉻酸鉀清洗液浸泡,它們經(jīng)過強(qiáng)氧化作用后,可被除掉。(清洗液具有腐蝕性,使用時(shí)要帶耐酸性手套。新配制的清洗液為棕紅色,遇有機(jī)溶劑或水分增加時(shí)變成綠色,表明其失效。浸泡時(shí),放入器皿要緩慢,防止發(fā)生迸濺。器皿要充滿清潔液,浸泡時(shí)間不應(yīng)少于6h,一般浸泡過夜。(4沖洗:將經(jīng)過上述步驟處理的玻璃器皿用清水沖洗5-10遍,放入蒸餾水中漂洗3-5遍?？馗?用牛皮紙包好。然后置于干燥箱中,50度烤干,備用。(流水清洗時(shí)水流應(yīng)保持不斷,每次應(yīng)將水灌滿器皿并倒干

5、凈,以去除殘余的洗滌劑。干燥器皿時(shí)不要擺放過緊,以免阻礙熱空氣的流通。4.2 塑料制品的清洗(1器皿用后立即用流水沖洗或浸泡于自來水中過夜。(2用2%NaOH溶液或含NaClO的蒸餾水浸泡過夜。(3然后用自來水沖洗,如用NaOH溶液浸泡的,還需再用5%鹽酸浸泡15-30min。(如果殘留附著物,可用紗布或棉簽刷洗。(4用盛有50-60度蒸餾水的超聲波儀,超聲波清洗30min。(5用蒸餾水沖洗3-5遍,放入烘箱中50度烤干,備用。4.3手術(shù)器械的清洗手術(shù)器械等用酒精棉球擦拭干凈,確保器械上面沒有污染物,裝入鋁制飯盒中,用報(bào)紙包裹好。4.4高壓蒸汽滅菌將所有清洗干凈的玻璃器皿、塑料制品以及手術(shù)器械

6、包裹好放入高壓滅菌鍋中,常用滅菌條件為壓力0.15MPa,溫度121度,15-30min。(蒸汽溫度達(dá)到121度,能將耐熱的芽孢在30min 內(nèi)全部殺死。滅菌時(shí),消毒物品不能裝得過滿,以保證鍋內(nèi)氣體流通。4.5無菌培養(yǎng)室的消毒(1用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次(拖布要專用,然后打開紫外燈照射消毒30-50min.(2用75%乙醇擦洗超凈工作臺(tái)臺(tái)面,然后用紫外燈消毒30min。(3在無菌環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)或做其他無菌工作時(shí),首先要點(diǎn)燃酒精燈。以后一切操作,如安裝吸管冒、打開或封閉瓶口等,都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。5.注意事項(xiàng)與建議(1消毒時(shí)超凈工作臺(tái)臺(tái)面上用品不要過多或重疊放置,否則會(huì)遮擋紫外

7、線,降低消毒效果。(2金屬器械不能再外焰中燒得時(shí)間過長(zhǎng),以防金屬退火,燒過的金屬鑷要待冷卻后才能挾取組織,以免造成組織損傷。(3濕熱滅菌后的器皿應(yīng)在干燥箱中60°C烘干,待器皿完全干燥并經(jīng)75%乙醇噴灑消毒后再移到無菌操作間使用。(4吸取營養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼,因?yàn)闅埩粼谖茴^中的營養(yǎng)液會(huì)燒焦想成碳膜,再用時(shí)會(huì)把有害物質(zhì)帶入營養(yǎng)液中。(5膠塞經(jīng)過火焰時(shí)也不能時(shí)間過長(zhǎng),以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體,危害培養(yǎng)細(xì)胞。(6玻璃器皿使用后應(yīng)立即投入清水中浸泡;刷洗、酸泡后的器皿要用流水振蕩沖洗,不得殘留洗滌劑、清潔液;煮沸前的水面要高于器皿5cm。(7膠塞洗刷的重點(diǎn)部位是膠塞使用面,應(yīng)用軟毛刷

