真題答題大題須稍加整理

1、DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實質(zhì)上也是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟變性、復(fù)性和延伸。(!)變性（模板DN

2、A解旋）模板DNA經(jīng)加熱至90以上。一定時間后，使模板DNA雙鏈解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。(2)復(fù)性（退火）模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到50左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合。(3)延伸DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補配對的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈。循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次（預(yù)變性）94°C，30s30次94，20s52，20s72，20s最后一次（保溫）72，30s(2)瓊脂糖凝膠電泳DNA在電廠作用下，可以由電源的負(fù)極向正極泳動，泳動的速度與DNA片段

3、的長度成負(fù)相關(guān)，與電壓強度成正比，因此可以分離不同長度的DNA。在有DNA marker（不同已知堿基對大小的DNA片段的混合物）的條件下，由于不同堿基大小的DNA片段在瓊脂糖凝膠上涌動的速度不同，因此電泳完畢后會出現(xiàn)在膠塊的不同位置。通過將擴增出的DNA片段與已知的條帶做比較，可以大概推測出該片段的堿基對的大小。如果要進(jìn)一步檢測其大小，可以換另外規(guī)格的DNA marker 繼續(xù)電泳。核酸熒光染料可以與DNA嵌合，一起電泳，DNA圖譜觀察儀可以激發(fā)特定的藍(lán)色光源，熒光染料在該光照射下可見到熒光，熒光的亮度與DNA大小成正比。三、實驗儀器及試劑7種PCR組分 微量可調(diào)移液器 離心管 PCR儀 水

4、平電泳槽 電泳儀電源 紫外分光光度計 250ml錐形瓶(封口膜) 記號筆 衛(wèi)生紙四、實驗步驟1、DNA體外擴增(1) 將所有試劑管瞬時離心一次（4000r/min,1min），使管壁沒有殘留藥品，在引物I 和引物II的離心管內(nèi)用移液器各加入40ul雙蒸水（ddH2O），混勻后瞬時離心一次。所有的離心管都擺到雙面板上。(2)向裝有Taq DNA 聚合酶的離心管按下表加入以下成分：10x Buffer50 LMgCl250 LdNTP mixture20L上游引物(引物I)25L下游引物(引物II)25 L模板DNA25 LddH2O290L原有的Taq DNA 聚合酶有15ul，此時混合液體系共

5、計500ul,此步驟由第一、二組同學(xué)合作完成。（在實驗老師的監(jiān)督指導(dǎo)下操作，確保此后其他同學(xué)的實驗順利進(jìn)行）(3)共分25組，第一、二組的同學(xué)并入其他小組進(jìn)行實驗。每組取20ul的上述混合液于0.5ml的離心管中，加入15ul的液體石蠟封閉體系，以防止在加熱過程中蒸發(fā)。(4) 對自己組的離心管上進(jìn)行標(biāo)記之后，放到PCR儀上進(jìn)行DNA擴增。2、瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA（1）用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架好梳子。（2）配制濃度為1%（1 g/100 mL）的瓊脂糖凝膠2塊。在錐形瓶中，稱取1g的瓊脂糖粉，加入100ml 1x電泳緩沖液，用封口膜封住瓶口后在微波爐內(nèi)加熱，使瓊脂

6、糖粉熔化，然后冷卻至60 ，倒入電泳槽中（每塊膠50ml），插好梳子，待其凝固。（電泳槽首先用透明膠帶將兩端封住再進(jìn)行倒膠）（3）待膠凝固后，去掉膠帶紙，小心移去梳子，注意不要破壞加樣孔。將倒膠槽至于水平電泳槽內(nèi)，梳井（點樣孔）一端朝負(fù)極方向。向電泳槽中緩緩倒入1x電泳緩沖液，以沒過膠面2 mm為宜。（5）將80ul的6xLoading Buffer 加入到80ul的核酸熒光染料中，按1:1比例混合。（6）移液器槍頭插入到擴增出的樣品離心管的底部，吸取20ul樣品于另一0.5ml的離心管中，注意不要吸到液體石蠟，再加1ul的染料混合液，充分振蕩混勻。用移液器吸取10ul緩慢加入梳井內(nèi)，槍頭抵到

