血清蛋白質的分離純化與鑒定

1、血清蛋白質的分離純化與鑒定劉歡 1 張唯 2 趙瀾 2 彭垠婷 2 徐波 2 郭小李 2(1 生化專業(yè)細胞生物學51041300069 導師：張紅鋒;2 華東師范大學生命科學學院)摘要：通過系統(tǒng)的生化制備與分析實驗，讓學生基本掌握了包括脫鹽、親和層析、醋酸纖維薄膜電泳、SDS-PAGEHPLC冷凍干燥在內的生化技術。從而為以后的科研工作打好基礎。關鍵詞：層析；電泳 ； SDS-PAGEAbstract:By doing biochemichal preparing and analyzing experiment, technologies such as protein concentrat

2、ion detecting,enzyme activity testing, chromatography, acetate green electrophoresis, HPLC ,SDS-PAGE and other biotechnological techniques are mastered. Students are made qualified to their research work.Keywords: chromatography ; electrophoresis ; SDS-PAGE一、前言生命物質的制備和分析是現代生物化學中必不可少且又非常實用的技術。本實驗通過對兔

3、血清蛋白的分離，讓我們基本掌握常用的技術，初步了解了純化技術的整體步驟和整個生化技術的整體流程， 為我們以后自己分離純化蛋白質產物建立了一個基本的概念，以及為以后的研究工作打下基礎。這些技術都是常用而成熟的技術，但是一個多世紀以來，盡管生物技術有了飛速發(fā)展，它們仍一直在發(fā)揮著重要的，不可替代的作用。這些技術包括：(一) 蛋白質檢測技術電泳技術Hardy"2'3發(fā)現，許多生物膠體，如蛋白質、酶等有特征的電泳遷移率(electrophoretic mobilities)。 此遷移率在很大程度上取決于溶液的pH。因此利用電泳特征作為對物質的鑒定引起人們廣泛的興趣。 20 世紀的 2

4、0 年代和 30 年代，電泳理論和實踐有了很大的發(fā)展。Tiselius 教授首先證明了血清是由白蛋白，“、3和丫球蛋白組成的4。人血清蛋白用界面移動方法分離的最佳條件是0.1mol/L(pH8.6)的巴比妥緩沖液，此時白蛋白具有最快的遷移速度，接著依次為“1、”2、3和丫球蛋白 58。生物大分子如蛋白質、核酸、 多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質的H+濃度或與其他大分子的相互作用。在電場中，帶電顆粒向陰極或陽極遷移，遷移的方向取決于它們帶電的符號，這種遷移現象即所謂電泳。遷移的方式目前可分為三類：根據分子尺寸大小、分子所帶的電荷或分子的生物學與化學特征。電泳遷移率(mobili

5、ty) m 規(guī)定為在電位梯度E 的影響下，顆粒在時間t 中的遷移距離d。聚丙烯酰胺凝膠(plyacrylamide gel,PAG)是由丙烯酰胺(acrylamide)和交聯(lián)試劑N,N，-甲叉 雙丙烯酰胺(N,N z -methylenebisacrylamide)在有引發(fā)劑和增速劑的情況下聚合而成的。聚丙烯酰 胺的單體形成長鏈，由N,N -甲叉雙丙烯酰胺的雙功能基團和鏈末端的自由功能基團反應而發(fā)生交聯(lián)。其化學結構已經清楚9。聚丙烯酰胺的特性，包括其機械性能、彈性、透明度、粘著度以及孔徑大小均取決于兩個重要的參數 T 和C。 T 是兩個單體的總百分濃度。C 是與總濃度有關的交聯(lián)百分濃度。Hje

