血清蛋白質(zhì)的分離純化與鑒定

1、血清蛋白質(zhì)的分離純化與鑒定劉歡 1 張唯 2 趙瀾 2 彭垠婷 2 徐波 2 郭小李 2(1 生化專(zhuān)業(yè)細(xì)胞生物學(xué)51041300069 導(dǎo)師：張紅鋒;2 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)摘要：通過(guò)系統(tǒng)的生化制備與分析實(shí)驗(yàn)，讓學(xué)生基本掌握了包括脫鹽、親和層析、醋酸纖維薄膜電泳、SDS-PAGEHPLC冷凍干燥在內(nèi)的生化技術(shù)。從而為以后的科研工作打好基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：層析；電泳 ； SDS-PAGEAbstract:By doing biochemichal preparing and analyzing experiment, technologies such as protein concentrat

2、ion detecting,enzyme activity testing, chromatography, acetate green electrophoresis, HPLC ,SDS-PAGE and other biotechnological techniques are mastered. Students are made qualified to their research work.Keywords: chromatography ; electrophoresis ; SDS-PAGE一、前言生命物質(zhì)的制備和分析是現(xiàn)代生物化學(xué)中必不可少且又非常實(shí)用的技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)兔

3、血清蛋白的分離，讓我們基本掌握常用的技術(shù)，初步了解了純化技術(shù)的整體步驟和整個(gè)生化技術(shù)的整體流程， 為我們以后自己分離純化蛋白質(zhì)產(chǎn)物建立了一個(gè)基本的概念，以及為以后的研究工作打下基礎(chǔ)。這些技術(shù)都是常用而成熟的技術(shù)，但是一個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，盡管生物技術(shù)有了飛速發(fā)展，它們?nèi)砸恢痹诎l(fā)揮著重要的，不可替代的作用。這些技術(shù)包括：(一) 蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)電泳技術(shù)Hardy"2'3發(fā)現(xiàn)，許多生物膠體，如蛋白質(zhì)、酶等有特征的電泳遷移率(electrophoretic mobilities)。 此遷移率在很大程度上取決于溶液的pH。因此利用電泳特征作為對(duì)物質(zhì)的鑒定引起人們廣泛的興趣。 20 世紀(jì)的 2

4、0 年代和 30 年代，電泳理論和實(shí)踐有了很大的發(fā)展。Tiselius 教授首先證明了血清是由白蛋白，“、3和丫球蛋白組成的4。人血清蛋白用界面移動(dòng)方法分離的最佳條件是0.1mol/L(pH8.6)的巴比妥緩沖液，此時(shí)白蛋白具有最快的遷移速度，接著依次為“1、”2、3和丫球蛋白 58。生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、 多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質(zhì)的H+濃度或與其他大分子的相互作用。在電場(chǎng)中，帶電顆粒向陰極或陽(yáng)極遷移，遷移的方向取決于它們帶電的符號(hào)，這種遷移現(xiàn)象即所謂電泳。遷移的方式目前可分為三類(lèi)：根據(jù)分子尺寸大小、分子所帶的電荷或分子的生物學(xué)與化學(xué)特征。電泳遷移率(mobili

5、ty) m 規(guī)定為在電位梯度E 的影響下，顆粒在時(shí)間t 中的遷移距離d。聚丙烯酰胺凝膠(plyacrylamide gel,PAG)是由丙烯酰胺(acrylamide)和交聯(lián)試劑N,N，-甲叉 雙丙烯酰胺(N,N z -methylenebisacrylamide)在有引發(fā)劑和增速劑的情況下聚合而成的。聚丙烯酰 胺的單體形成長(zhǎng)鏈，由N,N -甲叉雙丙烯酰胺的雙功能基團(tuán)和鏈末端的自由功能基團(tuán)反應(yīng)而發(fā)生交聯(lián)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)清楚9。聚丙烯酰胺的特性，包括其機(jī)械性能、彈性、透明度、粘著度以及孔徑大小均取決于兩個(gè)重要的參數(shù) T 和C。 T 是兩個(gè)單體的總百分濃度。C 是與總濃度有關(guān)的交聯(lián)百分濃度。Hje

6、rten 教授 10在 1962年引入以下兩個(gè)公式來(lái)進(jìn)行計(jì)算。T=(a+b)/m 100(%)C=b/(a+b) 100(%)A為丙烯酰胺的克數(shù)(g), b為N,N，-甲叉雙丙烯酰胺的克數(shù)(g), m為水或緩沖液的終體積 (ml)。其中a和b的比例是很重要的11。PAGE 電泳根據(jù)原理，需要在以下方面做選擇：1) pH 的選擇考慮原則有：合適的分離膠緩沖系統(tǒng)、先導(dǎo)離子、尾隨離子、濃縮膠緩沖系統(tǒng)、反向離子及電泳緩沖液12,13。2) 離子強(qiáng)度的選擇。一般來(lái)說(shuō)，離子強(qiáng)度在0.010.1mol/L14,最常用的為0.05mol/L15。3) 凝膠濃度的選擇。濃度太大則孔徑較小，樣品留在加樣位置；太小