7、梳井口，以防止樣液被緩沖液沖散，此外，為防止手抖將凝膠破壞，可以用左手扶住右手的手腕。（6）蓋上電泳槽蓋，接通電源，電壓為80 V，電流最大。（7）當(dāng)指示劑移動到凝膠中間時，斷開電源，終止電泳。（8）取出凝膠塊，在DNA圖譜觀察儀中觀察電泳帶及其位置，判斷擴增產(chǎn)物的情況。3、紫外分光光度計檢測DNA含量（1）最后1組取2ulPCR反應(yīng)液，加入98ul蒸餾水，將樣品稀釋50倍。（2）以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。（3）加入DNA稀釋液100ul至比色杯中，測定260nm處的光吸收值。（4）根據(jù)下面的公式計算DNA含量：DNA含量（ul/ml）=50*（

8、260nm的讀數(shù)）x稀釋倍數(shù) 五、注意事項 1 離心機上蓋沒有鎖，在離心機運轉(zhuǎn)時，轉(zhuǎn)速最高可達(dá)16000r/min，如果這時打開離心機上蓋，里面的離心管就會甩出，對人身造成危險，切忌等全部停下來之后再打開上蓋取出離心管。另外，離心管一定要對稱放置。 2 水平電泳槽在電泳時一定要蓋上上蓋，此時的緩沖液電壓可以達(dá)到80V，大大超過了人體的安全電壓，切忌不能用手觸碰緩沖液或者是電源兩端接頭。 簡答題 1. 氨基酸脫氨后產(chǎn)生的氨和-酮酸有哪些主要的去路？ 答：氨基酸經(jīng)脫氨基后所生成的氨進(jìn)入血液，由丙氨酸及谷氨酰胺兩種形式運輸，大部分在肝中合成尿素，只有少部分在腎以銨鹽形式由尿排出。氨基酸經(jīng)脫氨基后所生

9、成的-酮酸可以進(jìn)一步代謝，主要有三條代謝途徑。 （1）經(jīng)氨基化生成非必需氨基酸：哺乳類動物體內(nèi)的一些非必需氨基酸一般通過-酮酸氨基化而生成。 （2）轉(zhuǎn)變成糖及脂類：-酮酸可以轉(zhuǎn)變?yōu)樘呛椭?。分別用各種不同的氨基酸喂養(yǎng)人工造成糖尿病的犬時發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)氨基酸可使尿中葡萄糖的排出量增加，少數(shù)幾種（異亮、苯丙、酪、蘇及色氨酸）可使尿中葡萄糖和酮體的量都增加，而亮氨酸和賴氨酸只能使尿中酮體的排出量增加，因此將氨基酸分為三大類：生糖氨基酸、生酮氨基酸和生糖兼生酮氨基酸。 （3）氧化供能：-酮酸在體內(nèi)可通過三羧酸循環(huán)和生物氧化體系，徹底氧化為CO2和H2O，同時釋放能量供生理活動的需要。 2氨在血液中是如何

10、轉(zhuǎn)運的？ .答：氨是有毒物質(zhì)，各組織中產(chǎn)生的氨必須以無毒性的方式經(jīng)血液運輸?shù)礁魏铣赡蛩鼗蜻\到腎以銨鹽的形式隨尿排出，現(xiàn)已闡明，氨在血液中主要以丙氨酸及谷氨酰胺兩種形式運輸?shù)摹?（1）丙氨酸-葡萄糖循環(huán)：肌肉中的氨基酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨基作用將氨基轉(zhuǎn)給丙酮酸生成丙氨酸，丙氨酸經(jīng)血液運到肝臟。在肝中，丙氨酸通過聯(lián)合脫氨基作用，釋放出氨，用于合成尿素。轉(zhuǎn)氨后生成的丙酮酸經(jīng)糖異生途徑生成葡萄糖。葡萄糖由血液輸送到肌組織，在肌組織中葡萄糖分解轉(zhuǎn)變成丙酮酸，丙酮酸再接受氨基生成丙氨酸。丙氨酸和葡萄糖反復(fù)地在肌肉和肝臟之間進(jìn)行氨的轉(zhuǎn)運，所以將這一途徑稱為丙酮酸-葡萄糖循環(huán)。通過這個循環(huán)，即使肌肉中的NH3以無毒的丙氨酸