6、rten 教授 10在 1962年引入以下兩個公式來進行計算。T=(a+b)/m 100(%)C=b/(a+b) 100(%)A為丙烯酰胺的克數(g), b為N,N，-甲叉雙丙烯酰胺的克數(g), m為水或緩沖液的終體積 (ml)。其中a和b的比例是很重要的11。PAGE 電泳根據原理，需要在以下方面做選擇：1) pH 的選擇考慮原則有：合適的分離膠緩沖系統(tǒng)、先導離子、尾隨離子、濃縮膠緩沖系統(tǒng)、反向離子及電泳緩沖液12,13。2) 離子強度的選擇。一般來說，離子強度在0.010.1mol/L14,最常用的為0.05mol/L15。3) 凝膠濃度的選擇。濃度太大則孔徑較小，樣品留在加樣位置；太小

7、則不能很好分離。所以必須通過實驗來選擇最佳的濃度。4) 分子量的測定。1964年Feerguson16首先在淀粉凝膠中證明了蛋白質分子的遷移率m的對數或相對遷移率Rf的對數對凝膠濃度T% 作圖，可以得到一條直線。這個現象接著在1968 年由 Hedrick 和 Smith 17在聚丙烯酰胺凝膠中證實。SDS-PAGE技術首先在1967年由Shapiro18等建立，1969年由Weber和Osborn19進一步完善。他們發(fā)現在樣品介質和聚丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而電荷因素可以被忽略。SDS 是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性

8、試劑，它能斷裂分子內和分子間的輕鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質分子的二級和三級結構。強還原劑，如疏基乙醇(3-mercaptoethanal和二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)則能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂，消除了分子間原有的電 荷差異。(二) 蛋白質的分離提取蛋白質是一種極具多相性的生物大分子，離開其天然環(huán)境，蛋白質分子極不穩(wěn)定，在細胞中和抽提液中的蛋白質的性狀也不盡相同。蛋白質有多種類型，通過不同的方法我們可區(qū)分為可溶性蛋白、膜結合蛋白、具有催化功能的蛋白或結構蛋白及轉錄調節(jié)蛋白。從正常生物基質中提取各種蛋白質均需要有特定的條件。如果不能滿足這一條件，蛋白將很快的失去生

9、物學活性，其生物半衰期也將迅速降低。因此，在蛋白質的特性研究中，確定提取條件是一個關鍵問題。在不同實驗中遇到的困難也各不相同，有些式樣中的困難是如何維持酶的活性。在不同實驗中要針對不同的情況來解決不同的問題。然而對蛋白質研究而言卻有著一些共同的參數。1) .緩沖液。緩沖液可以抗衡蛋白質溶液中的pH 值的改變，選擇合適的緩沖液對于維持一定pH值下蛋白質的穩(wěn)定及保證實驗的重復性十分重要20,21。a.應對 pKa 相近的一些緩沖液進行實驗，良的相互作用22。以避免有的緩沖液與所研究的蛋白質之間發(fā)生不b. 當選定一種緩沖溶液后，一般使用其最低的濃度以避免非特異性的離子強度的影響。通常以50mmol/

10、L 的緩沖液濃度作為實驗的起始濃度。c. 當緩沖液pKa 值的變化超過一個1pH 單位時其有效的緩沖能力明顯降低。而許多酶在極限pH 值時往往發(fā)生不可逆的變性23。d. 大多數動物細胞在37的生理狀況下的pH 值為7.07.5， 而在溫度下降至接近0時可達8.024。e. 要根據所選用的分離方法選用緩沖溶液：凝膠過濾方法大多數緩沖液均可適用。陰離子交換層析，陽離子緩沖液首選Tris 緩沖液。 陽離子交換和羥基磷灰石層析，陰離子緩沖液首選磷酸鹽緩沖液22。f. 混合緩沖液在一定的離子強度下往往具有更寬的緩沖范圍25。g. 在低溫時緩沖液和冰點溶劑的情況可參考文獻26。h. 所采用的化學試劑應該達