7、則不能很好分離。所以必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇最佳的濃度。4) 分子量的測(cè)定。1964年Feerguson16首先在淀粉凝膠中證明了蛋白質(zhì)分子的遷移率m的對(duì)數(shù)或相對(duì)遷移率Rf的對(duì)數(shù)對(duì)凝膠濃度T% 作圖，可以得到一條直線(xiàn)。這個(gè)現(xiàn)象接著在1968 年由 Hedrick 和 Smith 17在聚丙烯酰胺凝膠中證實(shí)。SDS-PAGE技術(shù)首先在1967年由Shapiro18等建立，1969年由Weber和Osborn19進(jìn)一步完善。他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而電荷因素可以被忽略。SDS 是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性

8、試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的輕鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑，如疏基乙醇(3-mercaptoethanal和二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)則能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂，消除了分子間原有的電 荷差異。(二) 蛋白質(zhì)的分離提取蛋白質(zhì)是一種極具多相性的生物大分子，離開(kāi)其天然環(huán)境，蛋白質(zhì)分子極不穩(wěn)定，在細(xì)胞中和抽提液中的蛋白質(zhì)的性狀也不盡相同。蛋白質(zhì)有多種類(lèi)型，通過(guò)不同的方法我們可區(qū)分為可溶性蛋白、膜結(jié)合蛋白、具有催化功能的蛋白或結(jié)構(gòu)蛋白及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。從正常生物基質(zhì)中提取各種蛋白質(zhì)均需要有特定的條件。如果不能滿(mǎn)足這一條件，蛋白將很快的失去生

9、物學(xué)活性，其生物半衰期也將迅速降低。因此，在蛋白質(zhì)的特性研究中，確定提取條件是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。在不同實(shí)驗(yàn)中遇到的困難也各不相同，有些式樣中的困難是如何維持酶的活性。在不同實(shí)驗(yàn)中要針對(duì)不同的情況來(lái)解決不同的問(wèn)題。然而對(duì)蛋白質(zhì)研究而言卻有著一些共同的參數(shù)。1) .緩沖液。緩沖液可以抗衡蛋白質(zhì)溶液中的pH 值的改變，選擇合適的緩沖液對(duì)于維持一定pH值下蛋白質(zhì)的穩(wěn)定及保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性十分重要20,21。a.應(yīng)對(duì) pKa 相近的一些緩沖液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，良的相互作用22。以避免有的緩沖液與所研究的蛋白質(zhì)之間發(fā)生不b. 當(dāng)選定一種緩沖溶液后，一般使用其最低的濃度以避免非特異性的離子強(qiáng)度的影響。通常以50mmol/

10、L 的緩沖液濃度作為實(shí)驗(yàn)的起始濃度。c. 當(dāng)緩沖液pKa 值的變化超過(guò)一個(gè)1pH 單位時(shí)其有效的緩沖能力明顯降低。而許多酶在極限pH 值時(shí)往往發(fā)生不可逆的變性23。d. 大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞在37的生理狀況下的pH 值為7.07.5， 而在溫度下降至接近0時(shí)可達(dá)8.024。e. 要根據(jù)所選用的分離方法選用緩沖溶液：凝膠過(guò)濾方法大多數(shù)緩沖液均可適用。陰離子交換層析，陽(yáng)離子緩沖液首選Tris 緩沖液。 陽(yáng)離子交換和羥基磷灰石層析，陰離子緩沖液首選磷酸鹽緩沖液22。f. 混合緩沖液在一定的離子強(qiáng)度下往往具有更寬的緩沖范圍25。g. 在低溫時(shí)緩沖液和冰點(diǎn)溶劑的情況可參考文獻(xiàn)26。h. 所采用的化學(xué)試劑應(yīng)該達(dá)

11、到試劑級(jí)或更高純度。2）鹽、金屬離子和螯合劑必須保證保持酶活性所需的離子。同時(shí)用螯合劑來(lái)螯合對(duì)酶保存不利的金屬離子。3）還原劑可以添加一定還原劑來(lái)保證酶的還原環(huán)境。4）去垢劑用適當(dāng)濃度的去垢劑來(lái)抽提、沉淀蛋白。也必須選擇合適的濃度。5）其他條件包括表面效應(yīng)、溫度、 儲(chǔ)存條件等。同時(shí)可以用蛋白酶抑制劑來(lái)去除蛋白酶對(duì)目的蛋白的降解。常用的抑制劑有：PMSF、 EDTA、 pepstatin、 leupeptin、 aprotinin 等。為了純化細(xì)胞蛋白質(zhì)，采用有效的方法進(jìn)行細(xì)胞破碎和固液分離是必要的。它是全過(guò)程的第一步，通常是將處于細(xì)胞不同位置的待純化蛋白釋放出來(lái)，溶入已知成分的溶液內(nèi)。該步驟是

12、目的蛋白初級(jí)分離純化階段的重要環(huán)節(jié)，它直接影響產(chǎn)物的回收率，也可能影響產(chǎn)物的純度。目前建立很多破碎細(xì)胞，釋放細(xì)胞內(nèi)容物的方法。根據(jù)作用方式不同，基本可以分為兩大類(lèi)：機(jī)械法和非機(jī)械法。此類(lèi)方法和原理可以參看文獻(xiàn)27和1990 年出版的酶學(xué)方法（英文）182 卷。（三）蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)蛋白質(zhì)分離純化除了簡(jiǎn)單的離心、沉淀等方法以外，目前常用和最為有效的方法是層析技術(shù)，包括離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、親和層析以及由此技術(shù)延伸的HPLC 等技術(shù)。1 .離子交換層析在純化蛋白質(zhì)的層析手段中使用最為廣泛。它對(duì)蛋白質(zhì)的分辨率高，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，成本低。此方法適合于蛋白質(zhì)粗提物的初始純化。a） 蛋白質(zhì)的等

