流式細胞術(shù)的應(yīng)用

1、    流式細胞術(shù)的應(yīng)用            作者：潘彤時間：2007-11-22 13:13:00                     【關(guān)鍵詞】  流式細胞術(shù)  流式細胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM

2、）是一種近年發(fā)展起來的比較先進的技術(shù)，它利用流式細胞儀對特定細胞群體進行分選或?qū)ι镂⒘＿M行多參數(shù)快速定量分析 1 。它在免疫學(xué)、細胞生物學(xué)、腫瘤標(biāo)記物檢測、血液病診斷等各個領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。本文就其應(yīng)用做一綜述。1 對細胞抗原的檢測各種血細胞都有相應(yīng)的抗原表達方式，并且不同成熟階段表達的抗原種類也不完全相同。通過免疫熒光標(biāo)記技術(shù)將細胞表面抗原同標(biāo)記有特異染料的一種以上單克隆抗體結(jié)合后，在流式細胞儀同一激光光源激發(fā)下產(chǎn)生幾種特異熒光色，由熒光檢測器對每個細胞的體積、結(jié)構(gòu)、熒光種類及性質(zhì)等多種參數(shù)同時測定，分析得到細胞群體的多種表面抗原的表達情況。FCM也可用于特異性細胞質(zhì)內(nèi)或細胞核上抗原的檢

3、測，并協(xié)同其他實驗指標(biāo)預(yù)示疾病的預(yù)后2 。FCM也為網(wǎng)織紅細胞計數(shù)提供了快速、準(zhǔn)確的測試手段，可通過某些染料與網(wǎng)紅中RNA結(jié)合，在FCM測量時發(fā)出特定顏色的熒光，進行單參數(shù)定量RNA。2 對淋巴細胞及其亞群的分析FCM進行淋巴細胞及其亞群的分析，分類更客觀、準(zhǔn)確。使用流式細胞儀的絕對計數(shù)系統(tǒng)，即加入已知數(shù)量的熒光微球，通過儀器測定時收獲的細胞數(shù)量和微球數(shù)量及血液標(biāo)本用量，直接得到每微升全血中T淋巴細胞亞群的絕對計數(shù)（個/l） 3 。用FCM檢測PBMC中p24、p24nef、p18等HIV抗原陽性的CD4 + 細胞數(shù)可監(jiān)測體內(nèi)HIV復(fù)制情況，結(jié)果表明HIV抗原陽性細胞與CD4 + 細胞數(shù)量負相

4、關(guān) 4 。3 白細胞分類分析利用FCM的體積測定和細胞結(jié)構(gòu)測定來檢測每個白細胞的光散色強度，它與細胞體積、細胞膜結(jié)構(gòu)、細胞核形狀、細胞質(zhì)性狀等多種因素有關(guān)，經(jīng)過分析可得到中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞的檢測結(jié)果。這種方法應(yīng)用于血細胞計數(shù)速度快、結(jié)果準(zhǔn)確，大大提高了臨床實驗室的工作效率 5 。 4 病毒抗原的檢測FCM既可用于檢測受染細胞內(nèi)的病毒抗原，也可檢測受染細胞表面的病毒抗原。由于FCM檢測的是單個細胞，因此FCM檢測受染細胞適用于血液、支氣管灌洗液、尿標(biāo)本以及經(jīng)酶消化過的組織細胞。同時由于FCM為多參數(shù)分析，因此可在單個細胞中同時獲得多個分析參數(shù)并能定量檢出受染細

5、胞。當(dāng)用不同熒光染料標(biāo)記不同的病毒抗原特異性抗體或?qū)⑻禺愋圆《究贵w與不同大小的乳膠顆粒相聯(lián)時，F(xiàn)CM可同時檢測到同一樣本中的多種病毒或病毒抗原 6 。5 病毒抗體檢測利用吸附有病毒抗原的聚苯乙烯微球作為載體的病毒抗體FCM分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用。結(jié)合流式細胞儀與微球雜交法可同步檢測同一反應(yīng)管中HIV、HCV、HBV的數(shù)目和種類，其基本原理為將檢測不同病原體的探針分別包被微球，流式細胞儀分辨特異性結(jié)合后發(fā)出的不同強度的熒光。當(dāng)用FCM技術(shù)檢測HCV核心抗原、NS 3 抗原抗體時，其靈敏度比酶標(biāo)免疫技術(shù)高5倍左右 7 。6 在器官移植中的作用FCM通過檢測受者血清中抗供者的抗HLA的抗體，根據(jù)抗體的種