11、到試劑級或更高純度。2）鹽、金屬離子和螯合劑必須保證保持酶活性所需的離子。同時用螯合劑來螯合對酶保存不利的金屬離子。3）還原劑可以添加一定還原劑來保證酶的還原環(huán)境。4）去垢劑用適當濃度的去垢劑來抽提、沉淀蛋白。也必須選擇合適的濃度。5）其他條件包括表面效應、溫度、 儲存條件等。同時可以用蛋白酶抑制劑來去除蛋白酶對目的蛋白的降解。常用的抑制劑有：PMSF、 EDTA、 pepstatin、 leupeptin、 aprotinin 等。為了純化細胞蛋白質，采用有效的方法進行細胞破碎和固液分離是必要的。它是全過程的第一步，通常是將處于細胞不同位置的待純化蛋白釋放出來，溶入已知成分的溶液內。該步驟是

12、目的蛋白初級分離純化階段的重要環(huán)節(jié)，它直接影響產物的回收率，也可能影響產物的純度。目前建立很多破碎細胞，釋放細胞內容物的方法。根據作用方式不同，基本可以分為兩大類：機械法和非機械法。此類方法和原理可以參看文獻27和1990 年出版的酶學方法（英文）182 卷。（三）蛋白質分離純化技術蛋白質分離純化除了簡單的離心、沉淀等方法以外，目前常用和最為有效的方法是層析技術，包括離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析以及由此技術延伸的HPLC 等技術。1 .離子交換層析在純化蛋白質的層析手段中使用最為廣泛。它對蛋白質的分辨率高，操作簡單，重復性好，成本低。此方法適合于蛋白質粗提物的初始純化。a） 蛋白質的等

13、電點是進行離子交換層析的重要依據。b） 離子交換劑與蛋白質的結合。離子交換劑以自身所帶相反電荷與蛋白質的凈電荷結合。c） 蛋白質純化的一般程序。蛋白質溶液進入離子交換柱后，與離子交換樹脂無親和力的蛋白質被洗脫。d） 常用蛋白質洗脫策略。常用方法是加大反荷離子的濃度。e） 不同反荷離子對洗脫的影響。f）其他蛋白質洗脫策略。離子交換時改變液相中緩沖體系的pH值是一種降低蛋白質與樹脂親和力的辦法。g）緩沖液。離子交換用的緩沖液必須慎重選擇，若緩沖能力不夠強，導致液相pH值的波動，會影響蛋白質與樹脂的結合。利用離子交換層析純化蛋白質在一開始時應該作好兩個決定：選擇最佳的離子交換樹脂和緩沖體系；如何洗脫

14、蛋白質。2 .凝膠過濾層析又稱為大小排阻、凝膠排阻、分子篩或凝膠過濾層析28,29。這種方法利用分級分離，明顯降低了因不可逆結合所造成的蛋白質損失和失活。此外，可利用此方法更換蛋白質的緩 沖液活降低緩沖液的離子強度。 純化一個分子量較大的蛋白質。 純化的第一步可以使用凝膠過濾層 析。溶質分子在移動相和固定相之間的分配系數Kd來表示凝膠過濾層析的特性：Kd=（Ve-Vo）/Vi。凝膠過濾層析還可以運用于： 分子量測定，去除低分子量的雜質，從二聚體和其他寡聚體中分 離目的蛋白，更換蛋白質的緩沖液，研究蛋白質與配基的結合30,31等。3親和層析是一類純化方法，它包含各種各樣的形式，但其共同特征是均以

15、蛋白質和結合在介 質上的配基間的特異親和力為工作基礎。配基可以是生物學特異的，例如一個肽、一個抗體、一個 底物、一個抑制劑、一個輔酶或核酸等；配基也可以是具有相對特異相互作用的凝集素、染料或疏 水分子等。很多情況下，蛋白質和某些生物大分子的生物學功能在于它們能夠特異地和可逆地與相 應配基相互作用。所以說，親和層析選擇性強、純化效率高，常常可以一步獲得滿意的純化效果。 因為它應用的是生物特異性而不是依賴于物理化學性質，故常用于分離低濃度的蛋白質。（四）蛋白質的分析方法。我們得到了很純的蛋白后就要對其進行一些性質的測定。本實驗我們主要測定了蛋白的濃度、 酶活和米氏常數等性質。1） 考馬斯亮藍能與蛋