13、電點(diǎn)是進(jìn)行離子交換層析的重要依據(jù)。b） 離子交換劑與蛋白質(zhì)的結(jié)合。離子交換劑以自身所帶相反電荷與蛋白質(zhì)的凈電荷結(jié)合。c） 蛋白質(zhì)純化的一般程序。蛋白質(zhì)溶液進(jìn)入離子交換柱后，與離子交換樹(shù)脂無(wú)親和力的蛋白質(zhì)被洗脫。d） 常用蛋白質(zhì)洗脫策略。常用方法是加大反荷離子的濃度。e） 不同反荷離子對(duì)洗脫的影響。f）其他蛋白質(zhì)洗脫策略。離子交換時(shí)改變液相中緩沖體系的pH值是一種降低蛋白質(zhì)與樹(shù)脂親和力的辦法。g）緩沖液。離子交換用的緩沖液必須慎重選擇，若緩沖能力不夠強(qiáng)，導(dǎo)致液相pH值的波動(dòng)，會(huì)影響蛋白質(zhì)與樹(shù)脂的結(jié)合。利用離子交換層析純化蛋白質(zhì)在一開(kāi)始時(shí)應(yīng)該作好兩個(gè)決定：選擇最佳的離子交換樹(shù)脂和緩沖體系；如何洗脫

14、蛋白質(zhì)。2 .凝膠過(guò)濾層析又稱(chēng)為大小排阻、凝膠排阻、分子篩或凝膠過(guò)濾層析28,29。這種方法利用分級(jí)分離，明顯降低了因不可逆結(jié)合所造成的蛋白質(zhì)損失和失活。此外，可利用此方法更換蛋白質(zhì)的緩 沖液活降低緩沖液的離子強(qiáng)度。 純化一個(gè)分子量較大的蛋白質(zhì)。 純化的第一步可以使用凝膠過(guò)濾層 析。溶質(zhì)分子在移動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)Kd來(lái)表示凝膠過(guò)濾層析的特性：Kd=（Ve-Vo）/Vi。凝膠過(guò)濾層析還可以運(yùn)用于： 分子量測(cè)定，去除低分子量的雜質(zhì)，從二聚體和其他寡聚體中分 離目的蛋白，更換蛋白質(zhì)的緩沖液，研究蛋白質(zhì)與配基的結(jié)合30,31等。3親和層析是一類(lèi)純化方法，它包含各種各樣的形式，但其共同特征是均以

15、蛋白質(zhì)和結(jié)合在介 質(zhì)上的配基間的特異親和力為工作基礎(chǔ)。配基可以是生物學(xué)特異的，例如一個(gè)肽、一個(gè)抗體、一個(gè) 底物、一個(gè)抑制劑、一個(gè)輔酶或核酸等；配基也可以是具有相對(duì)特異相互作用的凝集素、染料或疏 水分子等。很多情況下，蛋白質(zhì)和某些生物大分子的生物學(xué)功能在于它們能夠特異地和可逆地與相 應(yīng)配基相互作用。所以說(shuō)，親和層析選擇性強(qiáng)、純化效率高，常常可以一步獲得滿(mǎn)意的純化效果。 因?yàn)樗鼞?yīng)用的是生物特異性而不是依賴(lài)于物理化學(xué)性質(zhì)，故常用于分離低濃度的蛋白質(zhì)。（四）蛋白質(zhì)的分析方法。我們得到了很純的蛋白后就要對(duì)其進(jìn)行一些性質(zhì)的測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)我們主要測(cè)定了蛋白的濃度、 酶活和米氏常數(shù)等性質(zhì)。1） 考馬斯亮藍(lán)能與蛋

16、白質(zhì)的疏水微區(qū)相結(jié)合 陽(yáng),這種結(jié)合具有高敏感性?？捡R斯亮藍(lán)G250的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在 465nm。當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)呈藍(lán)色， 其最大吸收峰改變?yōu)?95nm，考馬斯亮藍(lán)G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物的高消光效應(yīng)導(dǎo)致了蛋白 質(zhì)定量測(cè)定的高敏感度。在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮藍(lán)G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈色后，在595nm下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線(xiàn)形關(guān)系， 故可以用于蛋白質(zhì)的測(cè)定。 樣品蛋白質(zhì)含 量應(yīng)該在10-100 pg為宜。一些陽(yáng)離子和乙醇對(duì)測(cè)定無(wú)影響， 而大量的去污劑會(huì)嚴(yán)重干 擾實(shí)驗(yàn)33,34。2） 在一定發(fā)pH和溫度下，待測(cè)液中的堿性磷酸酶作用于基質(zhì)中的磷酸苯二鈉，使之水解放出酚。酚在