6、型、效價、靶抗原和器官移植的類型不同，抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)也有所不同，F(xiàn)CM比傳統(tǒng)方法更靈敏、操作時間更短并可同時檢測細胞亞型、分辨出IgG和IgM抗體。巨細胞病毒（CMV）能在白細胞內(nèi)繁殖并合成CMV特異性蛋白，通過FCM檢測CMV特異性抗原及其抗原分泌量，這種技術(shù)用于CMV感染檢測時感染后4h便可檢出T淋巴母細胞中CMV-DNA，從而可快速、準(zhǔn)確地反映CMV在移植受者中的早期感染狀況，對預(yù)防和減少感染具有重要意義 8 。以FCM監(jiān)測腎移植受體CD8 + 、CD38 + 、T細胞亞群的變化也可監(jiān)測CMV感染 9 。7 檢測血小板自身抗體FCM檢測PAIgG與ELISA相比更簡便省時，檢測中操作

7、步驟少。由于血小板被抗體-熒光素標(biāo)記而顯示陽性，所以不受其它種類細胞或碎片的影響，重復(fù)性好，可檢測成批或單個標(biāo)本，可直觀地顯示結(jié)合PAIgG量不同的血小板群體，并可在同一份標(biāo)本上同時測定聚集和釋放功能 10 。8 在白血病診斷中的作用白血病是白細胞在分化到某個階段受阻后異常增殖的結(jié)果，利用白細胞分化不同階段出現(xiàn)的細胞表面標(biāo)志可以對白血病進行免疫分型。過去對造血細胞和免疫細胞分類主要是依據(jù)細胞形態(tài)學(xué)和細胞免疫化學(xué)染色來進行的，現(xiàn)在將多種檢測手段相結(jié)合，可為臨床診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后提供更多、更有力的依據(jù)。通過FCM檢測各種急性白血病細胞表面抗原的表達，對臨床診斷尤為重要 11 。9 在腫瘤診斷中的

8、作用通過DNA含量分析的細胞周期分布，可反映腫瘤細胞的增殖狀態(tài)，對治療及預(yù)后有十分重要的意義。近年來，流式細胞測量法DNA分析越來越多地應(yīng)用于實體瘤患者。DNA非整倍體的出現(xiàn)率和癌變與不典型增生程度密切相關(guān)。DNA非整倍體可能是癌前病變發(fā)生早期癌變的一個早期指標(biāo) 12 。10 在微型生物學(xué)研究中的應(yīng)用從現(xiàn)有的微型生物核糖體RNA序列出發(fā)，設(shè)計分類專用的核酸探針，它們能與核糖體RNA分子一些區(qū)域互補，而這些RNA分子對于目標(biāo)分類群是唯一的，通過熒光標(biāo)記寡核苷酸鏈探針與細胞內(nèi)同源RNA序列結(jié)合，目標(biāo)種可被測出，它們的系統(tǒng)發(fā)育被確定。在這一研究中，通過原位雜交，用FCM確定雜交信號，可定量雜交信號強

9、度，而細胞和特異探針雜交的平均熒光強度與細胞和非特異探針雜交平均熒光強度的比率，能計算和估測探針特異性和靈敏性。由此確定微型生物DNA含量與倍體水平 13 。11 用于抗生素敏感性試驗近年來，F(xiàn)CM用于細菌的藥敏效應(yīng)研究已有較大發(fā)展，F(xiàn)CM與熒光染料的聯(lián)合運用可判斷細菌活力和功能狀態(tài)，由于速度快，該方法已被建議用作臨床實驗室的常規(guī)藥敏試驗 14。綜上所述，F(xiàn)CM具有快速、靈敏及能同時進行多參數(shù)分析的優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于多種學(xué)科，具有廣闊的應(yīng)用前景。參考文獻1 Grogan WM，Collins JM.Guide to flow cytometry methods.New York:Marcel D

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