16、白質的疏水微區(qū)相結合 陽,這種結合具有高敏感性?？捡R斯亮藍G250的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在 465nm。當它與蛋白質結合形成復合物時呈藍色， 其最大吸收峰改變?yōu)?95nm，考馬斯亮藍G250-蛋白質復合物的高消光效應導致了蛋白 質定量測定的高敏感度。在一定范圍內，考馬斯亮藍G250-蛋白質復合物呈色后，在595nm下，吸光度與蛋白質含量呈線形關系， 故可以用于蛋白質的測定。 樣品蛋白質含 量應該在10-100 pg為宜。一些陽離子和乙醇對測定無影響， 而大量的去污劑會嚴重干 擾實驗33,34。2） 在一定發(fā)pH和溫度下，待測液中的堿性磷酸酶作用于基質中的磷酸苯二鈉，使之水解放出酚。酚在

17、堿性溶液中與 4-氨基安替比林作用并經鐵氧化鉀氧化，生成紅色醍類化 合物，根據紅色深淺可以測定酶活力高低，從而計算出酶的活力單位。每克組織蛋白在 37c與基質作用15min產生1mg酚作為一個活力單位。影響酶促反應的主要因素包括 pH、溫度、激活劑與抑制劑等 網。磷酸苯二鈉+H2O AKP 苯酚+磷酸氫二鈉 4-氨基安替比林+苯酚顯色劑（OH-）紅色醍衍生物3） 1913 年前后，Michaelis 和 Menten 在前人工作的基礎上，做了大量的定量研究，積累了足夠的實驗證據，從而提出酶促動力學的基本原理，并歸納為一個數學式加以表達：V=VmaxS/(Km+S)。這個式子被稱為米氏常數，它的

18、前提是酶與底物反應的“快速平 衡說”。Km值是當酶促反應速度達到最大反應速度一半時的底物濃度，它的單位是摩爾/升，與底物濃度的單位一樣36。生命物質的制備技術是一種重要的研究手段。不論科技如何發(fā)展，這些技術可能會被改進，但永遠不可能被替代。掌握了這些基本技術及其原理，就掌握了研究生命秘密的的有效武器。因此本實驗的意義不僅在于對本實驗涉及的技術和物質的掌握，更重要的是我們能舉一反三，在以后的工作中遷移運用這些技術。二、材料與方法2.1 材料( 1) 實驗動物：兔子(2)試劑：飽和(NH4)2SO4 溶液；0.0175mol/L,PH 6.3 磷酸鹽緩沖液；SephadexG-25; DEAE-纖

19、維素； 10%三氯乙酸；鈉氏試劑；0.5mol/L,PH 6.5 醋酸銨緩沖液；0.06mol/L,PH 6.5 醋酸銨緩沖液；0.02mol/L,PH6.5醋酸鏤緩沖液；血清樣品；衛(wèi)合緩沖液；緩沖液I ( PH7.0 PBS);緩沖液H ( PH3.0 PBS);巴比妥-巴 比妥鈉緩沖液(PH8.6);染色液；漂洗液；透明液；溶液 A(Acr29.2g , Bis0.8g加蒸儲水至100mL);溶液 B (Tris-HCl PH8.8 ,18.15g 力口 80mLzK);溶液 C (0.5mol/L Tris-HCl PH6.8, 6g 力口 60mL ； 10%SDS樣 品緩沖液；電極緩