8、逐個(gè)刷洗。在使用過程中,膠塞不能與培養(yǎng)液接觸,以防未洗凈的膠塞污染培養(yǎng)液和細(xì)胞。干熱滅菌的器皿應(yīng)在烘箱溫度降至60°C以下再打開取出,經(jīng)75%乙醇噴灑消毒后再移到無菌操作間使用。(8帶有螺口蓋的血清瓶或試劑瓶只能濕熱滅菌,滅菌時(shí)瓶蓋用鋁箔紙或牛皮紙包裹,滅菌過程中瓶蓋應(yīng)稍擰松,以利于濕熱氣體進(jìn)入瓶?jī)?nèi),滅菌結(jié)束后待玻璃瓶冷卻后將蓋擰緊。也可以將玻璃瓶和瓶蓋分開各自包裹滅菌,玻璃部分干熱滅菌,塑料部分濕熱滅菌。(9細(xì)胞培養(yǎng)用器皿最好專門用于細(xì)胞培養(yǎng),不要與其他實(shí)驗(yàn)混用。6. 實(shí)驗(yàn)報(bào)告簡(jiǎn)述細(xì)胞培養(yǎng)用的玻璃器皿與塑料器皿的清洗和消毒流程。7. 思考題(1細(xì)胞培養(yǎng)中如果使用橡膠制品該如何清洗消

9、毒?(2為什么使用過的器皿要立即浸泡在含有消毒液的蒸餾水中?實(shí)驗(yàn)二小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1了解小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離原理。(2掌握小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離的貼壁篩選法。2.實(shí)驗(yàn)原理小鼠骨髓基質(zhì)中存在著間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC是一種除造血干細(xì)胞以外,具有多向分化潛能的干細(xì)胞,可以向骨、軟骨、肌肉、皮膚、脂肪等多種細(xì)胞類型分化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有易在體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)和擴(kuò)增及免疫原性等特性,被認(rèn)為在基因治療、細(xì)胞治療、組織工程等領(lǐng)域具有廣泛臨床應(yīng)用前景。從骨髓中分離MSC的方案主要有:1.根據(jù)骨髓MSC的底物黏附特性來實(shí)現(xiàn)分離的貼壁篩

10、選法;2. 根據(jù)MSC與其他細(xì)胞密度不同來分離的密度梯度離心法;3.根據(jù)細(xì)胞大小不同或者根據(jù)細(xì)胞表面的一些特殊標(biāo)志來分離的流式細(xì)胞儀分選法。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)干細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中有貼壁優(yōu)勢(shì),定期換液去除不貼壁細(xì)胞,從而達(dá)到純化及擴(kuò)增MSC的目的。3.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)設(shè)備:超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、水平吊桶離心機(jī)、倒置相差顯微鏡、水浴鍋(37、無菌培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶、移液槍、無菌吸頭、無菌15mL離心管、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)器、記號(hào)筆。實(shí)驗(yàn)試劑:含10%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基、PBS緩沖液、75%乙醇。實(shí)驗(yàn)材料:健康4周齡BALB/c品系小鼠、培養(yǎng)瓶。準(zhǔn)備工作:(1將需用的玻璃、塑料以及手術(shù)器械清

11、洗干凈,高壓滅菌,烘干備用。(2配置1L PBS溶液,分裝,高壓滅菌,晾至室溫后放入4°冰箱保存?zhèn)溆?配方如下:KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, NaCl 8.0g, Na2HPO4-12H2O 2.89g, pH 7.2-7.4 (藥品分析純(3生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制:無菌條件下配置,-MEM(Gibco82%,FBS(Gibco, 1009915%, NEAA (sigma, M7145 1%,青霉素和鏈霉素(100X,吉諾,151401%,L-Glutanine(100X, Gibco,25030 1%, bFGF(RD,終濃度4ng/ml。4.實(shí)驗(yàn)方法(1紫外線照射細(xì)胞

