無(wú)泵驅(qū)動(dòng)體外膜肺治療犬急性呼吸衰竭時(shí)的內(nèi)皮素

1、無(wú)泵驅(qū)動(dòng)體外膜肺治療犬急性呼吸衰竭時(shí)的內(nèi)皮素    【關(guān)鍵詞】 呼吸功能不全；,內(nèi)皮素 Dynamic change of endothelins1 in plasma and lung tissue of dogs with acute respiratory failure treated with pumpless extracorporeal membrane oxygenation 【Abstract】 AIM: To study the dynamic change of the endothelins1 (ET1) in plasma an

2、d lung tissue of dogs with acute respiratory failure (ARF) treated by bilateral femoral arteriovenous extracorporeal membrane oxygenation （bAVECMO）. METHODS: A total of 10 ARF dog models were treated by the bAVECMO. Right atrium blood and lung tissue were collected at different time (before experime

3、nt, when models were established, 1, 2, 3, 4 h during ECMO). ET1 was detected dynamically by radioimmunological and immunohistochemical methods during bAVECMO. RESULTS: ET1 content in plasma was descendent from the original level （the moment when the models were completed）， went back at 1 h and peak

4、ed at 2 h, then it descended. ET1 content in lung homogenate get to the peak at 2 h and then started to decrease. The statistical analysis showed ET1 contents in plasma or lung tissue changed significantly between pre and postECMO. CONCLUSION: The bAVECMO has a positive significance in the early tre

5、atment of ARF. 【Keywords】 respiratory insufficiency； endothelins1；bilateral femoral arteriovenous extracorporeal membrane oxygenation 【摘要】 目的: 觀察雙側(cè)股動(dòng)脈股靜脈無(wú)泵驅(qū)動(dòng)體外膜肺（bAVECMO）治療急性呼吸衰竭犬,血漿及肺組織內(nèi)皮素1（ET1）的表達(dá)變化. 方法: 10只犬在建立急性呼吸衰竭模型情況下給予bAVECMO治療. 分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前、模型建立完成時(shí)、轉(zhuǎn)流開(kāi)始后1，2，3，4 h取肺組織及血漿. 應(yīng)用放免、免疫組化,觀測(cè)bAVECMO期間血漿

6、、肺組織勻漿ET1變化, 及與組織損傷的關(guān)系. 結(jié)果：犬ARDS模型血漿ET1含量在原有基礎(chǔ)上（模型完成時(shí)）先降低，1 h后開(kāi)始回升，2 h達(dá)到高值，之后緩慢下降；肺組織勻漿ET1含量轉(zhuǎn)流2 h達(dá)到高值，之后緩慢下降. 統(tǒng)計(jì)分析表明勻漿和血漿各自ET1的均數(shù)在轉(zhuǎn)流前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 肺組織勻漿ET1轉(zhuǎn)流3 h與4 h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 結(jié)論：對(duì)于急性呼吸衰竭bAVECMO的早期治療有積極意義. 【關(guān)鍵詞】 呼吸功能不全； 內(nèi)皮素1； 雙側(cè)股動(dòng)脈股靜脈無(wú)泵驅(qū)動(dòng)體外膜肺 0引言 在對(duì)急性呼吸衰竭(ARF)和急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)的研究中，人們發(fā)現(xiàn)ARF，ARDS時(shí)內(nèi)皮素1 mRNA表達(dá)

7、顯著增強(qiáng)，說(shuō)明ET1參與了急性肺損傷的病理生理過(guò)程. 在對(duì)ARF，ARDS的治療中無(wú)泵驅(qū)動(dòng)體外膜肺輔助(AV)轉(zhuǎn)流技術(shù)(AVECMO)由于其有效并對(duì)血液有形成分破壞輕等優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于臨床1. 在應(yīng)用AVECMO轉(zhuǎn)流中，國(guó)外均采用單側(cè)股動(dòng)脈股靜脈ECMO轉(zhuǎn)流，在臨床中表現(xiàn)了一定的不足，如引流量不夠大，影響了AVECMO的效果；但如應(yīng)用大口徑動(dòng)脈插管來(lái)增加動(dòng)脈引流，則會(huì)嚴(yán)重影響插管側(cè)下肢血液供應(yīng)等. 本項(xiàng)研究首次采用雙側(cè)股動(dòng)脈股靜脈無(wú)泵驅(qū)動(dòng)體外膜肺（bAVECMO）轉(zhuǎn)流技術(shù)，通過(guò)治療犬急性呼吸衰竭模型，觀察血漿、肺組織ET1的變化，為臨床提供參考依據(jù). 1對(duì)象和方法 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備選擇健康