17、堿性溶液中與 4-氨基安替比林作用并經(jīng)鐵氧化鉀氧化，生成紅色醍類(lèi)化 合物，根據(jù)紅色深淺可以測(cè)定酶活力高低，從而計(jì)算出酶的活力單位。每克組織蛋白在 37c與基質(zhì)作用15min產(chǎn)生1mg酚作為一個(gè)活力單位。影響酶促反應(yīng)的主要因素包括 pH、溫度、激活劑與抑制劑等 網(wǎng)。磷酸苯二鈉+H2O AKP 苯酚+磷酸氫二鈉 4-氨基安替比林+苯酚顯色劑（OH-）紅色醍衍生物3） 1913 年前后，Michaelis 和 Menten 在前人工作的基礎(chǔ)上，做了大量的定量研究，積累了足夠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，從而提出酶促動(dòng)力學(xué)的基本原理，并歸納為一個(gè)數(shù)學(xué)式加以表達(dá)：V=VmaxS/(Km+S)。這個(gè)式子被稱(chēng)為米氏常數(shù)，它的

18、前提是酶與底物反應(yīng)的“快速平 衡說(shuō)”。Km值是當(dāng)酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，它的單位是摩爾/升，與底物濃度的單位一樣36。生命物質(zhì)的制備技術(shù)是一種重要的研究手段。不論科技如何發(fā)展，這些技術(shù)可能會(huì)被改進(jìn)，但永遠(yuǎn)不可能被替代。掌握了這些基本技術(shù)及其原理，就掌握了研究生命秘密的的有效武器。因此本實(shí)驗(yàn)的意義不僅在于對(duì)本實(shí)驗(yàn)涉及的技術(shù)和物質(zhì)的掌握，更重要的是我們能舉一反三，在以后的工作中遷移運(yùn)用這些技術(shù)。二、材料與方法2.1 材料( 1) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：兔子(2)試劑：飽和(NH4)2SO4 溶液；0.0175mol/L,PH 6.3 磷酸鹽緩沖液；SephadexG-25; DEAE-纖

19、維素； 10%三氯乙酸；鈉氏試劑；0.5mol/L,PH 6.5 醋酸銨緩沖液；0.06mol/L,PH 6.5 醋酸銨緩沖液；0.02mol/L,PH6.5醋酸鏤緩沖液；血清樣品；衛(wèi)合緩沖液；緩沖液I ( PH7.0 PBS);緩沖液H ( PH3.0 PBS);巴比妥-巴 比妥鈉緩沖液(PH8.6);染色液；漂洗液；透明液；溶液 A(Acr29.2g , Bis0.8g加蒸儲(chǔ)水至100mL);溶液 B (Tris-HCl PH8.8 ,18.15g 力口 80mLzK);溶液 C (0.5mol/L Tris-HCl PH6.8, 6g 力口 60mL ； 10%SDS樣 品緩沖液；電極緩

20、沖液；( 3) 儀器：層析柱；離心機(jī)；恒流泵；紫外檢測(cè)儀；記錄儀；醋酸纖維薄膜等2.2方法2.2.1 半飽和取硫酸銨粗級(jí)分離： 取兔子血清2mL；逐滴加入飽和硫酸鏤溶液 2.0mL,邊加邊輕輕振蕩混勻；室溫靜置10 分鐘，3000 rpm 10 分鐘；上層清液為純化白蛋白，沉淀物即為丫-球蛋白。2.2.2 白蛋白的分離與純化2.2.2.1 SephadexG-25層析脫鹽: 平衡：用3 倍體積的0.02mol/L,PH 6.5 醋酸銨緩沖液平衡；上樣： 旋下上蓋，慢慢打開(kāi)底口使凝膠床上的液面下降到與床面相齊，夾死底口；加樣， 用長(zhǎng)的吸管吸取1.5mL白蛋白粗制樣品，離柱床面1-2cm距離，環(huán)壁

21、小心緩慢加樣；清洗管壁，用約 300uL緩沖液 清洗 3 次；洗脫：以1mL/min的洗脫速度；收集：核酸蛋白檢測(cè)儀在 0.05A檔、走紙速度6cm/h、100mV同時(shí)記錄吸光度值。2.2.2.2 DEAE-纖維素離子交換層析（梯度洗脫）平衡：用3倍體積的0.02mol/L,PH 6.5醋酸鏤緩沖液平衡；加樣：將經(jīng)SephadexG-25層析脫鹽的白蛋白加到纖維柱上，方法同上；洗脫： 用流速為1mL/min， 0.06mol/L,PH 6.5 醋酸銨緩沖液和0.5mol/L,PH 6.5 醋酸銨緩沖液進(jìn)行梯度洗脫；收集：同上。2.2.3 丫-球蛋白的分離與純化2.2.3.1 SephadexG

22、-25層析脫鹽： 平衡：用3倍體積的0.0175mol/L,PH 6.3 磷酸鹽緩沖液平衡；上樣：用長(zhǎng)的吸管吸取1.5mL 丫-球蛋白粗制樣品，緩慢加到柱床上；洗脫：以1mL/min的洗脫速度；收集：同上。2.2.3.2 DEAE-纖維素離子交換層析 平衡：用3倍體積的0.0175mol/L,PH 6.3 磷酸鹽緩沖液平衡； 上樣：同上； 洗脫：同上； 收集：同上。2.2.3.3 丫-球蛋白的親和層析法純化平衡：用2-3倍PH8.9的結(jié)合緩沖液平衡，流速為 0.5mL/min；2.2.4 上樣：將經(jīng)DEAE純化的丫-球蛋白溶液上柱；2.2.5 洗脫：用5倍床體積的緩沖液I和緩沖液H洗脫；2.2

