高效液相色譜儀使用與操作規(guī)程(學(xué)生用)

1、高效液相色譜儀高效液相色譜儀使用與操作規(guī)程使用與操作規(guī)程Agilent 1100 HPLC第一步第一步第二步第二步第三步第三步第四步第四步準(zhǔn)準(zhǔn)備備開開機(jī)機(jī) 注意注意事項(xiàng)事項(xiàng) 清潔清潔 關(guān)機(jī)關(guān)機(jī) 步步 驟驟Agilent1100系統(tǒng)組成系統(tǒng)組成本系統(tǒng)由溶劑本系統(tǒng)由溶劑輸送泵輸送泵（四元泵，（四元泵，標(biāo)配真空脫氣機(jī)）標(biāo)配真空脫氣機(jī)）Rheodyne 7725i手動(dòng)手動(dòng)進(jìn)樣閥進(jìn)樣閥柱溫箱柱溫箱VWD紫外紫外-可見(jiàn)可見(jiàn)檢測(cè)器檢測(cè)器Agilent1100色譜數(shù)據(jù)色譜數(shù)據(jù)工作站工作站和和電腦電腦等組成，另外還包括打印機(jī)、等組成，另外還包括打印機(jī)、不間斷電源等輔助設(shè)備。不間斷電源等輔助設(shè)備。第一步、第一步、

2、準(zhǔn)準(zhǔn) 備備1 、準(zhǔn)備所需的流動(dòng)相，用合適的準(zhǔn)備所需的流動(dòng)相，用合適的0.45m濾膜濾膜過(guò)濾，超聲脫過(guò)濾，超聲脫氣氣20min。2 、根據(jù)待檢樣品的需要更換合適的洗脫柱（注意方向）和定根據(jù)待檢樣品的需要更換合適的洗脫柱（注意方向）和定量環(huán)。量環(huán)。3、 配制樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液（也可在平衡系統(tǒng)時(shí)配制），用合適配制樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液（也可在平衡系統(tǒng)時(shí)配制），用合適的的0.45m濾膜過(guò)濾。濾膜過(guò)濾。（注意腐蝕性與有機(jī)系的的溶劑）（注意腐蝕性與有機(jī)系的的溶劑）4 、檢查儀器各部件的電源線、數(shù)據(jù)線和輸液管道是否連接正檢查儀器各部件的電源線、數(shù)據(jù)線和輸液管道是否連接正常。常。 接通電源，依次開啟不間斷接通電源，依次開

3、啟不間斷電源電源、真真空脫氣機(jī)空脫氣機(jī)、四元泵四元泵、檢測(cè)器檢測(cè)器，待泵和檢測(cè)，待泵和檢測(cè)器自檢結(jié)束后，打開電腦顯示器、主機(jī)，器自檢結(jié)束后，打開電腦顯示器、主機(jī)，最后打開色譜最后打開色譜工作站工作站。第二步、第二步、開開 機(jī)機(jī)一）一）參數(shù)設(shè)定參數(shù)設(shè)定1、 波長(zhǎng)設(shè)定波長(zhǎng)設(shè)定：2 、流速設(shè)定：流速設(shè)定：3 、流動(dòng)相比例設(shè)定：流動(dòng)相比例設(shè)定：4、 梯度設(shè)定梯度設(shè)定：二）二）更換流動(dòng)相并排氣泡更換流動(dòng)相并排氣泡1： 將吸濾器放入裝有準(zhǔn)備好的流動(dòng)相的儲(chǔ)液將吸濾器放入裝有準(zhǔn)備好的流動(dòng)相的儲(chǔ)液瓶中；瓶中；2 ：順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)泵的排液閥順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)泵的排液閥180，打開排液閥；，打開排液閥；3 ：運(yùn)行泵，泵以運(yùn)行泵