11、形式運輸?shù)礁?，同時，肝又為肌肉提供了生成丙酮酸的葡萄糖。由此具有重要的生理意義。 （2）谷氨酰胺的運氨作用：谷氨酰胺是另一種轉(zhuǎn)運氨的形式，它主要從腦、肌肉等組織向肝或腎運氨。氨與谷氨酸在谷氨酰胺合成酶的催化下生成谷氨酰胺，并由血液運輸?shù)礁位蚰I，再經(jīng)谷氨酰胺酶水解成谷氨酸和氨，氨在肝臟中可用于合成尿素，解除氨毒，在腎臟則與H+結(jié)合并以NH4+鹽形式隨尿排出。3. 試述血氨的來源和去路。答：體內(nèi)氨的來源主要有三方面：氨基酸、胺類物質(zhì)氧化分解產(chǎn)NH3；腸道吸收的NH3；腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的NH3。（1）氨基酸脫氨基生成的氨是體內(nèi)NH3的主要來源。胺類物質(zhì)氧化分解也可產(chǎn)生NH3。（2）由腸道吸收的NH

12、3包括兩部分：氨基酸在腸道細(xì)菌作用下產(chǎn)生的氨尿素經(jīng)腸道細(xì)菌尿素酶水解產(chǎn)生的氨，腸道產(chǎn)NH3量較多，每日約4克。（3）腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的NH3主要來自谷氨酰胺，谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的催化下水解成谷氨酸和NH3。這部分NH3分泌到腎小管管腔中與尿中的H+結(jié)合成NH4+,并以銨鹽的形式隨尿排出，對調(diào)節(jié)機體的酸堿平衡起重要作用。氨的主要去路：（1）氨主要在肝臟經(jīng)尿素循環(huán)合成尿素。（2）合成谷氨酰胺（3）合成非必需氨基酸4試述尿素合成的過程和特點。.答：尿素合成的過程：（1）氨基甲酰磷酸的合成：反應(yīng)在線粒體中進(jìn)行。氨可與CO2可在氨基甲酰磷酸合成酶（CPS-）的催化下，合成氨基甲酰磷酸。（2）瓜氨酸的

13、合成：反應(yīng)在線粒體中進(jìn)行。在氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶的催化下，氨基甲酰磷酸與鳥氨酸縮合生成瓜氨酸。（3）精氨酸的合成：反應(yīng)在胞液中分兩步進(jìn)行。首先，瓜氨酸在線粒體合成后，被轉(zhuǎn)運到線粒體外。在胞液中，在精氨酸代琥珀酸合成酶催化下，瓜氨酸與天冬氨酸反應(yīng)生成精氨酸代琥珀酸，由ATP供能。其后，精氨酸代琥珀酸再經(jīng)精氨酸代琥珀酸裂解酶催化，裂解成精氨酸及延胡索酸。（4）精氨酸水解生成尿素：反應(yīng)在胞液中進(jìn)行。在胞液中，精氨酸受精氨酸酶的作用，水解生成尿素和鳥氨酸。鳥氨酸通過線粒體內(nèi)膜載體轉(zhuǎn)運再進(jìn)入線粒體，并參與瓜氨酸合成。如此反復(fù)，完成尿素循環(huán)。尿素合成的特點：鳥氨酸循環(huán)先在線粒體中進(jìn)行，再在胞液中進(jìn)行。每進(jìn)行一次

14、循環(huán)，就能合成一分子尿素，需要兩分子的NH3和一分子CO2, 2分子NH3。一分子來自體內(nèi)氨基酸脫氨基生成，另一個由天冬氨酸提供，而天冬氨酸又可由其它氨基酸通過轉(zhuǎn)氨基生成。因此，尿素分子中的兩分子NH3都是直接或間接來自于各種氨基酸。另外，每合成一分子尿素消耗3分子ATP，4 個高能磷酸鍵。 5. （1）何為一碳單位？寫出四種體內(nèi)重要的一碳單位基因。 （1）某些氨基酸在代謝過程中可以產(chǎn)生含有一個碳原子的基團，稱為一碳單位。體內(nèi)的一碳單位有：甲基（-CH3）, 亞甲基（-CH2-），次甲基（-CHO=），甲酰基（-CHO），亞氨甲基（-CH=NH）。 （2）一碳單位的輔酶是什么？又如何與之結(jié)合？