20、沖液；( 3) 儀器：層析柱；離心機；恒流泵；紫外檢測儀；記錄儀；醋酸纖維薄膜等2.2方法2.2.1 半飽和取硫酸銨粗級分離： 取兔子血清2mL；逐滴加入飽和硫酸鏤溶液 2.0mL,邊加邊輕輕振蕩混勻；室溫靜置10 分鐘，3000 rpm 10 分鐘；上層清液為純化白蛋白，沉淀物即為丫-球蛋白。2.2.2 白蛋白的分離與純化2.2.2.1 SephadexG-25層析脫鹽: 平衡：用3 倍體積的0.02mol/L,PH 6.5 醋酸銨緩沖液平衡；上樣： 旋下上蓋，慢慢打開底口使凝膠床上的液面下降到與床面相齊，夾死底口；加樣， 用長的吸管吸取1.5mL白蛋白粗制樣品，離柱床面1-2cm距離，環(huán)壁

21、小心緩慢加樣；清洗管壁，用約 300uL緩沖液 清洗 3 次；洗脫：以1mL/min的洗脫速度；收集：核酸蛋白檢測儀在 0.05A檔、走紙速度6cm/h、100mV同時記錄吸光度值。2.2.2.2 DEAE-纖維素離子交換層析（梯度洗脫）平衡：用3倍體積的0.02mol/L,PH 6.5醋酸鏤緩沖液平衡；加樣：將經SephadexG-25層析脫鹽的白蛋白加到纖維柱上，方法同上；洗脫： 用流速為1mL/min， 0.06mol/L,PH 6.5 醋酸銨緩沖液和0.5mol/L,PH 6.5 醋酸銨緩沖液進行梯度洗脫；收集：同上。2.2.3 丫-球蛋白的分離與純化2.2.3.1 SephadexG

22、-25層析脫鹽： 平衡：用3倍體積的0.0175mol/L,PH 6.3 磷酸鹽緩沖液平衡；上樣：用長的吸管吸取1.5mL 丫-球蛋白粗制樣品，緩慢加到柱床上；洗脫：以1mL/min的洗脫速度；收集：同上。2.2.3.2 DEAE-纖維素離子交換層析 平衡：用3倍體積的0.0175mol/L,PH 6.3 磷酸鹽緩沖液平衡； 上樣：同上； 洗脫：同上； 收集：同上。2.2.3.3 丫-球蛋白的親和層析法純化平衡：用2-3倍PH8.9的結合緩沖液平衡，流速為 0.5mL/min；2.2.4 上樣：將經DEAE純化的丫-球蛋白溶液上柱；2.2.5 洗脫：用5倍床體積的緩沖液I和緩沖液H洗脫；2.2

23、.6 收集：每個ep 管預先盛有1mol/mLTris-HCl PH8.5 緩沖液500uL, 然后收集吸收峰；柱再生：用PH3.0,0.1mol/L 檸檬酸40mL自柱再生。2.2.4 考馬斯亮藍結合法測定蛋白質濃度 標準曲線的制備（具體參見生命物質制備與分析技術） 樣液的測定（具體參見生命物質制備與分析技術）2.2.5 SDS-PAGE 測定蛋白質相對分子量 裝好垂直平板電泳槽 分離膠的灌制 濃縮膠的配置和灌制 標準蛋白質樣品的制備 電泳 染色和脫色 拍照 相對分子量的計算2.2.6 醋酸纖維薄膜電泳分離鑒定蛋白質 準備和點樣 電泳 染色 拍照2.27 高效液相色譜法（High perfo

24、rmance Liquid Chromatography， HPLC）1 、 打開計算機，打開1100LC 各模塊電源，代各模塊自檢完成后進入化學工作站。2、從"Metho球單中選擇"Edit entire Method®,設置參數如下：輸液泵：B 泵：H2O+0.1% TFA （ 70）D 泵： ACN （ 30）流速：0.8ml/min最大壓力：230bar最小壓力：30bar峰寬：0.05min（/s）波長：280nm梯度洗脫時間（表1 ） ：B泵D案30s100%0%5rmn3。,100%0%21 nun10%90%30mm10%90%36nin100%0