23、.6 收集：每個(gè)ep 管預(yù)先盛有1mol/mLTris-HCl PH8.5 緩沖液500uL, 然后收集吸收峰；柱再生：用PH3.0,0.1mol/L 檸檬酸40mL自柱再生。2.2.4 考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備（具體參見(jiàn)生命物質(zhì)制備與分析技術(shù)） 樣液的測(cè)定（具體參見(jiàn)生命物質(zhì)制備與分析技術(shù)）2.2.5 SDS-PAGE 測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量 裝好垂直平板電泳槽 分離膠的灌制 濃縮膠的配置和灌制 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的制備 電泳 染色和脫色 拍照 相對(duì)分子量的計(jì)算2.2.6 醋酸纖維薄膜電泳分離鑒定蛋白質(zhì) 準(zhǔn)備和點(diǎn)樣 電泳 染色 拍照2.27 高效液相色譜法（High perfo

24、rmance Liquid Chromatography， HPLC）1 、 打開(kāi)計(jì)算機(jī)，打開(kāi)1100LC 各模塊電源，代各模塊自檢完成后進(jìn)入化學(xué)工作站。2、從"Metho球單中選擇"Edit entire Method®,設(shè)置參數(shù)如下：輸液泵：B 泵：H2O+0.1% TFA （ 70）D 泵： ACN （ 30）流速：0.8ml/min最大壓力：230bar最小壓力：30bar峰寬：0.05min（/s）波長(zhǎng)：280nm梯度洗脫時(shí)間（表1 ） ：B泵D案30s100%0%5rmn3。,100%0%21 nun10%90%30mm10%90%36nin100%0

25、%（表1）3、上樣準(zhǔn)備：1）清洗進(jìn)樣針：用CAN吸打進(jìn)樣針35次，再用ddH2。清洗數(shù)次后涼干。2）樣品用一次性注射器過(guò)濾膜過(guò)濾。3）用微量進(jìn)樣器吸ddH2O清洗進(jìn)樣閥（注意避免將氣泡注入進(jìn)樣閥， 進(jìn)樣針頭外沾的水用紙 洗干，吸三次）。4、上樣：上樣量為10ul,用微量進(jìn)樣器吸取35被上樣的體積推入進(jìn)樣閥（load狀態(tài)）， 然后迅速有力的扳至inject狀態(tài)。至少1min后，扳回進(jìn)樣閥，這時(shí)才能將微量進(jìn)樣器拔出。5、數(shù)十分鐘后，分析即可完畢，在 offline狀態(tài)分析數(shù)據(jù)。6、試驗(yàn)結(jié)束：降低流速，卸柱。關(guān)閉化學(xué)工作站和計(jì)算機(jī)，然后關(guān)閉1100LC各模塊，各流動(dòng)相瓶里倒入20%乙醇，以免長(zhǎng)菌和微

26、生物堵住塞板。三實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析3.1 半飽和取硫酸錢(qián)的粗級(jí)分離本次實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備好了兔血清，可以直接開(kāi)始用于實(shí)驗(yàn)。由于血清放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，兔 血清經(jīng)半飽和取硫酸俊粗級(jí)分離離心后，可見(jiàn)離心管中底部為白色沉淀，上請(qǐng)液為微 紅透明。3.2 血清白蛋白的分離與純化這一個(gè)步驟是比較關(guān)鍵的一步。從這里我們開(kāi)始逐漸上手。因此對(duì)于各種儀器和 熟練操作，已經(jīng)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的大體了解都是非常必要的。SepHadexG-25層析柱月鹽（100毫安 走紙速度6cm/h）（圖一）。數(shù)據(jù)：1# 1246 0.5ml 左右2# 4654 0.5ml 左右3# 5448 0.5ml 左右4# 4720 0.5ml 左右因?yàn)樵诜逯禃r(shí)，血清白

27、蛋白濃度最大，所以取2#、3#管繼續(xù)做DEAE-纖維素分 離，第四管留做鑒定。圖一：血清白蛋白脫鹽DEAE-纖維素分離血清白蛋白(圖二)圖二：DEAE-纖維素分離血清白蛋白圖三 血清t-球白的分離與純化數(shù)據(jù)：1# 4252# 261303# 1304404# 4402205# 2201066# 106627# 62408# 31279# 2721實(shí)驗(yàn)最初的結(jié)果是比較理想的，因?yàn)槲覀冇涗浀搅艘粋€(gè)很明顯的單峰。但是后來(lái)出現(xiàn)了問(wèn)題，我們接了九管每管 0.5ml左右的樣品 后，記錄仍然沒(méi)有回到基線(xiàn)處。 經(jīng)過(guò)大家分析其原因可能有兩點(diǎn)：1由于加了兩管脫鹽的樣品導(dǎo)致上樣量太大；2儀器本身不穩(wěn)定。3.3 血清

28、丫-球蛋白的分離與純化：血清丫-球蛋白的SepHadexG-25層析柱脫鹽(見(jiàn)圖三左半部分)數(shù)據(jù)：1#20692#69703#70604#6020由于峰值在2 # 3 #管，因此取其做DEAE-纖維素柱分離。在第三 管時(shí)有一個(gè)小小的回峰，大家分析覺(jué)得這可能有兩種原因，一是由于柱 體裝的不好引起，另外也可能是洗樣時(shí)沒(méi)有洗干凈，導(dǎo)致平衡液中仍 然遺留了一些樣品，過(guò)柱產(chǎn)生了時(shí)差。DEAE-纖維素柱分離丫-球蛋白結(jié)果與討論：(見(jiàn)圖三右半部分)我們從核酸蛋白檢測(cè)儀吸收值為 1時(shí)開(kāi)始收集，最終得到5管，每管吸收值范圍分別是：1 (112) 2 (126) 3 (63) 4 (31) 5(30),除5#管量