15、 （2）四氫葉酸是一碳單位的載體，即四氫葉酸是一碳單位代謝的輔酶。一碳單位通常結(jié)合在FH4分子的N5、N10位。 （3）一碳單位還要來源于哪幾種氨基酸代謝？ （3）一碳單位主要來源于絲，甘，組和色氨酸的代謝。 （4）簡述一碳單位的生理功能 （4）一碳單位的生理功用：作為合成嘌呤和嘧啶的原料：如：N10-CHO-FH4、N5N10-CH-FH4提供嘌呤環(huán)C2、C8的來源。N5N10-CH2-FH4提供胸苷酸的甲基來源。把氨基酸代謝和核酸代謝聯(lián)系起來。藥理作用：磺胺藥通過干擾細(xì)菌、惡性腫瘤細(xì)胞的葉酸、四氫葉酸的合成，進(jìn)一步影響一碳單位代謝與核酸合成。 6. 甲基化作用是體內(nèi)重要的代謝反應(yīng)，具有廣泛

16、的生理意義。哪種氨基酸可以提供甲基？其活性形式如何？又如何代謝轉(zhuǎn)換，重新生成循環(huán)利用？ .答：（1）甲硫氨酸可以提高甲基分子中含有S-甲基，通過各種轉(zhuǎn)甲基作用可以生成多種含甲基的重要生理活性物質(zhì)。 （2）活性形式是S-腺苷甲硫氨酸，甲硫氨酸在轉(zhuǎn)甲基之前，必須首先與ATP作用，生成S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。SAM中的甲基稱為活性甲基，SAM稱為活性甲硫氨酸。 （3）甲硫氨酸以SAM的形式供甲基后，S-腺苷同型半胱氨酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成同型半胱氨酸，同型半胱氨酸可接受N5-CH3-FH4提供的甲基再重新形成甲硫氨酸，形成一個循環(huán)過程。 什么是核酸的核酸的變性、復(fù)性和雜交：（一） 變性在一定理化因素作用

17、下，核酸雙螺旋等空間結(jié)構(gòu)中堿基之間的氫鍵斷裂，變成單鏈的現(xiàn)象稱為變性（denaturation）。引起核酸變性的常見理化因素有 加熱、酸、堿、尿素和甲酰胺等。在變性過程中，核酸的空間構(gòu)象被破壞，理化性質(zhì)發(fā)生改變。由于雙螺旋分子內(nèi)部的堿基暴露，其A260值會大大增加。 A260值的增加與解鏈程度有一定比例關(guān)系，這種關(guān)系稱為增色效應(yīng)（hyperchromic effect）。如果緩慢加熱DNA溶液，并在不同溫度測定其A260值，可得到 “S”形DNA熔化曲線（melting curve）。從DNA熔化曲線可見DNA變性作用是在一個相當(dāng)窄的溫度內(nèi)完成的。當(dāng)A260值開始上升前DNA是雙螺旋結(jié)構(gòu)，在上

18、升區(qū)域分子中的部分堿基對開始斷裂，其數(shù)值隨溫度的升高而增加，在上部平坦的初始部分尚有少量堿基對使兩 條鏈還結(jié)合在一起，這種狀態(tài)一直維持到臨界溫度，此時DNA分子最后一個堿基對斷開，兩條互補鏈徹底分離。通常把加熱變性時DNA溶液A260升高達(dá)到最 大值一半時的溫度稱為該DNA的熔解溫度（melting temperature Tm），Tm是研究核酸變性很有用的參數(shù)。Tm一般在8595之間，Tm值與DNA分子中G C含量成正比。（二） 復(fù)性變性DNA在適當(dāng)條件下，可使兩條分開的單鏈重新形成雙螺旋DNA的過程稱為復(fù)性（renaturation）。當(dāng)熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后復(fù)性稱為退 火（annea

19、ling）。DNA復(fù)性是非常復(fù)雜的過程，影響DNA復(fù)性速度的因素很多：DNA濃度高，復(fù)性快；DNA分子大復(fù)性慢；高溫會使DNA變 性，而溫度過低可使誤配對不能分離等等。最佳的復(fù)性溫度為Tm減去25，一般在60左右。離子強度一般在0.4mol/L以上。（三） 雜交具有互補序列的不同來源的單鏈核酸分子，按堿基配對原則結(jié)合在一起稱為雜交（hybridization）。雜交可發(fā)生在DNA-DNA、RNA-RNA 和DNA-RNA之間。雜交是分子生物學(xué)研究中常用的技術(shù)之一，利用它可以分析基因組織的結(jié)構(gòu)，定位和基因表達(dá)等，常用的雜交方法有Southern印跡 法，Northern印跡法和原位雜交（insi