12、培養(yǎng)室和超凈工作臺(tái)至少30min滅菌。進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室之前,用肥皂清洗雙手,擦干并噴灑75%乙醇,穿無菌服、戴無菌帽。把裝有培養(yǎng)液、PBS液的離心管放入37水浴鍋內(nèi)預(yù)熱15-20min。(2健康4周齡BALB/c雌性小鼠,頸椎脫臼法處死,75%乙醇浸泡5min。(小鼠處死后再消毒乙醇中浸泡時(shí)間不能太短,否則起不到消毒作用,也不能時(shí)間太長(zhǎng),時(shí)間長(zhǎng)乙醇經(jīng)口鼻及肛門進(jìn)入體內(nèi),影響細(xì)胞培養(yǎng)效果。(3取出小鼠,移入細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi),置于超凈工作臺(tái)上,無菌條件下取出股骨和脛骨,解剖刀去除多余的肌肉組織,兩端剪斷暴露骨髓腔。用1mL注射器吸取少量DMEM/F12培養(yǎng)基,從骨髓腔的一頭插入,將沖出骨髓,然后將股骨和

13、脛骨夾碎,以培養(yǎng)基反復(fù)沖洗,將沖洗液收集至無菌離心管中,制備細(xì)胞懸液。(為了避免沖起許多氣泡,應(yīng)緩慢沖,沖洗的次數(shù)不應(yīng)太多。(4用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù),細(xì)胞計(jì)數(shù)后用含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至有核細(xì)胞5X106個(gè)/mL,以2X106個(gè)/cm2密度接種至培養(yǎng)瓶中,置于37、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(524h后首次全部更換培養(yǎng)液去除未貼壁細(xì)胞,此時(shí)貼壁生長(zhǎng)的MSC數(shù)量較少,分散存在,呈稍扁的梭形。以后每3d全量換液,隨著MSC的迅速擴(kuò)增,十多天以后有較大的細(xì)胞克隆生長(zhǎng)出來。(6等細(xì)胞克隆80%90%融合時(shí)傳代,吸出培養(yǎng)基,以PBS緩沖液洗2

14、次,以0.25%胰酶消化23min,用完全培養(yǎng)基終止消化后,1000r/min離心5min,棄上清后用完全培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞,以1:2的比例接種于培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增培養(yǎng),置于37、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體積較小,呈梭形或多角形,核質(zhì)比大。高密度時(shí)細(xì)胞通常平行排列或漩渦狀生長(zhǎng)。6.注意事項(xiàng)與建議(1原代或傳代細(xì)胞中如觀察到少量成片雜細(xì)胞,可直接鏡下瓶底標(biāo)記后,在超凈工作臺(tái)里面用吸管尖端機(jī)械刮除,吸出去掉。(2在細(xì)胞生長(zhǎng)至密度較高時(shí)換液要輕柔,不要將液體直接吹向細(xì)胞,防止細(xì)胞漂起。7.實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)流程、結(jié)果及分析。8.思考題(1骨髓間充質(zhì)

15、干細(xì)胞有何特點(diǎn)?如何鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞?(2在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)中如何去除雜細(xì)胞?實(shí)驗(yàn)三原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的制備及培養(yǎng)1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆招∈蟪衫w維細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法和步驟,熟悉培養(yǎng)細(xì)胞的觀察方法,了解體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的基本形態(tài)。2.實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。原代培養(yǎng),也叫初代培養(yǎng),是指由體內(nèi)取出組織,經(jīng)消化酶(常用胰蛋白酶或膠原酶、螯合劑(常用EDTA或機(jī)械方法處理,將其分散成單細(xì)胞,置于合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖,這一過程稱原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細(xì)胞離體時(shí)間短,遺傳性狀和體內(nèi)細(xì)胞相似,適于做細(xì)胞形態(tài)、功能和分化等研究。原代培養(yǎng)細(xì)胞移動(dòng)性強(qiáng),細(xì)胞分裂不旺盛

16、,存在異質(zhì)性細(xì)胞。3.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備儀器設(shè)備:超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、水平吊桶離心機(jī)、倒置相差顯微鏡、水浴鍋(37、無菌培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶、移液槍、無菌吸頭、無菌15mL離心管、實(shí)體解剖顯微鏡、眼科剪刀、眼科鑷、廢液缸、計(jì)時(shí)器、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)器、記號(hào)筆。實(shí)驗(yàn)材料:妊娠13.5d孕鼠。實(shí)驗(yàn)試劑:DMEM高糖培養(yǎng)基、新生牛血清、200mmol/L谷氨酰胺、100X雙抗?jié)鈨?chǔ)液、0.25%胰蛋白酶、75%乙醇、PBS緩沖液。準(zhǔn)備工作:(1將需用的玻璃、塑料以及手術(shù)器械清洗干凈,高壓滅菌,烘干備用。(2配置1L PBS溶液,分裝,高壓滅菌,晾至室溫后放入4°冰箱保存?zhèn)溆?配方如下:KCl 0.2