4、，泵以3ml/min的流速?zèng)_洗的流速?zèng)_洗5min（可設(shè)定）后泵流速設(shè)為（可設(shè)定）后泵流速設(shè)為0ml/min；4 ：將排液閥逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)將排液閥逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)適度擰緊適度擰緊，關(guān)閉排液，關(guān)閉排液閥。閥。5 ：如管路中仍有氣泡，則重復(fù)以上操作直至如管路中仍有氣泡，則重復(fù)以上操作直至氣泡排盡。氣泡排盡。三）平衡系統(tǒng)三）平衡系統(tǒng)用檢驗(yàn)方法規(guī)定的用檢驗(yàn)方法規(guī)定的流動(dòng)相沖洗系統(tǒng)流動(dòng)相沖洗系統(tǒng)，一般最少需，一般最少需6倍柱體積倍柱體積的流動(dòng)相。的流動(dòng)相。檢查各管路連接處檢查各管路連接處是否漏液是否漏液，如漏液應(yīng)予以排除。，如漏液應(yīng)予以排除。觀察泵控制屏幕上的壓力值，壓力波動(dòng)應(yīng)觀察泵控制屏幕上的壓力值，壓力波動(dòng)應(yīng)不

5、超過(guò)不超過(guò)1MPa。如。如超過(guò)則可初步判斷為柱前管路仍有氣泡，按超過(guò)則可初步判斷為柱前管路仍有氣泡，按檢查管路后再檢查管路后再操作。操作。觀察觀察基線變化基線變化。如果沖洗至基線漂移。如果沖洗至基線漂移0.01mV/min，噪聲，噪聲為為25mmol/L的緩沖液的緩沖液4.每天沖洗柱每天沖洗柱5.穩(wěn)定進(jìn)樣條件穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動(dòng)相調(diào)節(jié)流動(dòng)相6.采用保護(hù)柱采用保護(hù)柱二、二、 保留時(shí)間縮短保留時(shí)間縮短 1.流速增加流速增加2.樣品超載樣品超載3.鍵合相流失鍵合相流失4.流動(dòng)相組成變化流動(dòng)相組成變化5.溫度增加溫度增加1.檢查泵檢查泵,重新設(shè)定流速重新設(shè)定流速2.降低樣品量降低樣品量3.流動(dòng)相流動(dòng)

6、相PH值保持在值保持在37.5檢查檢查柱的方向柱的方向4.防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀5.柱恒溫柱恒溫三、三、 保留時(shí)間延長(zhǎng)保留時(shí)間延長(zhǎng) 1.流速下降流速下降2.硅膠柱上活性點(diǎn)變化硅膠柱上活性點(diǎn)變化3.鍵合相流失鍵合相流失4.流動(dòng)相組成變化流動(dòng)相組成變化5.溫度降低溫度降低1.1.管路泄漏管路泄漏, ,更換泵密封圈更換泵密封圈, ,排除泵內(nèi)排除泵內(nèi)氣泡氣泡2.2.用流動(dòng)相改性劑用流動(dòng)相改性劑, ,如加三乙胺如加三乙胺, ,或采或采用堿至鈍化柱用堿至鈍化柱3.3.流動(dòng)相流動(dòng)相PHPH值保持在值保持在3 37.57.5檢查柱的檢查柱的方向方向4.4.防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀防止流動(dòng)相蒸發(fā)或

7、沉淀5.5.柱恒溫柱恒溫四、出現(xiàn)肩峰或分叉四、出現(xiàn)肩峰或分叉 1.1.樣品體積過(guò)大樣品體積過(guò)大2.2.樣品溶劑過(guò)強(qiáng)樣品溶劑過(guò)強(qiáng)3.3.柱塌陷或形成短路通道柱塌陷或形成短路通道4.4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效5.5.進(jìn)樣器損壞進(jìn)樣器損壞1.1.用流動(dòng)相配樣用流動(dòng)相配樣, ,總的樣品體積小于第一峰總的樣品體積小于第一峰的的15%15%2.2.采用較弱的樣品溶劑采用較弱的樣品溶劑3.3.更換色譜柱更換色譜柱, ,采用較弱腐蝕性條件采用較弱腐蝕性條件4.4.更換燒結(jié)不銹鋼更換燒結(jié)不銹鋼, ,加在線過(guò)濾器加在線過(guò)濾器, ,過(guò)濾樣過(guò)濾樣品品5.5.更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子五、五、鬼峰鬼峰