20、tu hybridization）等。核酸的變性和復(fù)性變性(denaturation)和復(fù)性(renaturation) 是雙鏈核酸分子的二個重要物理特性。也是核酸研究中經(jīng)常引用的術(shù)語。雙鏈DNA,RNA雙鏈區(qū),DNA: RNA雜種雙鏈(hybrid duplex)以及其它異源雙鏈核酸分子(heteroduplex) 都具有此性質(zhì)。蛋白質(zhì)糖基化修飾主要有N-連接的糖基化和O-連接的糖基化兩種類型。前者寡糖基直接連接的氨基酸殘基是天冬酰胺（Asn），后者主要是絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr），此外也可能是羥脯氨酸和羥賴氨酸（如膠原蛋白）。 蘇氨酸，絲氨酸、酪氨酸。因為他們有羥基基團，可以和磷酸

21、基團脫水生成磷酸酯lys，arg能被甲基化，就是將氨基和乙酸酐進(jìn)行反應(yīng)，得到酰胺類物質(zhì)，只要N上有H，基本上都可以進(jìn)行乙?；被臒N基化：氨基酸與RX作用則烴基化而成N-烴基衍氨基酸蛋白質(zhì)檢測方法匯總(2010-11-17 19:06:09)轉(zhuǎn)載標(biāo)簽：雜談蛋白質(zhì)檢測方法匯總化學(xué)測量 2008-11-10 17:42:19 閱讀1281 評論1 字號：大中小訂閱蛋白質(zhì)檢測方法匯總本實驗的目的是學(xué)會各種蛋白質(zhì)含量的測定方法。了解各種測定方法的基本原理和優(yōu)缺點。 蛋白質(zhì)含量測定法，是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法，即定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Fo

22、lin酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來的新的測定法，即考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏1020倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。 值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因為一種蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測定，有可能得出四種不同的結(jié)果。每種測定法都不是完美無缺的，都有其優(yōu)缺點。在選擇方法時應(yīng)考慮：實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；蛋白質(zhì)的性質(zhì)；溶液中存在的干擾物質(zhì)；測定所要花費的時間

23、?？捡R斯亮藍(lán)法（Bradford法），由于其突出的優(yōu)點，正得到越來越廣泛的應(yīng)用。一、微量凱氏（Kjeldahl）定氮法樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下： CH2COOH | + 3H2SO4- 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) NH2 2NH3 + H2SO4 - -(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4 + 2NaOH - 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3) 反應(yīng)（1）、(2)在凱氏瓶內(nèi)完

24、成，反應(yīng)（3）在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行。為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強酸。實驗和計算方法這里從略。計算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以625即得。 五種蛋白質(zhì)測定方法比較如下：方法 靈敏度 時間 原理 干擾物質(zhì) 說明凱氏定氮法（Kjedahl法） 靈敏度低，適用于0.2 1.0mg氮，誤差為 ±2 費時 810小時 將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） 用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測定；干擾

25、少；費時太長雙縮脲法（Biuret法） 靈敏度低120mg 中速 2030分鐘 多肽鍵堿性Cu2?紫色絡(luò)合物 硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸 用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似紫外吸收法 較為靈敏50100mg 快速 510分鐘 蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 各種嘌吟和嘧啶；各種核苷酸 用于層析柱流出液的檢測；核酸的吸收可以校正Folin酚試劑法（Lowry法） 靈敏度高5mg 慢速 4060分鐘 雙縮脲反應(yīng)；磷鉬酸磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇 耗費時間長；操作要嚴(yán)格計時；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化考馬斯亮藍(lán)法(Br

26、adford法) 靈敏度最高15mg 快速515分鐘 考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時，其lmax由465nm變?yōu)?95nm 強堿性緩沖液；TritonX-100;SDS 最好的方法；干擾物質(zhì)少；顏色穩(wěn)定；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化二、雙縮脲法（Biuret法）（一）實驗原理雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)180左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。 H2O O=C C=O HN NH R-CH CH-R O=C Cu C=