17、g, KH2PO4 0.2g, NaCl 8.0g, Na2HPO4-12H2O 2.89g, pH 7.2-7.4 (分析純(3生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制:無菌條件下配置,DMEM(高糖,Gibco,1196572%,FBS(Gibco,10099 15%, NEAA (sigma, M7145 1%,青霉素和鏈霉素(100X,吉諾,151401%,L-Glutanine(100X, Gibco,25030 1%, -巰基乙醇(1000x, Gibco, 21985。(4獲得孕鼠:將1只雄性昆明鼠與3雌性昆明鼠于19:00-21:00之間合籠,第二日早8:00之前分別檢查雌鼠是否有陰栓,若有則該鼠記為

18、受孕0.5天,到受孕13.5-14.5天即可用。4.實(shí)驗(yàn)步驟(1紫外線照射細(xì)胞培養(yǎng)室和超凈工作臺(tái)至少30min滅菌。進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室之前,用肥皂清洗雙手,擦干并噴灑75%乙醇,換上鞋套,穿上無菌服,戴上無菌帽。(2取1只13.5d孕鼠頸椎脫臼法處死,在細(xì)胞培養(yǎng)室外,用75%乙醇浸泡3min左右。(小鼠處死后叜乙醇中消毒時(shí)間不能太短,否則起不到消毒作用,也不能時(shí)間太長(zhǎng),否則乙醇經(jīng)小鼠口鼻及肛門進(jìn)入體內(nèi),影響細(xì)胞培養(yǎng)效果。(3從消毒乙醇中取出孕鼠,移入細(xì)胞培養(yǎng)室操作臺(tái)上,腹部朝上放于無菌10cm(直徑培養(yǎng)瓶皿上,剪開皮膚層、肌肉層,打開腹腔,將連接在子宮上的組織及脂肪剪去,將子宮取出,放到一個(gè)新的含

19、冷PBS(2%雙抗的10cm(直徑培養(yǎng)皿中,移至超凈工作臺(tái)。(PBS預(yù)冷可以有效保護(hù)細(xì)胞,防止細(xì)胞死亡,裝有冷PBS的培養(yǎng)皿裝置在冰袋上,保持低溫。(4用剪刀打開子宮壁,取出胚胎,將胚胎外的包膜小心去除,進(jìn)一步去除胎鼠的頭部、尾部、四肢和各種內(nèi)臟。(5將胚胎再移入一個(gè)新的3.5cm(直徑培養(yǎng)皿中,用PBS洗3次。去除PBS,用彎頭虹膜剪將胚胎剪至13mm3大小組織塊,加入PBS清洗至溶液基本無色。將組織塊收集至15ml離心管,離心1000rpm,3分鐘。(6去上清液,加入0.25%Trypsin-EDTA(胰酶,室溫下消化510min,其間用移液器輕柔連續(xù)吹打,肉眼可以觀察到溶液渾濁變黏。(7

20、待大組織塊消失后加入等體積MEF培養(yǎng)液終止消化,用移液器輕輕吹打510次,使更多單細(xì)胞釋放出來,離心1000rpm,3分鐘,8001000r/min離心收集有細(xì)胞懸液的離心管5min,去除上清,加入培養(yǎng)液12mL(視細(xì)胞量,血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。(8將細(xì)胞調(diào)整到5X105/mL左右,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,加入35mL完全培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)入二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。(9每日鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。5.注意事項(xiàng)與建議(1雙抗和谷氨酰胺均為-20保存,配制細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)先將其從冰箱拿出融化,谷氨酰胺融化后仍為白色沉淀,需用手加溫并持續(xù)搖晃后方能完全溶解。(2PBS緩沖液應(yīng)提前分裝到50ml離心管后使用。(3在超凈工作