8、成年家犬10只，雌雄不限，體質(zhì)量為1835（平均23.4±4.7) kg,應(yīng)用35 g/L的苯巴比妥100 mg/kg進(jìn)行腹腔注射行全身麻醉，待犬意識(shí)不清時(shí)，行氣管插管與麻醉機(jī)連接. 常規(guī)消毒鋪巾，分別解剖犬左、右兩側(cè)的股動(dòng)脈及股靜脈，全身肝素化靜脈注射肝素，用量為1 mg/kg體質(zhì)量，股動(dòng)脈，股靜脈上、下兩端分別套絲線，結(jié)扎下端的股動(dòng)脈、股靜脈. 阻斷股動(dòng)脈、股靜脈上端，在阻斷與結(jié)扎血管的中下端，切開(kāi)血管. 根據(jù)動(dòng)、靜脈內(nèi)徑的大小選擇不同型號(hào)的PVC動(dòng)、靜脈插管，插管后結(jié)扎固定以防止脫出，常規(guī)縫合皮下、皮膚，防止傷口處滲血. 將動(dòng)、靜脈插管與bAVECMO裝置連接. 右側(cè)胸部開(kāi)胸沿

9、著第4肋間進(jìn)胸，切開(kāi)心包分別將心包固定在切口邊緣，主動(dòng)脈根部置入測(cè)壓針管及測(cè)壓裝置，將此裝置與飛利浦有創(chuàng)血壓、心率動(dòng)態(tài)監(jiān)護(hù)儀連接. 當(dāng)bAVECMO轉(zhuǎn)流時(shí)，通過(guò)bAVECMO端口應(yīng)用1000 mL/L氧氣，其用量為(1.2±0.4) L/min. 1.2標(biāo)本采集建立循環(huán)后，根據(jù)不同的轉(zhuǎn)流時(shí)間收集標(biāo)本. 在體外循環(huán)開(kāi)始前，經(jīng)胸部切口取右肺下葉少許組織（10 mm×10 mm），置液氮罐待檢測(cè). 制作呼吸衰竭動(dòng)物模型進(jìn)行試驗(yàn). 應(yīng)用潘克羅寧（Pancuronrum）（一般情況下0.10.2 mg/kg體質(zhì)量），20 kg左右的犬首次劑量為4 mg，以后每30 min.左右追加2

10、 mg使呼吸完全消失. 通過(guò)麻醉機(jī)調(diào)節(jié)呼吸頻率和潮氣量（犬在安靜狀態(tài)下潮氣量如體重在16.430.5 kg，其潮氣量多在251432 mL）. 采用血?dú)夥治鰞x測(cè)定犬動(dòng)脈血pH值、動(dòng)脈血氧分壓、動(dòng)脈血氧飽和度及動(dòng)脈血二氧化碳分壓（PaCO2）值，當(dāng)達(dá)到呼吸衰竭指標(biāo)時(shí)，經(jīng)右心房抽血10 mL于注射器內(nèi)，立即密封置冰盒待檢. 另經(jīng)胸部切口取右肺下葉少許組織（10 mm×10 mm），置冰盒后待檢測(cè). 開(kāi)始bAVECMO轉(zhuǎn)流實(shí)驗(yàn)后1，2，3，4 h，分別經(jīng)右心房抽血10 mL，胸部切口取右肺下葉少許組織（10 mm×10 mm），置液氮罐待檢測(cè). 1.3樣品制備及測(cè)定方法血漿及肺組