27、O HN NH R-CH CH-R H2O 紫色絡(luò)合物 紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為110mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。 此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。（二）試劑與器材 1. 試劑： （1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用BSA濃度1mg/ml的A280為0.66來校正其純度。如有

28、需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用005N NaOH配制。 （2）雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。 2. 器材： 可見光分光光度計、大試管15支、旋渦混合器等。（三）操作方法 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的

29、測定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（2025）下放置30分鐘，于540nm處進(jìn)行比色測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，光吸收值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2、樣品的測定：取23個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。三、Folin酚試劑法（Lowry法）（一）實驗原理 這種蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在

30、已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：?在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。 Folin酚試劑中的磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。 Folin酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線

31、也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉氫氧化鈉溶液的濃度12倍。 進(jìn)行測定時，加F olin酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性pH條件下穩(wěn)定，

32、但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅蛋白質(zhì)溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。 此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。 此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測定范圍是20250mg。（二）試劑與器材 1.試劑 （1）試劑甲：（A） （A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O）。溶解于500毫升蒸餾水中。（B） （B） 0.5克硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。 （

33、2）試劑乙： 在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）,25克鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時，回流結(jié)束時，加入150克硫 酸鋰（Li2SO4），50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1N左右。（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液: 精確稱取結(jié)晶牛血清清

34、蛋白或 g球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9 % NaCl溶液。 2. 器材（1）可見光分光光度計（2）旋渦混合器（3）秒表（4）試管16支（三）操作方法 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度為250mg/ml）。用水補足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（2025）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（Folin酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會使顯

35、色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 注意：因Lowry反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開始計時，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。 進(jìn)行

36、多試管操作時，為了防止出錯，每位學(xué)生都必須在實驗記錄本上預(yù)先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和測得的吸光度值。Folin酚試劑法實驗表格：管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白質(zhì) 0.2 0.4 0.6（約250mg/ml）蒸餾水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4試劑甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0試劑

37、乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白質(zhì)的量（mg）吸光度值（A700） 2. 樣品的測定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20250微克），按上述方法進(jìn)行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定放在一起，同時進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的各試管后面，再增加3個試管。如上表中的8、9、10試管。 根據(jù)所測樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。 注意，由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃

38、度（相對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。四、改良的簡易Folin酚試劑法（一）試劑 1. 試劑甲：堿性銅試劑溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸鉀和0.05%硫酸銅，配制時注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解后，最后加入。 2. 試劑乙：與前面的基本法相同。臨用時加蒸餾水稀釋8倍。 3. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：同基本法。（二）操作步驟 測定標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品溶液的操作方法與基本法相同。只是試劑甲改為1毫升，室溫放置10分鐘后，試劑乙改為4毫升。在55恒溫水浴中保溫5分鐘。用流動水冷卻后，在660nm下測定其吸光度值。 改良的快速簡易法，可獲得與 Folin酚試劑法（即Lowry基本法）相接近的結(jié)果。五

39、、考馬斯亮蘭法（Bradford法）（一）實驗原理 雙縮脲法（Biuret法）和Folin酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測定的方法。 1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（

40、特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。 在595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。 Bradford法的突出優(yōu)點是： （1）靈敏度高，據(jù)估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)1mg。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。 （2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴(yán)格地控制時間

41、。 （3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。 此法的缺點是： （1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用 g球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。 （2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。 （3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線

42、來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。（二）試劑與器材 1. 試劑： （1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用 g球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。 （2）考馬斯亮蘭G250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。 2. 器材： （1）可見光分光光度計 （2）旋渦混合器 （3）試管16支（三）操作方法 1. 標(biāo)準(zhǔn)方法 （1）取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.