21、臺(tái)中,組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久,以免溶液蒸發(fā)。(4凡在超凈工作臺(tái)外操作的步驟,各器皿需用蓋子蓋住,以防止細(xì)菌落入。(5胎鼠組織消化后收集細(xì)胞時(shí)可能帶有少量組織塊,接種后不會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。6.實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄原代細(xì)胞培養(yǎng)過程、注意事項(xiàng)及結(jié)果。7.思考題(1在胰酶消化胎鼠后會(huì)觀察到消化液出現(xiàn)粘稠現(xiàn)象,此種現(xiàn)象是何原因引起的,如何能夠降低消化后液體的黏稠程度?(2如何能夠提高原代細(xì)胞的產(chǎn)量?實(shí)驗(yàn)四動(dòng)物細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私怏w外培養(yǎng)細(xì)胞的液氮凍存與復(fù)蘇技術(shù)。2.實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞的長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)微生物污染或基因型改變等情況,導(dǎo)致具有優(yōu)良特性細(xì)胞系的丟失。為防止這些細(xì)胞的丟失,可以

22、將細(xì)胞快速冷凍并幾乎無限期保存在非常低的溫度下,如液氮中(-196。然而,當(dāng)溫度低于0時(shí),細(xì)胞內(nèi)外水分都會(huì)結(jié)冰,所形成的冰呈針狀,會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的嚴(yán)重?fù)p傷。因此,在凍存細(xì)胞時(shí),要加入冷凍保護(hù)劑。常用的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑為甘油和DMSO(二甲基亞砜,其保護(hù)機(jī)制是,在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前,甘油或DMSO滲透到細(xì)胞內(nèi),在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的物質(zhì)的量濃度,降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度,從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷。同時(shí),細(xì)胞內(nèi)水分也不會(huì)過分外滲,避免了細(xì)胞過分脫水皺縮。甘油和DMSO并不防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰,在使用時(shí),需要一定的時(shí)間進(jìn)行預(yù)冷,讓甘油或DMSO等成分滲透到細(xì)胞內(nèi),在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)

23、到平衡以起到充分的保護(hù)作用。目前DMSO的應(yīng)用較甘油更為廣泛,但DMSO在常溫下對(duì)細(xì)胞的毒性較大,而在4時(shí),其毒性大大減弱,且仍能以較快速度滲透到細(xì)胞內(nèi)。所以,細(xì)胞凍存時(shí)DMSO平衡多在4下進(jìn)行。而復(fù)蘇就是將細(xì)胞從低溫取出,以快速升溫的方法使細(xì)胞升到常溫,然后繼續(xù)培養(yǎng),凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。3.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備儀器設(shè)備:超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、水平吊桶離心機(jī)、倒置相差顯微鏡、水浴鍋(37、無菌培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶、移液槍、無菌吸頭、無菌15mL離心管、廢液缸、液氮凍存罐、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板和蓋玻片,4、-20和-80冰箱。實(shí)驗(yàn)試劑:DMEM高糖完全培養(yǎng)基、新生牛血清、0.25%胰蛋白酶、

24、75%乙醇、PBS緩沖液、臺(tái)盼藍(lán)溶液(0.4%溶解于PBS、DMSO。(DMSO純度應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),無菌且無色(以0.22um微孔濾膜過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品,以510mL小體積分裝,4避光保存。實(shí)驗(yàn)材料:原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、無菌離心管/培養(yǎng)瓶、2mL凍存管、酒精棉球和擦鏡紙。4.實(shí)驗(yàn)步驟4.1細(xì)胞凍存(1紫外線照射細(xì)胞培養(yǎng)室和超凈工作臺(tái)至少30min滅菌。進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室之前,用肥皂清洗雙手,擦干并噴灑75%乙醇,換上鞋套,穿上無菌服,戴上無菌帽。把裝有完全培養(yǎng)基、PBS緩沖液的離心管放入37水浴鍋內(nèi)預(yù)熱1520min。(2凍存液的配制:在15mL離心管中,將新鮮DMEM高糖培養(yǎng)基、新生牛