29、約為0.5ml外，每管約為1.2ml。開(kāi)始的時(shí)候因?yàn)椴僮鞑皇炀?，比較松懈，筆沒(méi)壓好，這樣導(dǎo)致前半段出峰未記錄。但大家從所記錄的半段峰看，還是能觀(guān)察到 出現(xiàn)一個(gè)清晰的蛋白質(zhì)各組分電荷密度不同，電荷量不一，等電點(diǎn)的差異以及峰形，這樣證實(shí)粗分離已得到較好的丫-球蛋白!DEAE-纖維素柱分離白蛋白結(jié)果與討論：我們從核酸蛋白檢測(cè)儀吸收值為 4時(shí)開(kāi)始收集，最終得到11管，每管吸收值范圍分別是：1# (425) 2# (26130) 3# (130440) 4# (440220) 5# (220106) 6# (10662) 7# (62130) 8# (4031) 9# (3127) 10 (2721),

30、 11# (2119)。每管約為 1.4ml。在記錄儀上，顯示為一個(gè)比較尖的峰，前半段較陡，后邊段較平緩。白蛋白等電點(diǎn)是4.88,本實(shí)驗(yàn)用改變鹽的濃度，剛開(kāi)始收集得到的是3-球蛋白和部分的 “球蛋白，接著的既為白蛋白，理論上應(yīng)該有兩個(gè)峰，但是只觀(guān)察到一個(gè)，不能區(qū)分開(kāi)。所以收集得到的白蛋白還含 有少量的a-球蛋白。親和層析親和層析后結(jié)果并不理想，只出現(xiàn)了兩個(gè)層析峰。3. 4考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：蛋白質(zhì)濃度(ug/ml)0102030406080吸光度004260.3000.4210.5070.6450.812樣品血清白般白脫鹽白蛋白球蛋白脫就球近白(DEAE)親和層析1親和層

31、折2吸阻度1.1120.1710 5110.2050.427濃度(ug/ul)要664.6L 93 310.50 5105201標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)應(yīng)為一條過(guò)原點(diǎn)的直線(xiàn)，我們制彳標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的值為蛋白質(zhì)濃度為080 ug/ml ,吸光度為00.812之間，可能由于槍不準(zhǔn)，導(dǎo)致取樣量不準(zhǔn)，我們制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)略有偏差。 而為了保證樣品的吸光度在范圍之內(nèi)，我們把樣品稀釋了十倍，測(cè)出以上結(jié)果。附：蛋白濃度計(jì)算公式：c=95.2381A-8.647680<c< 10 (ug/ml)該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)明顯不足就是信度較差。但單從數(shù)據(jù)趨勢(shì)來(lái)看是比較理想的。數(shù)據(jù)波動(dòng)比較大的主要原因可能有：由于移液器的精度問(wèn)題，在移液過(guò)程

32、中，標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量并不完全符合梯度。這樣 由于標(biāo)準(zhǔn)品自身的波動(dòng)性造成了標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)差較大，數(shù)據(jù)的波動(dòng)較大。其次，由于樣品比較多，因而可能出現(xiàn)加樣時(shí)間差異也有所不同，從而導(dǎo)致顯色程度不一，因而沒(méi)有線(xiàn)性規(guī)律，造成曲線(xiàn)波動(dòng)較大。再次，仍然涉及到儀器的問(wèn)題。移液器不準(zhǔn)還可能導(dǎo)致考馬斯亮藍(lán)染液加入濃度不一。不過(guò)這不是主要的，因?yàn)榭捡R斯亮藍(lán)總是過(guò)量的，而且沒(méi)有結(jié)合的染料在該波長(zhǎng)下沒(méi)有明顯吸收峰。主 要的原因是分光光度計(jì)測(cè)量精度的問(wèn)題。由于使用的人比較多，所以出現(xiàn)要等候的現(xiàn)象，這樣必然 造成了顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的現(xiàn)象，因而可以出現(xiàn)顯色誤差。最后，由于混合不均或者是加各個(gè)試劑的間隔時(shí)間的差異，也可能造成了該曲線(xiàn)的不

33、理想。3.5 SDS-PAGE點(diǎn)樣順序從左到右依次為血清、白蛋白 脫鹽、白蛋白過(guò)柱、Mark、丫-球蛋白脫鹽、 丫 -球蛋白過(guò)拄、丫-球蛋白法和層析1和丫- 球蛋白親和層析2。由于蛋白質(zhì)定量的問(wèn)題，血清和丫-球蛋 白親和層析1蛋白都沒(méi)有跑出條帶。另外由于 膠不是很理想，最開(kāi)始拿了幾個(gè)膠都是漏的， 實(shí)際跑的時(shí)候膠也不是太好，因此 Mark跑得圖四 SDS-PAGE都不清晰，只能見(jiàn)五條帶，并且五條帶做帶做標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)遷移標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)偏差很大。3.6 醋酸纖維薄膜電泳分離鑒定蛋白質(zhì)1 .血清蛋白質(zhì)是一種生物大分子。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)帶正電荷的時(shí)候， 在電場(chǎng)中由陽(yáng)極向陰極泳動(dòng)；帶負(fù)電荷時(shí)，在電場(chǎng)中則由陰極向陽(yáng) 極