43、02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無離子水補充到0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭G250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。 （2）加完試劑25分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對照為第1號試管，即0.1mlH2O加5.0mlG250試劑。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。考馬斯亮蘭法實驗表

44、格： 管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10   (1.0mg/ml) 未知蛋白質(zhì) 0.02 0.04 0.06 (約1.0mg/ml) 蒸餾水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考馬斯亮藍(lán) G250試劑 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋白質(zhì)量（mg） 光吸收值 （A595） （3）用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)，用吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo)，作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，

45、根據(jù)測出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。 2. 微量法當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時（10100mg/ml）,可將取樣量（包括補加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白對照則分別為0.5ml或1.0ml H2O, 考馬斯亮藍(lán)G250試劑仍加5.0ml, 同時作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.29。六、紫外吸收法 蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含

46、量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。 紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（NH4）2SO4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對值。 此法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含

47、有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進(jìn)行計算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是因為不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。 此外，進(jìn)行紫外吸收法測定時，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測定樣品時的pH要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。 下面介紹四種紫外吸收法： 1. 280nm的光吸收法 因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。 測定時，將待測蛋

48、白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對照，在紫外分光度計上直接讀取280nm的吸光度值A(chǔ)280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.11.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時，A280約為1.0左右。由此可立即計算出蛋白質(zhì)的大致濃度。 許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長下的光吸收值（A11cm）有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可查，根據(jù)此光吸收值可以較準(zhǔn)確地計算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與（A11cm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%，光徑為1cm時的光吸收值）的關(guān)系。文獻(xiàn)值A(chǔ)11cm,稱為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。 蛋白質(zhì)濃度 = (A28010

49、)/ A11cm,280nm (mg/ml) (Q 1%濃度?10mg/ml)例：牛血清清蛋白 ： A11cm=6.3 (280nm) 溶菌酶 ： A11cm=22.8 (280nm) 若查不到待測蛋白質(zhì)的A11cm值，則可選用一種與待測蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測定。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制的濃度為1.0mg/ml。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白（BSA）。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取6支試管，按下表編號并加入試劑：管號 1 2 3 4 5 6BSA（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0

50、A280 用第1管為空白對照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計上測定吸光度A280，以A280為縱座標(biāo)，各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為直線，利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的未知樣品的A280值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量，也可以用2至6管A280值與相應(yīng)的試管中的蛋白質(zhì)濃度計算出該蛋白質(zhì)的A11cm,280nm 2. 280nm和260nm的吸收差法 核酸對紫外光有很強的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強10倍（每克），但核酸在260nm處的吸收更強，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于2

51、60nm的吸收值。通常： 純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260 ? 1.8 純核酸的光吸收比值： A280/A260 ? 0.5 含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。 蛋白質(zhì)濃度=1.45×A2800.74×A260 (mg/ml) 此經(jīng)驗公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測定的數(shù)據(jù)來建立的。 3. 215nm與225nm的吸收差法 蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測定時，可用215nm與225nm吸收值之差，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測定

52、蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。 用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，配制成20100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白質(zhì)溶液，分別測定215nm和225nm的吸光度值，并計算出吸收差： 吸收差D= A215 A225 以吸收差D為縱座標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。再測出未知樣品的吸收差，即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。 本方法在蛋白質(zhì)濃度20100mg/ml范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等緩沖液，都無顯著干擾作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸、巴比妥等緩沖液的215nm光吸收值較大，必須將其濃度降到0.

53、005M以下才無顯著影響。 4. 肽鍵測定法 蛋白質(zhì)溶液在238nm處的光吸收的強弱，與肽鍵的多少成正比。因此可以用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制一系列50500mg/ml已知濃度的5.0ml蛋白質(zhì)溶液，測定238nm的光吸收值A(chǔ)238，以A238為縱座標(biāo), 蛋白質(zhì)含量為橫座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品的濃度即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。 進(jìn)行蛋白質(zhì)溶液的柱層析分離時，洗脫液也可以用238nm檢測蛋白質(zhì)的峰位。 本方法比280nm吸收法靈敏。但多種有機物，如醇、酮、醛、醚、有機酸、酰胺類和過氧化物等都有干擾作用。所以最好用無機鹽，無機堿和水溶液進(jìn)行測定。若含有有機溶劑，可先將樣品蒸干，或用其他方法除去干擾物質(zhì)，然后

54、用水、稀酸和稀堿溶解后再作測定。考馬斯亮蘭法（Bradford法）（一）實驗原理雙縮脲法（Biuret法）和Folin酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測定的方法。1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是

55、與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。Bradford法的突出優(yōu)點是：（1）靈敏度高，據(jù)估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)1mg。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴(yán)格地控制時間。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。此法的缺點是：（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用g球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