25、血清、DMSO按7:2:1的比例混合,混勻后置于4冰箱中。(3冷凍前一日更換半量或全量培養(yǎng)基,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形。將細(xì)胞密度達(dá)80%以上的原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出,在超凈工作臺(tái)中將培養(yǎng)液吸出,用預(yù)熱的PBS洗滌兩次,每次加1mL,吸掉PBS后,加入0.25%Trypsin-EDTA胰蛋白酶,在37培養(yǎng)箱中靜置孵育1min。(欲冷凍保存的細(xì)胞應(yīng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且存活率高的狀態(tài)。加入胰蛋白酶的體積以液面蓋住細(xì)胞為宜。(4在倒置鏡下觀察被消化的細(xì)胞,如果細(xì)胞收縮,并且邊緣變亮,相互之間不再連接成片,在超凈工作臺(tái)中加入1ml新鮮含血清培養(yǎng)液終止消化,輕輕吹打,使細(xì)胞脫壁,制備單細(xì)胞懸液

26、,然后吸到15ml離心管中。(5以25ul臺(tái)盼藍(lán)溶液稀釋25uL細(xì)胞懸液;用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞存活率(至少應(yīng)該在90%以上,計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板和蓋玻片應(yīng)提前用酒精棉球和擦鏡紙擦干凈。(6將上述15ml離心管進(jìn)行配平,低速8001000r/min離心5min,在超凈工作臺(tái)中將上清吸掉,加入冷凍保護(hù)液,使細(xì)胞密度為1X1061X107個(gè)/mL,然后輕輕吹打,將沉淀重懸,移至2ml凍存管中,蓋緊蓋子,并在管子上標(biāo)注細(xì)胞名、代數(shù)、時(shí)間及操作人。(冷凍保護(hù)液最好提前配制,因?yàn)镈MSO在稀釋時(shí)會(huì)釋放出大量的熱量,對(duì)細(xì)胞造成損傷。(7分級(jí)冷凍:先將凍存管放入4冰箱中約20min;將凍存管置

27、于冰箱冷凍室(-20約30min;用繩子將凍存管置于液氮罐的液氮的氣液相間放置過夜;最后將凍存管放置于液氮內(nèi)的盒子中,可以長(zhǎng)久保存。(在將細(xì)胞凍存管投入液氮時(shí),動(dòng)作要小心、輕巧,以免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。若液氮濺出,可能對(duì)皮膚造成凍傷。操作過程中最好戴防凍手套、面罩,穿工作衣。(8在記錄本上做好凍存記錄,記錄內(nèi)容包括凍存日期、細(xì)胞名、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況、凍存位置及操作人員。4.2細(xì)胞復(fù)蘇(1將培養(yǎng)液置于37水浴鍋中回溫,回溫后噴以75%乙醇并擦干,移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。(2將細(xì)胞凍存管從液氮中取出,用鑷子夾住放入37水浴鍋中,水不要沒過蓋子,快速來回晃動(dòng),在12min內(nèi)將細(xì)胞解凍,以75

28、%乙醇擦拭冷凍管外部,移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。然后再超凈工作臺(tái)中打開蓋子,將管內(nèi)細(xì)胞液移入到15ml離心管中,然后往離心管中慢慢滴加2ml無血清DMEM高糖培養(yǎng)液,輕輕吹打管子底下,使底部細(xì)胞懸浮起來。(取出凍存管時(shí),勿將管口對(duì)人,以防止管子蓋得不嚴(yán),造成液氮?dú)饣瘯r(shí)將管子炸開。回溫速度過慢時(shí),細(xì)胞內(nèi)往往重新形成較大冰晶而造成細(xì)胞損傷。回溫時(shí)造成的細(xì)胞損傷非?？?往往在極短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生。無血清DMEM高糖培養(yǎng)基滴加速度要緩慢,如果滴加速度過快,則在細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變太快,造成細(xì)胞膜的損傷,影響細(xì)胞的活力。(3將上述細(xì)胞懸液8001000r/min離心5min,在超凈工作臺(tái)中吸掉上清,加入1mL新鮮含血