8、1.進(jìn)樣閥殘余峰進(jìn)樣閥殘余峰2.樣品中未知物樣品中未知物3.柱未平衡柱未平衡4.三氟乙酸三氟乙酸(TFA)氧化氧化(肽譜肽譜)5.水污染水污染(反相反相)1.每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品改進(jìn)閥和樣品的清洗的清洗2.處理樣品處理樣品3.重新平衡柱重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑用流動(dòng)相作樣品溶劑 (尤其是尤其是離子對(duì)色譜離子對(duì)色譜)4.每天新配每天新配,用抗氧化劑用抗氧化劑5.通過(guò)變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用通過(guò)變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC級(jí)的水級(jí)的水六、六、 基線噪聲基線噪聲 1.氣泡氣泡(尖銳峰尖銳峰)2.污染污染(隨機(jī)噪聲隨機(jī)噪聲)3.檢測(cè)器燈連續(xù)噪聲檢測(cè)器

9、燈連續(xù)噪聲4.電干擾電干擾(偶然噪聲偶然噪聲)5.檢測(cè)器中有氣泡檢測(cè)器中有氣泡1.1.流動(dòng)相脫氣流動(dòng)相脫氣, ,加柱后背壓加柱后背壓2.2.清洗柱清洗柱, ,凈化樣品凈化樣品, ,用用HPLCHPLC級(jí)試劑級(jí)試劑3.3.更換氘燈更換氘燈4.4.采用穩(wěn)壓電源采用穩(wěn)壓電源, ,檢查干擾的來(lái)源檢查干擾的來(lái)源( (如水浴等如水浴等) )5.5.流動(dòng)相脫氣流動(dòng)相脫氣, ,加柱后背壓加柱后背壓七、七、峰拖尾峰拖尾 1.柱超載柱超載2.峰干擾峰干擾3.硅羥基作用硅羥基作用4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效5.柱塌陷或形成短路通道柱塌陷或形成短路通道6.死體積或柱外體積過(guò)大死體積或柱外體積過(guò)大7.柱效下

10、降柱效下降1.降低樣品量降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相增加柱直徑采用較高容量的固定相2.清潔樣品清潔樣品,調(diào)整流動(dòng)相調(diào)整流動(dòng)相3.加三乙胺加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相降低流動(dòng)相PH值值,鈍化樣品鈍化樣品4.更換燒結(jié)不銹鋼更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過(guò)濾器加在線過(guò)濾器,過(guò)濾樣品過(guò)濾樣品5.更換色譜柱更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件采用較弱腐蝕性條件6.連接點(diǎn)降至最低連接點(diǎn)降至最低,對(duì)所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整對(duì)所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整,盡可盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管7.用較低腐蝕條件用較低腐蝕條件,更換柱更換柱,采用保護(hù)柱采用保

11、護(hù)柱八、八、峰展寬峰展寬 1.進(jìn)樣體積過(guò)大進(jìn)樣體積過(guò)大2.在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展3.數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢4.檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)過(guò)大檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)過(guò)大1. 1. 用流動(dòng)相配樣用流動(dòng)相配樣, ,總的樣品體積小總的樣品體積小于第一峰的于第一峰的15%15%2.2.進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散3.3.設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于1010點(diǎn)點(diǎn)4.4.設(shè)定時(shí)間常數(shù)為感興趣第一峰半設(shè)定時(shí)間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的寬的10%10%八、八、峰展寬峰展寬5.流動(dòng)相粘度過(guò)高流動(dòng)相粘度過(guò)高6.檢測(cè)池體積過(guò)大檢測(cè)池體積過(guò)大7.保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)8.柱外體積過(guò)大柱外體積過(guò)大9.樣品過(guò)載樣品過(guò)載5.5.增加柱溫增加柱溫, ,采用低粘度流動(dòng)相采用低粘度流動(dòng)相6