11、織勻漿ET1含量測(cè)定:采用SN 695型全自動(dòng)計(jì)數(shù)器(上海原子核所，放射免疫藥盒購(gòu)自解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所),以放射免疫法測(cè)定標(biāo)本ET1含量. 內(nèi)皮素1含量的免疫組化分析，摘取肺臟用甲醛固定,制作石蠟切片,HE染色,觀察肺臟光鏡下病變;并用鏈霉菌親生物素蛋白過(guò)氧化物酶免疫組化染色法(SP方法)進(jìn)行免疫組化染色(按試劑盒說(shuō)明書操作). 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，血漿及肺組織ET1的組內(nèi)分析采用重復(fù)測(cè)量方差分析. P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 2結(jié)果 2.1肺組織內(nèi)皮素濃度如表所示血漿ET1含量在原有基礎(chǔ)上（模型完成時(shí)）先降低，1 h后開(kāi)始回升，2 h達(dá)到高值，之后緩

12、慢下降；肺組織勻漿ET1含量轉(zhuǎn)流2 h達(dá)到峰值，之后緩慢下降. 重復(fù)測(cè)量方差分析表明勻漿和血漿各自ET1的均數(shù)在轉(zhuǎn)流前后有顯著差異. 肺組織勻漿ET1轉(zhuǎn)流3 h與4 h已無(wú)顯著差別（表1）.表1血漿及肺組織ET1在轉(zhuǎn)流期間變化（略）    2.2免疫組化結(jié)果結(jié)果評(píng)定以細(xì)胞漿或細(xì)胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒狀，且著色明顯高于背景或背景不著色而細(xì)胞著色者為表達(dá)陽(yáng)性（圖1）.免疫組化染色呈陽(yáng)性反應(yīng)（棕黃色著色）的部位：小細(xì)支氣管壁、終末細(xì)支氣管壁上皮細(xì)胞及周圍平滑肌細(xì)胞胞漿和胞膜；小血管壁周圍平滑肌細(xì)胞胞漿、纖維組織和結(jié)締組織；巨噬細(xì)胞胞漿.  &#

13、160; 與術(shù)前比較，術(shù)前部分細(xì)支氣管壁上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)和胞膜可見(jiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)，血管壁周圍和巨噬細(xì)胞中表達(dá)陰性. 造模完成后及轉(zhuǎn)流期間氣管壁及周圍、血管壁周圍明顯陽(yáng)性表達(dá)，少數(shù)巨噬細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)，其中以氣管壁及周圍變化最明顯. 2 h之后各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性表達(dá)范圍和強(qiáng)度未見(jiàn)明顯變化（圖1）. 與術(shù)前組織對(duì)比，造膜完成后肺組織可見(jiàn)散在淤血、肺泡壁間隔輕微增厚等組織輕微損傷現(xiàn)象，未見(jiàn)組織紊亂、斷裂等嚴(yán)重組織損傷改變. 3討論 在對(duì)于ARF，ARDS治療技術(shù)中，ECMO是一項(xiàng)具有重要意義的治療方法. 但傳統(tǒng)的ECMO方法有諸多缺點(diǎn)，如在持續(xù)使用有泵驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)流技術(shù)ECMO治療方面，Macdonald等2

14、研究發(fā)現(xiàn)頑固性肺高壓新生兒血中內(nèi)皮素明顯高于正常嬰兒. 采用非ECMO治療，患兒隨著癥狀改善血中內(nèi)皮素在35 d下降，而持續(xù)使用有泵驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)流技術(shù)ECMO治療的患兒血中內(nèi)皮素卻持續(xù)增高. 表明在ECMO治療時(shí)，內(nèi)皮素增加的主要原因是血泵影響的緣故. 通常國(guó)內(nèi)使用人工膜肺對(duì)于呼吸疾病的治療，往往被限制于病情危重?zé)o法控制,即患者的肺已無(wú)法完成維持生命所必須的氣體交換的危重病例,這使得多數(shù)危重病例在使用ECMO治療前其實(shí)已喪失治療機(jī)會(huì)，我們認(rèn)為這導(dǎo)致了ECMO應(yīng)用死亡率有所夸大. Ancel等3研究認(rèn)為，ECMO能提高兒童的生存率，但在不可逆的細(xì)胞損傷產(chǎn)生前應(yīng)用，即早期應(yīng)用是其提高生存率的關(guān)鍵所在.