29、清培養(yǎng)液重懸沉淀,將細(xì)胞懸液移至一個(gè)新的培養(yǎng)瓶中,再補(bǔ)加2mL培養(yǎng)液,來回輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)液,使細(xì)胞分布均勻,移至二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。(424h后,將培養(yǎng)瓶從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出,吸掉培養(yǎng)瓶,加入2mL PBS,輕輕搖晃,吸出,重復(fù)一次,加入3mL新鮮培養(yǎng)液,送回二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。(許多冷凍保護(hù)劑,如DMSO,在低溫下能保護(hù)細(xì)胞,但在常溫下卻對(duì)細(xì)胞有害,因此在細(xì)胞復(fù)溫后應(yīng)及時(shí)洗滌冷凍保護(hù)劑。(5用倒置顯微鏡檢查細(xì)胞存活率及細(xì)胞密度,如果細(xì)胞密度過高,應(yīng)及時(shí)進(jìn)行傳代。5注意事項(xiàng)與建議(1冷凍前及復(fù)蘇細(xì)胞操作均應(yīng)盡量快速,延長(zhǎng)暴露在DMSO中的時(shí)間對(duì)細(xì)胞有害,而低溫冷凍過程需要逐步降低溫

30、度。(2嚴(yán)格遵守液氮操作規(guī)則(即戴上合適的手套和護(hù)目鏡,液氮對(duì)眼睛極為有害。(3自液氮或干冰容器中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊,由于熱脹冷縮過程此時(shí)蓋子易松掉。(4細(xì)胞活化后,約需數(shù)日,或繼代一至二代,其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常。6實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄細(xì)胞凍存和復(fù)蘇流程、結(jié)果及分析。7思考題(1為什么細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期凍存效果最好?(2在細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)為什么24h后要換液?動(dòng)物細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活實(shí)驗(yàn) 1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)掌握細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞存活和死亡的鑒定方法，學(xué)習(xí)鑒定細(xì)胞的活力情況。 實(shí)驗(yàn)原理 培養(yǎng)細(xì)胞在接種到培養(yǎng)器皿時(shí)需要有一定密度的活細(xì)胞才能生長(zhǎng)良好， 在細(xì)胞接種或凍 存等操作前通常要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

31、細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 2 一般有兩個(gè)計(jì)數(shù)室，每個(gè)計(jì)數(shù)室中細(xì)刻 9 個(gè) 1mm 大正方形，其中中央的正方形再細(xì)刻 25 個(gè)小格，深度均為 0.1mm。當(dāng)計(jì)數(shù)室上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形體積為 1.0X10-4mL。 使用時(shí)，對(duì)中間正方形內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以 104，即為每毫升細(xì)胞懸 液中的細(xì)胞數(shù)目。 在原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中，機(jī)械處理和胰酶消化造成部分細(xì)胞死亡；在藥物測(cè)試過程中， 加入藥物尅引起細(xì)胞死亡；對(duì)細(xì)胞的冷凍保存過程中，凍存和復(fù)蘇也會(huì)引起部分細(xì)胞死亡。 因而，在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過程中，通常需要分析細(xì)胞群體中細(xì)胞存活和死亡的情況。臺(tái)盼藍(lán)是 一種

32、無毒或低毒的生物燃料，不能透過活細(xì)胞的細(xì)胞膜。而當(dāng)細(xì)胞死亡，細(xì)胞膜破壞，臺(tái)盼 藍(lán)能夠進(jìn)入細(xì)胞而著色。因而，通過臺(tái)盼藍(lán)染色可區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞?？偧?xì)胞中活細(xì)胞所 占的百分比叫做細(xì)胞活率，通過檢查活率，可以了解細(xì)胞的存活及損傷情況。 2. 3. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、水平吊桶離心機(jī)、倒置相差顯微鏡、移液槍、 無菌吸頭、無菌 15mL 離心管、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板及蓋玻片、離心管。 實(shí)驗(yàn)材料：原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞懸液。 實(shí)驗(yàn)試劑：0.4%臺(tái)盼藍(lán)、75%乙醇、PBS 緩沖液。 （0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液配制：稱取 0.4g 臺(tái)盼 藍(lán)，加蒸餾水至 100mL，0.22um 濾膜過濾除菌和雜