25、%（表1）3、上樣準備：1）清洗進樣針：用CAN吸打進樣針35次，再用ddH2。清洗數次后涼干。2）樣品用一次性注射器過濾膜過濾。3）用微量進樣器吸ddH2O清洗進樣閥（注意避免將氣泡注入進樣閥， 進樣針頭外沾的水用紙 洗干，吸三次）。4、上樣：上樣量為10ul,用微量進樣器吸取35被上樣的體積推入進樣閥（load狀態(tài)）， 然后迅速有力的扳至inject狀態(tài)。至少1min后，扳回進樣閥，這時才能將微量進樣器拔出。5、數十分鐘后，分析即可完畢，在 offline狀態(tài)分析數據。6、試驗結束：降低流速，卸柱。關閉化學工作站和計算機，然后關閉1100LC各模塊，各流動相瓶里倒入20%乙醇，以免長菌和微

26、生物堵住塞板。三實驗結果和分析3.1 半飽和取硫酸錢的粗級分離本次實驗準備好了兔血清，可以直接開始用于實驗。由于血清放置時間過長，兔 血清經半飽和取硫酸俊粗級分離離心后，可見離心管中底部為白色沉淀，上請液為微 紅透明。3.2 血清白蛋白的分離與純化這一個步驟是比較關鍵的一步。從這里我們開始逐漸上手。因此對于各種儀器和 熟練操作，已經整個實驗的大體了解都是非常必要的。SepHadexG-25層析柱月鹽（100毫安 走紙速度6cm/h）（圖一）。數據：1# 1246 0.5ml 左右2# 4654 0.5ml 左右3# 5448 0.5ml 左右4# 4720 0.5ml 左右因為在峰值時，血清白

27、蛋白濃度最大，所以取2#、3#管繼續(xù)做DEAE-纖維素分 離，第四管留做鑒定。圖一：血清白蛋白脫鹽DEAE-纖維素分離血清白蛋白(圖二)圖二：DEAE-纖維素分離血清白蛋白圖三 血清t-球白的分離與純化數據：1# 4252# 261303# 1304404# 4402205# 2201066# 106627# 62408# 31279# 2721實驗最初的結果是比較理想的，因為我們記錄到了一個很明顯的單峰。但是后來出現了問題，我們接了九管每管 0.5ml左右的樣品 后，記錄仍然沒有回到基線處。 經過大家分析其原因可能有兩點：1由于加了兩管脫鹽的樣品導致上樣量太大；2儀器本身不穩(wěn)定。3.3 血清

28、丫-球蛋白的分離與純化：血清丫-球蛋白的SepHadexG-25層析柱脫鹽(見圖三左半部分)數據：1#20692#69703#70604#6020由于峰值在2 # 3 #管，因此取其做DEAE-纖維素柱分離。在第三 管時有一個小小的回峰，大家分析覺得這可能有兩種原因，一是由于柱 體裝的不好引起，另外也可能是洗樣時沒有洗干凈，導致平衡液中仍 然遺留了一些樣品，過柱產生了時差。DEAE-纖維素柱分離丫-球蛋白結果與討論：(見圖三右半部分)我們從核酸蛋白檢測儀吸收值為 1時開始收集，最終得到5管，每管吸收值范圍分別是：1 (112) 2 (126) 3 (63) 4 (31) 5(30),除5#管量