15、bAVECMO避免了傳統(tǒng)ECMO治療方法的諸多缺點(diǎn),呼吸衰竭動(dòng)物模型肺組織內(nèi)皮素1的表達(dá)研究對(duì)其應(yīng)用推廣具有意義. 內(nèi)皮素（ET）作為機(jī)體在缺氧、應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的一種致?lián)p傷因子為研究者所重視. 研究認(rèn)為4ET1是缺氧致肺血管收縮的支撐因素，單純?nèi)毖?0 min后，血漿ET1水平有明顯升高. 目前認(rèn)為肺是ET1的主要生物合成和代謝場(chǎng)所，由203個(gè)氨基酸組成的內(nèi)皮素前體原（PreproET1,PPET1）是其原始物質(zhì). 由于肺大量釋放和代謝ET1，ET1釋放或消耗量明顯高于外周血含量，而肺循環(huán)是機(jī)體循環(huán)的重要組成部分，所以ET1的釋放能夠較快地從外周血中體現(xiàn)出來(lái)，這使得兩者間ET1變化趨同. 在研

16、究中我們對(duì)血漿和肺組織勻漿ET1測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行了分析，血漿和肺組織勻漿ET1水平自轉(zhuǎn)流1 h后均呈正相關(guān). 表明轉(zhuǎn)流1 h后血漿ET1含量變化能夠反映肺組織ET1含量變化. 因此在臨床上可通過(guò)測(cè)定血漿內(nèi)ET1含量來(lái)反映肺組織勻漿中ET1含量的變化，以便對(duì)bAVECMO治療作出評(píng)價(jià)，對(duì)治療方案和對(duì)bAVECMO的使用進(jìn)一步改進(jìn). 實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)犬急性呼吸衰竭模型肺組織勻漿、血漿ET1含量，在原有基礎(chǔ)上（模型完成時(shí)）先降低，究其原因主要為bAVECMO轉(zhuǎn)流早期由于預(yù)充液使體內(nèi)液體量增加；血流重新分配致肺的血流減少. 這些原因使患者體內(nèi)的總液體量增加，體重增加，組織水腫存在，血漿ET1相對(duì)減少. 而缺

17、血、缺氧致肺部炎癥組織灌注不足等情況下，肺組織生成ET1實(shí)際增多，內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡壁的損傷使ET1滅活下降，導(dǎo)致肺組織內(nèi)ET1升高. 同時(shí)，缺氧激活多種血管活性物質(zhì)，如血栓素A2，血管緊張素等，而這些物質(zhì)的釋放又進(jìn)一步刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放ET15. 所以，肺組織及血漿ET1含量在以后的研究中逐漸升高. 但由于bAVECMO的早期應(yīng)用（細(xì)胞不可逆損傷產(chǎn)生前早期應(yīng)用）減少了ET1的進(jìn)一步釋放，使其表達(dá)在表現(xiàn)出升高后減少. 免疫組化結(jié)果顯示，術(shù)前部分細(xì)支氣管壁上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)和胞膜可見(jiàn)ET1弱陽(yáng)性表達(dá)，血管壁周圍和巨噬細(xì)胞中表達(dá)陰性. 造模完成后及轉(zhuǎn)流期間氣管壁及周圍、血管壁周圍明顯陽(yáng)性表達(dá)，少數(shù)巨噬細(xì)胞中

18、陽(yáng)性表達(dá)，其中以氣管壁及周圍變化最為明顯. 轉(zhuǎn)流2 h之后各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性表達(dá)范圍和強(qiáng)度未見(jiàn)明顯變化，這與我們放免試驗(yàn)結(jié)果相一致. 在研究中，有理由認(rèn)為ET1在肺臟中的表達(dá)可能隨bAVECMO的轉(zhuǎn)流進(jìn)一步下降. 要進(jìn)一步證實(shí)，須bAVECMO的長(zhǎng)期轉(zhuǎn)流試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行研究. 但對(duì)于急性呼吸衰竭而言，bAVECMO的早期治療可被認(rèn)為具有積極意義. 【參考文獻(xiàn)】 1Liebold A, Rang CM, Philippi A, et al. Pumpless extracorporeal lung assistexperience with the first 20 casesJ. Euro J Cardiothorac Surg,2000,17:608-613. 2Naoki K，Hiroshi H，Daniel IS，et al. Cardiopulmonary bypass produces greater pu