抗凋亡因子Survivin在腎性高血壓心肌中的表達

1、抗凋亡因子Survivin在腎性高血壓心肌中的表達         11-06-01 08:31:00     作者：吳瑞霞 張端蓮    編輯：studa20【摘要】  目的：探討L精氨酸對腎性高血壓心肌保護的作用機制。方法:將大鼠隨機分為3組：正常對照組(5只)、高血壓對照組(20只)及L精氨酸治療組(20只), 制作腎性高血壓動物模型， L精氨酸治療組通過胃管灌飼給予L精氨酸，連續(xù)給藥8周后，切取各組心室肌組織,進行免疫

2、組織化學(xué)染色,觀察各組心肌組織Survivin的表達。利用HPIAS2000圖像分析系統(tǒng)測定Survivin在各組中表達的平均光密度和平均陽性面積率。結(jié)果：Survivin在LArg組的表達顯著高于高血壓對照組。圖像分析結(jié)果顯示Survivin在兩組間差異有顯著性意義(P<0.01)。結(jié)論：L精氨酸對腎性高血壓導(dǎo)致的心肌細胞損傷具有重要的保護作用。 【關(guān)鍵詞】  L精氨酸; Survivin; 心肌; 免疫組織化學(xué)心血管疾病是當(dāng)前威脅人類健康的頭號殺手,心肌肥大是心臟病的獨立危險因素,其詳細機制尚不完全清楚。腎性高血壓是繼發(fā)于腎臟病的高血壓,在原有疾病損害的基礎(chǔ)上,血壓升高會加

3、重對心臟的損害1。一氧化氮(nitric oxide, NO)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種主要由內(nèi)皮細胞等合成,釋放的小分子生物活性介質(zhì),廣泛參與機體多種病理生理過程。研究發(fā)現(xiàn),作為體內(nèi)NO合成的唯一底物L(fēng)arg在多種組織或器官I/R損傷中發(fā)揮重要的保護作用2。深入研究LArg這一具有潛在重要前景的一氧化氮前體在治療肺動脈高壓中的作用與機制是當(dāng)今該領(lǐng)域的重要課題。近年研究證實L精氨酸是一種新型抗高血壓藥物,但其作用機制尚不清楚。survivin 是新近發(fā)現(xiàn)的一種結(jié)構(gòu)獨特的哺乳類凋亡抑制蛋白( inhibition apoptosis protein , IAP ),表達于人與鼠的胚胎發(fā)育組織和人類大多數(shù)

4、腫瘤組織, 但在正常成人組織不表達( 胸腺除外) 3，其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。survivin 還參與細胞周期調(diào)控4。我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察了L精氨酸對腎性高血壓心肌組織中survivin的表達,并采用圖像分析系統(tǒng)測定survivin表達的平均光密度和平均陽性面積率。探討L精氨酸治療由腎性高血壓導(dǎo)致的心肌細胞的損害，為臨床上采用L精氨酸治療腎性高血壓提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料1.2 方法按體重將大鼠隨機分為3組：正常對照組(5只)、腎性高血壓組(20只)和L精氨酸治療組(20只)。腎性高血壓組和L精氨酸治療組大鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30mg/kg)，然后動物取右側(cè)

5、臥位,暴露左腎區(qū),在左肋弓下旁開脊柱0.5cm處作一切口,入腹腔探出左腎,分離左腎動脈,上一內(nèi)徑為0.20mm銀夾,以部分縮窄左腎動脈。右側(cè)腎臟不觸及。然后,關(guān)閉創(chuàng)口,讓大鼠蘇醒。術(shù)前血壓以100140mmHg(1mmHg=0.1333kPa)為正常范圍,術(shù)后血壓超過140mmHg時,即確定動物高血壓形成,并用于藥物實驗。對那些已放置銀夾,但在術(shù)后第4周末血壓仍未升高的大鼠,將在給藥前從藥物實驗中剔除。LArg組于術(shù)后第5周開始每天給予L精氨酸200mg/kg;將L精氨酸溶于蒸餾水中通過胃管灌飼給藥,連續(xù)給藥8周。正常對照組給予同等容積的溶劑。在給藥時間結(jié)束之時,再次測量動物體重和血壓。8周后

6、將各組大鼠處死,切取心室肌組織,進行免疫組織化學(xué)實驗觀察。2.2 主要試劑 濃縮型兔抗鼠survivin單克隆抗體(北京中杉生物技術(shù)有限公司); 超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司); 顯色試盒及多聚賴氨酸(北京中杉生物技術(shù)有限公司)。2.3 免疫組織化學(xué)SP法檢測survivin相關(guān)抗原主要步驟： 組織切片5 m，常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗; 3%過氧化氫，37孵育10 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS洗4×5min; survivin采用微波抗原修復(fù)(3檔，10 min)， PBS洗4×5min; 正常羊血清37孵育10 min以減少非

7、特異性反應(yīng); 一抗37孵育1h，PBS洗4×5min; 生物素標記的二抗，37孵育10 min，PBS洗4×5min; 鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶復(fù)合物37孵育10 min，PBS洗4×5min; DAB顯色液顯色，自來水沖洗終止反應(yīng); 蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。2.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷survivin以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性對照除細胞核染成藍色外，胞漿內(nèi)無棕黃色反應(yīng)物。采用HPIAS2000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)(同濟千屏影像公司)對survivin的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野(×400)，測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細胞總面積，計算陽性面積率(陽性面積率=單位面積中陽性反應(yīng)的總面積/單位面積中細胞的總面積×100%)。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。2.5 統(tǒng)計學(xué)處理對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和SNKq檢驗，檢驗水準為0.05。2 結(jié)果正常對照組心肌細胞胞漿內(nèi)可見密集分布的棕黃色顆粒survivin呈陽性表達;腎性高血壓組心肌細胞胞漿內(nèi)棕黃色顆粒較少，survivin表達弱;L精氨酸治療組心肌細胞胞漿內(nèi)可見較多