34、泳動(dòng)。蛋白質(zhì)的泳動(dòng)速度與分子量、游離狀態(tài)和所帶電荷多少有 關(guān)。2 .臨床意義：（1）急性肝炎：發(fā)病早期蛋白質(zhì)電泳無(wú)變化，發(fā) 病兩周后白蛋白、a 2及3球蛋白減少，丫球蛋白增高。（2）慢 性肝炎：丫球蛋白升高，白蛋白下降較急性肝炎顯著。（3）肝硬化：白蛋白、”1、”2球蛋白均明顯下降，丫球蛋白極度升高。（4）肝 細(xì)胞癌：蛋白變化除a 1和a 2增高外，其它改變與肝硬化相同。但 在a 1和白蛋之間可出現(xiàn)甲胎蛋白的區(qū)帶。（5）其它的肝膽疾患和肝外疾患如淤血肝、多發(fā)性骨髓瘤和腎病綜合征等可引起各種蛋白 含量的變化。血流生白尿等電戲分于屋、忌蛋臼的空1清蛋白4 6469 00057-7?2ol 一壞玩白

35、5 06200 000"53心一陣朱白5.064-91R，串近門(mén)s n90Po醛 150 0006 m5下一球盅門(mén)1>6 OCKJ -5*012-20正常人血清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，分子量：4.據(jù)實(shí)驗(yàn)原理中所列幾種血清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，可推測(cè)它們?cè)?pH8.6的巴比妥緩沖液中帶 負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極方向泳動(dòng)，因泳動(dòng)速度不同而被分離。依次為清蛋白 A、“1、”2、3 和丫-球蛋白。按所帶電荷來(lái)看，血清白蛋白所帶電荷最多，所以跑在最前；丫-球蛋白帶電荷最少， 跑在最后。由于a 1、a 2球蛋白等電點(diǎn)相同，即所帶負(fù)電荷相同，但 a 1球蛋白比a2球蛋白 分子量要小，所以其泳動(dòng)速度要比后者快

36、。但在電泳過(guò)程中，常常因?yàn)橛緞?dòng)距離太短，而使 a 1、圖六 血清白蛋白醋酸纖維電泳條帶a 2球蛋白條帶不易分開(kāi)。5 .我們實(shí)驗(yàn)所得的白蛋白點(diǎn)樣 醋酸纖維膜中，可以明顯的看到白蛋 白的條帶。但同時(shí)在其后有一條比較 淺的帶，應(yīng)該是我們?cè)诎椎鞍追蛛x純 化過(guò)程中沒(méi)有被分離掉的雜質(zhì)。6 .我們實(shí)驗(yàn)所得的 丫-球蛋白 點(diǎn)樣醋酸纖維膜中，也出現(xiàn)了四條， 這是由于我們?cè)陔姌舆^(guò)程中拿錯(cuò)了樣 品doffer管，用的是脫鹽后的丫 -球蛋 白所造成的，由于沒(méi)有經(jīng)過(guò)純化，所 以在電泳中，各個(gè)雜質(zhì)也都出現(xiàn)了條 帶。圖七丫-球蛋白點(diǎn)樣醋酸纖維膜3.7高效液相色譜法(High performance Liquid Chrom

37、atography, HPLC)vwdi 丸nm 取時(shí)FUP1 日FUF1 與削Ei DFUP-F7附E切圖八：IgG1的高效液相色譜圖用RPHPLC法檢測(cè)丫-球蛋白IgG1和IgG2的純度，結(jié)果如圖八、圖九所示:mMlI* *新富，鼎泰AT日0 nffr6OHCV%沁4100(»1.印1 , gnnf.jg。圖九：IgG2的高效液相色譜圖箕中； ：梯度洗脫時(shí)R泵的百分比；佛度洗脫時(shí)D泵的百分比:基線(xiàn)：色潸流出曲線(xiàn) 橫坐標(biāo)為時(shí)間：縱坐標(biāo)為吸光值1）在4min左右出現(xiàn)數(shù)個(gè)雜峰（圖八在 4.019min,圖九在3.81min）,這說(shuō)明一些沒(méi)掛柱的雜 蛋白被洗脫出來(lái)。2）在洗脫過(guò)程中當(dāng)乙睛

38、濃度大于 75%W勺19min）時(shí)，蛋白質(zhì)變性而被洗脫下來(lái)，所以19min 之后的色譜峰也是雜峰。3）分析得到的IgG1和IgG2主峰如圖十和圖H一所示：圖十：IgG1主峰的色譜圖圖IgG2的主峰色譜圖4) IgG1有三個(gè)主峰，保留時(shí)間分別為16.537min、16.773min、17.475min；峰高分別為4.25、 、11.32、13.95;峰寬分別為0.32、0.67、0.46。三個(gè)峰并未完全分離，其中前兩個(gè)峰離的 較近。5) IgG2 有三個(gè)主峰，保留時(shí)間分別為16.320min、16.511min、17.307min、17.484min；峰高分別為20.72、27.20 13.15

