蜈蚣多糖對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用研究

1、    蜈蚣多糖對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用研究作者：李興暖韓雅莉余衛(wèi)國【摘要】  目的研究蜈蚣多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞的抑制作用及作用機(jī)制。方法用MTT法檢測蜈蚣多糖對(duì)Hela細(xì)胞生長的抑制作用；流式細(xì)胞儀和Annexin V-FITC/PI雙熒光染色分別檢測蜈蚣多糖對(duì)Hela細(xì)胞周期及凋亡情況的影響。結(jié)果在一定濃度范圍內(nèi)蜈蚣多糖可顯著抑制Hela細(xì)胞的增殖，改變Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期，使細(xì)胞阻滯于G2/M期，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)論蜈蚣多糖可能通過改變Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而對(duì)Hela細(xì)胞的增殖有一定的抑制作

2、用。 【關(guān)鍵詞】  蜈蚣多糖；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡Abstract:ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of polysaccharide from Scolopendra subspinipes mutilans (PSSM) on Hela cells and its mechanism. MethodsMTT assay was used to test the effect of growth inhibition on Hela cells. Cell cycle and cell apopotsis wer

3、e detected by flow cytometry and AnnexinV-FITC/PI fluorescence staining.ResultsPSSM could obviously inhibit the proliferation of Hela cells at specific concentration range, change the cell cycle of Hela cells and block Hela cells at G2/M phase, and induce cell apoptosis.ConclusionPSSM can inhibit th

4、e growth of Hela cells by changing cell cycle and inducing apoptosis.Key words:Polysaccharide from Scolopendra subspinipes mutilans; Cell cycle; Cell apoptosis少棘蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch又名百足, 屬節(jié)肢動(dòng)物門，多足綱，唇足目，螟蚣科動(dòng)物，為 中國 藥典記載的正品藥材，為我國傳統(tǒng)的鎮(zhèn)痙、通絡(luò)類藥物。祖國醫(yī)學(xué)記載和臨床實(shí)踐均已證明其具有鎮(zhèn)靜熄風(fēng)、通絡(luò)止痛、解毒散結(jié)等藥用功效1。

5、現(xiàn)代 藥理實(shí)驗(yàn)也證明了蜈蚣具有抗腫瘤和抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用2,3，臨床用于 治療 腫瘤以及心腦血管病等癥。傳統(tǒng)中藥均以整蟲入藥，但蜈蚣體內(nèi)成分復(fù)雜，且有效成分尚不明了，無法對(duì)其藥理作用做進(jìn)一步研究。為了探討蜈蚣抗腫瘤作用，本文以少棘蜈蚣為原料，對(duì)其體內(nèi)多糖進(jìn)行了分離純化，并進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行了Hela細(xì)胞增殖的作用的研究，為進(jìn)一步探索蜈蚣抑瘤作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 1 材料 1.1 材料少棘蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch購自汕頭市恒青藥店，由廣東 工業(yè) 大學(xué)生藥研究室對(duì)其進(jìn)行種類鑒定。人宮頸癌Hela細(xì)胞，由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子病理實(shí)驗(yàn)室提供，微血管

6、內(nèi)皮細(xì)胞MVEC，由汕頭大學(xué)多學(xué)科研究中心提供。1.2 試劑與儀器DEAE-52為 Whantman 公司產(chǎn)品；1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、噻唑蘭（MTT）、碘化丙啶（PI）均購自Sigma公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司；新生牛血清購自杭州四季青生物有限公司。Thermo Labsystems酶標(biāo)儀（Thermo公司）；Shel Lab二氧化碳培養(yǎng)箱； EpicsXL 流式細(xì)胞儀（Backman Coulter公司）；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司）；Nikon Coolpix 4500數(shù)碼相機(jī)。 2 方法 2.1 蜈蚣多糖(pol

7、ysaccharides from Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch, SSP)的制備少棘蜈蚣87 g 研缽磨碎，加入1 000 ml蒸餾水90恒溫水浴攪拌4 h，過濾，殘?jiān)尤?00 ml蒸餾水，重復(fù)上述步驟，過濾，合并濾液，濃縮濾液。取上清液，加5倍體積95乙醇4靜置過夜，離心，去上清液，沉淀用少許蒸餾水溶解。Sevag法去蛋白數(shù)次4，將去蛋白溶液透析干燥，過DEAE-52離子交換纖維素色譜柱，以0.05，0.1，0.2，0.4和1 mol·L-1 NaCl 進(jìn)行階段洗脫，共得到3個(gè)糖峰，其中濃度0.05 mol·L-1的

8、NaCl洗脫峰糖含量最高，收集此組分透析干燥，待用。2.2 Hela和人微血管內(nèi)皮細(xì)胞 ( Human microvascular endothelial cell,MVEC) 的培養(yǎng)取對(duì)數(shù)生長期的Hela和MVEC細(xì)胞接種于含10小牛血清的1640培養(yǎng)基中，接種濃度為5×105 個(gè)/ml，置37，5CO2 濃度，飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。去原培養(yǎng)基，加入含有SSP濃度分別為0，0.5，1，1.5，2，4 g/ml的維持液（含1.5小牛血清的1640培養(yǎng)基），置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.3 蜈蚣多糖（SSP）對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長期H

9、ela細(xì)胞按上述方法接種于96孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h，去原培養(yǎng)基，加入含有0.5，1，1.5，2，4 g/ml SSP維持液，總體積為200 l，分別培養(yǎng)24，48 h后取出，每孔加入MTT 20 l繼續(xù)孵育4 h，吸去上清，加入200 l二甲基亞砜，振蕩15 min，酶標(biāo)儀檢測570 nm波長下各孔吸光值（A），按下列公式 計(jì)算 細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖的抑制率（%）（1實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100取MVEC細(xì)胞作為正常細(xì)胞對(duì)照，實(shí)驗(yàn)方法同上。2.4 蜈蚣多糖（SSP）對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響取對(duì)數(shù)生長期Hela細(xì)胞，接種到50 ml培養(yǎng)瓶中，按上述方法培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)24 h后取出，加入含有SSP濃度分別為0.5，1，1.5 g/ml 維持液中，培養(yǎng)24，48 h后常規(guī)消化收集細(xì)胞，用PBS清洗3次，加入70預(yù)冷乙醇4固定過夜，離心去乙醇，用PBS清洗兩次， R NaseA（50 g/ml）37 消化30 min，PI染色后上機(jī)檢測細(xì)胞周期變化5。2.5 蜈蚣多糖對(duì)（SSP）Hela細(xì)胞凋亡的影響將蓋玻片切成4塊，加入12孔板中，取100 l 5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液加到玻片上，4 h后待細(xì)胞貼壁后再加入900 l培養(yǎng)基，繼續(xù)貼壁培養(yǎng)20 h。去掉原培養(yǎng)液，用PBS清洗3次后，加入含0.5，1，1.