細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)實(shí)踐、細(xì)胞培養(yǎng)傳代計(jì)數(shù)與凍存

1、細(xì)胞培養(yǎng) Cell culture模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。 實(shí)驗(yàn)室常用的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室常用的細(xì)胞培養(yǎng) 常用的名稱常用的名稱組織來源組織來源 Hep-2Hep-2HeLaHeLaA549A549VeroVero HEKHEKCHOCHO 人喉癌人喉癌人子宮頸癌人子宮頸癌人肺癌人肺癌非洲綠猴腎非洲綠猴腎人胚腎人胚腎中國地鼠卵巢細(xì)胞中國地鼠卵巢細(xì)胞 代表性的細(xì)胞命名法代表性的細(xì)胞命名法 細(xì)胞名細(xì)胞名稱稱命名意義命名意義 HeLa為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）CHO中國地鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary

2、）宮-743宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立NIH3T3美國國立衛(wèi)生研究所（National Institute of Health）建立；每3天傳代，每次接種3105細(xì)胞毫升。美國已有美國標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫或細(xì)胞銀行（ATCC）和人遺傳突變細(xì)胞庫（HGMR）、細(xì)胞衰老細(xì)胞庫（CAR）等，其中 ATCC不僅是美國也世界最大的細(xì)胞庫。ATCC也是世界衛(wèi)生組織WHO的國際培養(yǎng)細(xì)胞文獻(xiàn)中心。ATCC現(xiàn)液氮凍存有3200個已經(jīng)過鑒定的細(xì)胞系，其中包括來自正常人和各種疾病患者的皮膚成纖維細(xì)胞系和來自不同物種的近75個雜交瘤細(xì)胞株。ATCC接納來自世界各國已經(jīng)鑒定的細(xì)胞予以貯存，同時也向世界各國的研究者或?qū)嶒?yàn)室

3、免費(fèi)提供研究用細(xì)胞（做盈利性研究時收費(fèi)）。 每代貼附生長細(xì)胞的生長過程n游離期n貼壁期n潛伏期n對數(shù)生長期n停止期（平臺期）細(xì)胞培養(yǎng)方式 n群體培養(yǎng)（mass culture），將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單細(xì)胞層n克隆培養(yǎng)（clonal culture），將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過生長增殖每一個細(xì)胞形成一個細(xì)胞集落，稱為克?。╟lone）。一個細(xì)胞克隆中的所有細(xì)胞均來源于同一個祖先細(xì)胞。 群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右） 完全培養(yǎng)基的組成n基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80一95n血清 5一20n碳酸氫鈉 2.0 g/Ln青

4、、鏈霉素 各100單位毫升培養(yǎng)基的配制 RPMI-1640培養(yǎng)粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 各100單位毫升 加三蒸水 至 1000ml，過濾除菌。 調(diào)節(jié)pH值至7.2 加血清（終濃度 10） 細(xì)胞培養(yǎng)基本方法（無菌原則）n無菌工作臺用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射30分鐘以上。n清洗雙手及手腕，戴乳膠手套，然后用75%酒精擦拭。n操作時注意無菌臺內(nèi)空間層次。整個操作過程盡量在無菌臺靠里面一點(diǎn)。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往，嚴(yán)格注意無菌操作。細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長的恃點(diǎn)，傳代方法有3種。n懸浮生長細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳

5、代。n半懸浮生長細(xì)胞傳代 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。n貼壁生長細(xì)胞傳代 采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。貼壁生長細(xì)胞傳代方法n吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液nPBS洗去殘留培養(yǎng)液n加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準(zhǔn)）n靜置2-10 min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。n加入培養(yǎng)液，終止胰酶消化作用。n用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。n吸取1/3細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。n加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。n將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇n細(xì)胞低溫冷凍貯

6、存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融n當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 n如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。n復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。慢凍程序n標(biāo)準(zhǔn)程序： 當(dāng)溫度在-25 以上時， 12 /min 當(dāng)溫度達(dá)-25 以下時， 510 /min 當(dāng)溫度達(dá)-100時，可迅速放入液氮中 細(xì)胞凍存器n簡易程序： 將冷凍管（管口要朝上）放入紗

7、布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12 的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。低溫保護(hù)劑的應(yīng)用n在細(xì)胞凍存時加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。n常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高細(xì)胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在細(xì)胞外形成冰晶，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。細(xì)胞凍存方法n預(yù)先配制凍存液： 含20%血清培養(yǎng)基n 10% DMSO n取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液, 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1106 5 106細(xì)胞/ml)

8、n加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。細(xì)胞復(fù)蘇方法n從液氮中取出冷凍管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分鐘左右）。n5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。n低速離心10分鐘。n去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)n血細(xì)胞計(jì)數(shù)板n計(jì)數(shù)儀 Counter 血球計(jì)數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber 中細(xì)刻9 個1 mm2大正方形，其中4 個角落之正方形再細(xì)刻16 個小格，深度均為0.1 mm。當(dāng)chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時，計(jì)數(shù)每個大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml 中之細(xì)胞數(shù)目。 培養(yǎng)細(xì)胞活力測定臺盼藍(lán)法，trypan blue， 利用染料會滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力細(xì)胞計(jì)數(shù) 取10ul 細(xì)胞懸液，稀釋于990ul PBS，取10ul自血球計(jì)數(shù)盤chamber 上方凹槽加入(已蓋上蓋玻片