39、、18.80;峰寬分別為0.58、0.79、0.32、0.38。四個(gè)峰也并未完 全分離，其中前兩個(gè)峰和后兩個(gè)峰分別離的較近，第一、三號(hào)主峰可以視作第二、四號(hào)主峰的 附屬峰。、6) IgG1和IgG2的色譜圖的重疊圖如圖十二所示：“兒 S«»hpI D *UfI,TR*1! * Mif ”的用心 mi IH醇21H中中SF X 靜mrii rwri, Boivi>i!i： qA"圖十二：IgG1和IgG2色譜圖重疊圖圖中顯示IgG1和IgG2的色譜圖有點(diǎn)相似，但可以明顯得出 IgG1和IgG2是不同物質(zhì)。7)凝膠柱層析結(jié)果顯示丫 -球蛋白為單一的一個(gè)峰，親和層

40、析結(jié)果顯示 丫 -球蛋白有兩個(gè) 峰IgG1與IgG2,而RPHPLC IgG1和IgG2的純度，又顯示出數(shù)個(gè)主峰。這表明 RFHPLC 的靈敏度是最高的，一般而言 RPHPLC結(jié)果顯示一個(gè)色譜峰即表示一個(gè)純品。3. 6總體分析在實(shí)驗(yàn)的最開(kāi)始，最關(guān)鍵的是仔細(xì)聽(tīng)老師對(duì)于實(shí)驗(yàn)的介紹，記下每一個(gè)實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)。如果 這一步?jīng)]有仔細(xì)聽(tīng)講，將會(huì)在后面的實(shí)驗(yàn)中遇到很多難題。因此這是整個(gè)實(shí)驗(yàn)最重要的一步。 在本次實(shí)驗(yàn)中由于有了前兩天的一批同學(xué)的實(shí)驗(yàn)作為前提，因此有了許多讓我們借鑒，避免我 們實(shí)驗(yàn)中走彎路的經(jīng)驗(yàn)。這也是這次實(shí)驗(yàn)讓我們慶幸的地方。雖然在實(shí)驗(yàn)中也遇到了一些意外，但是基本都能很好地解決。整個(gè)實(shí)驗(yàn)做下來(lái)，使用

41、了很多儀器，接觸了許多的操作方法。特別是在第二天的操作中， 接觸到了 HPLC的使用，花了一個(gè)上午的時(shí)候詳細(xì)了解了一些基本的原理和操作注意事項(xiàng)，并 且了解了真空冷凍干燥機(jī)的一些使用須知，這對(duì)于以后自己的實(shí)驗(yàn)都是非常有幫助的。整個(gè)實(shí) 驗(yàn)的過(guò)程總體還是相當(dāng)順利的， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果也比較理想。在實(shí)驗(yàn)中首先應(yīng)該了解清楚實(shí)驗(yàn)的原理， 必須嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)的操作來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。比如在上樣的時(shí)候，針應(yīng)該如何操作，應(yīng)該嚴(yán)格按照要 求，在使用之前應(yīng)該把所有要點(diǎn)在心中牢記，這樣不會(huì)導(dǎo)致因?yàn)槟骋粋€(gè)步驟的失誤造成重大損失。在上樣以后，膠就不能再移動(dòng)了，否則這樣會(huì)影響跑膠的效果。如此這些實(shí)驗(yàn)中最細(xì)小的要點(diǎn)，都是非常關(guān)鍵的，這直接影響

42、了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量。在實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)該注重協(xié)作。當(dāng)實(shí)驗(yàn)儀器要排隊(duì)使用的時(shí)候，更需要實(shí)驗(yàn)人員的分工合作。四、參考文獻(xiàn)1.Hardy W B. Physiol J.(London),1899(24):2882.Hardy W B. Proc. Roy. Soc.,1900(66):1103.Hardy W B. Physiol J.(London),1905(33):2514.Tiselius A. Trans. Faraday Soc.,1937(33):5245.Longsworth L G. Chem. Rev.,1942(30):3236 .Armstrong S H, Jr Budka M J

43、 E, Morrison K C. J. Am. Chem. Soc.,1947(69):4167 .Ricketts W E, Sterling K. J. Clin. Invest.,1949(28):14778 .Marrack J R, Hoch H. J. Clin. Pathol.,1949(2):1619 .Hames B D, Richwood. Gel Electrophoresis of Protein: The Pratical Approach Series. IRL Prss, OXFORD.1990.410 .Hjerten S. Arch. biochem. Bi

44、ochem. Biophys. Suppl.,1962(1):14711.Ott H. Prot. Biol. Fliuds,1963(10):30512 .Williams D E, Reisfeld R A. Ann. N.Y. Acad. Sci.,1964()121:37313 .Jovin T M. Biochemistry,1973(12):871,879,89014 .Users Manual of Multiphor II Electrophoresis System, Pharmacia Lk B Biotechnology AB Uppsala, Sweden,1992.1

45、6117115 .Richads E G,Coll J A, Gratzer W B.Anal. Biochem.,1965(12):45216 .Ferguson K A,Metabolism 1964(13):98517 .Hedrick J L, Smith A J. Arch. Biochem. Biophys,1968.(126):15518.Shapiro A L,Vinuela E, Maizel J V Jr. Biochem. Biophys. Res. Commun.,1967(28):81519.Weber K, Osborn M. J. Biol. Chem.,1969(244):440620.Gueffroy, D.E. ed. 1975Calbiochem Buffers: A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems.21.Stryer, L. 1988. Biochemistry,Third Edition. New York: W. H. Freeman and Company.22.Blanchard,J. S. 1984.Buffers for Enzymes. Meth. E