29、約為0.5ml外，每管約為1.2ml。開始的時候因為操作不熟練，比較松懈，筆沒壓好，這樣導致前半段出峰未記錄。但大家從所記錄的半段峰看，還是能觀察到 出現一個清晰的蛋白質各組分電荷密度不同，電荷量不一，等電點的差異以及峰形，這樣證實粗分離已得到較好的丫-球蛋白!DEAE-纖維素柱分離白蛋白結果與討論：我們從核酸蛋白檢測儀吸收值為 4時開始收集，最終得到11管，每管吸收值范圍分別是：1# (425) 2# (26130) 3# (130440) 4# (440220) 5# (220106) 6# (10662) 7# (62130) 8# (4031) 9# (3127) 10 (2721),

30、 11# (2119)。每管約為 1.4ml。在記錄儀上，顯示為一個比較尖的峰，前半段較陡，后邊段較平緩。白蛋白等電點是4.88,本實驗用改變鹽的濃度，剛開始收集得到的是3-球蛋白和部分的 “球蛋白，接著的既為白蛋白，理論上應該有兩個峰，但是只觀察到一個，不能區(qū)分開。所以收集得到的白蛋白還含 有少量的a-球蛋白。親和層析親和層析后結果并不理想，只出現了兩個層析峰。3. 4考馬斯亮藍結合法測定蛋白質濃度 標準曲線：蛋白質濃度(ug/ml)0102030406080吸光度004260.3000.4210.5070.6450.812樣品血清白般白脫鹽白蛋白球蛋白脫就球近白(DEAE)親和層析1親和層

31、折2吸阻度1.1120.1710 5110.2050.427濃度(ug/ul)要664.6L 93 310.50 5105201標準曲線應為一條過原點的直線，我們制彳標準曲線的值為蛋白質濃度為080 ug/ml ,吸光度為00.812之間，可能由于槍不準，導致取樣量不準，我們制作的標準曲線略有偏差。 而為了保證樣品的吸光度在范圍之內，我們把樣品稀釋了十倍，測出以上結果。附：蛋白濃度計算公式：c=95.2381A-8.647680<c< 10 (ug/ml)該標準曲線明顯不足就是信度較差。但單從數據趨勢來看是比較理想的。數據波動比較大的主要原因可能有：由于移液器的精度問題，在移液過程

32、中，標準蛋白的量并不完全符合梯度。這樣 由于標準品自身的波動性造成了標準曲線的標準差較大，數據的波動較大。其次，由于樣品比較多，因而可能出現加樣時間差異也有所不同，從而導致顯色程度不一，因而沒有線性規(guī)律，造成曲線波動較大。再次，仍然涉及到儀器的問題。移液器不準還可能導致考馬斯亮藍染液加入濃度不一。不過這不是主要的，因為考馬斯亮藍總是過量的，而且沒有結合的染料在該波長下沒有明顯吸收峰。主 要的原因是分光光度計測量精度的問題。由于使用的人比較多，所以出現要等候的現象，這樣必然 造成了顯色時間過長的現象，因而可以出現顯色誤差。最后，由于混合不均或者是加各個試劑的間隔時間的差異，也可能造成了該曲線的不

33、理想。3.5 SDS-PAGE點樣順序從左到右依次為血清、白蛋白 脫鹽、白蛋白過柱、Mark、丫-球蛋白脫鹽、 丫 -球蛋白過拄、丫-球蛋白法和層析1和丫- 球蛋白親和層析2。由于蛋白質定量的問題，血清和丫-球蛋 白親和層析1蛋白都沒有跑出條帶。另外由于 膠不是很理想，最開始拿了幾個膠都是漏的， 實際跑的時候膠也不是太好，因此 Mark跑得圖四 SDS-PAGE都不清晰，只能見五條帶，并且五條帶做帶做標準蛋白的相對遷移標準曲線偏差很大。3.6 醋酸纖維薄膜電泳分離鑒定蛋白質1 .血清蛋白質是一種生物大分子。當蛋白質帶正電荷的時候， 在電場中由陽極向陰極泳動；帶負電荷時，在電場中則由陰極向陽 極