33、質(zhì)，4保存?zhèn)溆谩?） 4. 實(shí)驗(yàn)步驟 紫外線照射細(xì)胞培養(yǎng)室和超凈工作臺(tái)至少 30min 滅菌。進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室之前，用肥皂 清洗雙手，擦干并噴灑 75%乙醇，換上鞋套，穿上無菌服，戴上無菌帽。 4.1 細(xì)胞計(jì)數(shù) （1） 將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板及蓋玻片用酒精棉球和擦鏡紙擦拭干凈，并將蓋玻片蓋上計(jì)數(shù) 板上。 （2） 將細(xì)胞懸液混勻，吸出少許，自血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室上方凹槽加入，使懸液充 滿蓋玻片和計(jì)數(shù)板之間，靜止 3min。 （3） 放于倒置顯微鏡下，選擇 10 倍物鏡觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板中央大格細(xì)胞總數(shù)，壓線 細(xì)胞只計(jì)算左側(cè)和上方的，每 1mm2 的細(xì)胞數(shù)在 100 個(gè)以內(nèi)。 （如果視野內(nèi)的細(xì) 2 胞過多（10

34、0 個(gè)/mm ）,只需要計(jì)算中心大方格對(duì)角線上的 5 個(gè)小方格，得到 的細(xì)胞數(shù) X5。如果細(xì)胞密度過大，需對(duì)細(xì)胞懸液稀釋后計(jì)數(shù)。 ） （4） 按下式計(jì)算細(xì)胞數(shù) 每毫升細(xì)胞數(shù)=中央大格細(xì)胞總數(shù) X10 000 X 稀釋倍數(shù) 4.2 細(xì)胞活力檢測(cè) （1） 將細(xì)胞懸液 0.2mL 加入離心管中。 （2） 加入 0.2mL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液，染色 23min。 （3） 吸取少許懸液涂于載玻片上，加入蓋玻片。 （4） 鏡下取 5 個(gè)任意視野分別記錄死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活力。 死細(xì)胞能被臺(tái)盼藍(lán)染上藍(lán)色，鏡下可見深藍(lán)色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下 呈無色透明狀。 5 注意事項(xiàng)與建議 （1） 細(xì)胞計(jì)數(shù)

35、時(shí)鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占 10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。 （2） 細(xì)胞活力分析和細(xì)胞計(jì)數(shù)可以同時(shí)進(jìn)行。細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色后，先記活細(xì)胞數(shù)，再 記細(xì)胞總數(shù)，可以得出單位體積內(nèi)的活細(xì)胞數(shù)和單位體積內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?（1） 了解哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識(shí)。 （2） 通過觀察，學(xué)會(huì)使用鏡檢判定體外細(xì)胞生長(zhǎng)的狀況。 （3） 熟練掌握動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法。 2. 實(shí)驗(yàn)原理 當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞或者細(xì)胞株持續(xù)生長(zhǎng)、繁殖，造成密度過大、生存空間不足時(shí)，就要 進(jìn)行傳代，稱之為傳代培養(yǎng)。把原代培養(yǎng)的細(xì)胞連續(xù)傳代即稱為細(xì)胞系。從原代或傳代 培養(yǎng)的細(xì)胞中選擇出具有特殊性質(zhì)或特征的細(xì)胞，使其克隆化，并在以后的連續(xù)培養(yǎng)中 保持這種特殊性質(zhì)或特征，即稱為細(xì)胞株。傳代培養(yǎng)時(shí)，通常是以一定的比例將細(xì)胞轉(zhuǎn) 移到另外的培養(yǎng)容器中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。細(xì)胞按照是否貼壁生長(zhǎng)可以分為 3 類：1.貼壁細(xì) 胞，此類細(xì)胞貼壁較牢，采用酶消化法進(jìn)行傳代；2.半貼壁半懸浮細(xì)胞，此類細(xì)胞呈貼 壁狀態(tài)生長(zhǎng)，但貼壁不牢，傳代時(shí)可直接將其吹打下來；3.懸浮細(xì)胞，可通過離心收集 細(xì)胞，然后去除上清，再重新接種。傳代培養(yǎng)也是