34、泳動。蛋白質的泳動速度與分子量、游離狀態(tài)和所帶電荷多少有 關。2 .臨床意義：（1）急性肝炎：發(fā)病早期蛋白質電泳無變化，發(fā) 病兩周后白蛋白、a 2及3球蛋白減少，丫球蛋白增高。（2）慢 性肝炎：丫球蛋白升高，白蛋白下降較急性肝炎顯著。（3）肝硬化：白蛋白、”1、”2球蛋白均明顯下降，丫球蛋白極度升高。（4）肝 細胞癌：蛋白變化除a 1和a 2增高外，其它改變與肝硬化相同。但 在a 1和白蛋之間可出現甲胎蛋白的區(qū)帶。（5）其它的肝膽疾患和肝外疾患如淤血肝、多發(fā)性骨髓瘤和腎病綜合征等可引起各種蛋白 含量的變化。血流生白尿等電戲分于屋、忌蛋臼的空1清蛋白4 6469 00057-7?2ol 一壞玩白

35、5 06200 000"53心一陣朱白5.064-91R，串近門s n90Po醛 150 0006 m5下一球盅門1>6 OCKJ -5*012-20正常人血清蛋白質的等電點，分子量：4.據實驗原理中所列幾種血清蛋白質的等電點，可推測它們在 pH8.6的巴比妥緩沖液中帶 負電荷，在電場中向正極方向泳動，因泳動速度不同而被分離。依次為清蛋白 A、“1、”2、3 和丫-球蛋白。按所帶電荷來看，血清白蛋白所帶電荷最多，所以跑在最前；丫-球蛋白帶電荷最少， 跑在最后。由于a 1、a 2球蛋白等電點相同，即所帶負電荷相同，但 a 1球蛋白比a2球蛋白 分子量要小，所以其泳動速度要比后者快

36、。但在電泳過程中，常常因為泳動距離太短，而使 a 1、圖六 血清白蛋白醋酸纖維電泳條帶a 2球蛋白條帶不易分開。5 .我們實驗所得的白蛋白點樣 醋酸纖維膜中，可以明顯的看到白蛋 白的條帶。但同時在其后有一條比較 淺的帶，應該是我們在白蛋白分離純 化過程中沒有被分離掉的雜質。6 .我們實驗所得的 丫-球蛋白 點樣醋酸纖維膜中，也出現了四條， 這是由于我們在電樣過程中拿錯了樣 品doffer管，用的是脫鹽后的丫 -球蛋 白所造成的，由于沒有經過純化，所 以在電泳中，各個雜質也都出現了條 帶。圖七丫-球蛋白點樣醋酸纖維膜3.7高效液相色譜法(High performance Liquid Chrom

37、atography, HPLC)vwdi 丸nm 取時FUP1 日FUF1 與削Ei DFUP-F7附E切圖八：IgG1的高效液相色譜圖用RPHPLC法檢測丫-球蛋白IgG1和IgG2的純度，結果如圖八、圖九所示:mMlI* *新富，鼎泰AT日0 nffr6OHCV%沁4100(»1.印1 , gnnf.jg。圖九：IgG2的高效液相色譜圖箕中； ：梯度洗脫時R泵的百分比；佛度洗脫時D泵的百分比:基線：色潸流出曲線 橫坐標為時間：縱坐標為吸光值1）在4min左右出現數個雜峰（圖八在 4.019min,圖九在3.81min）,這說明一些沒掛柱的雜 蛋白被洗脫出來。2）在洗脫過程中當乙睛

38、濃度大于 75%W勺19min）時，蛋白質變性而被洗脫下來，所以19min 之后的色譜峰也是雜峰。3）分析得到的IgG1和IgG2主峰如圖十和圖H一所示：圖十：IgG1主峰的色譜圖圖IgG2的主峰色譜圖4) IgG1有三個主峰，保留時間分別為16.537min、16.773min、17.475min；峰高分別為4.25、 、11.32、13.95;峰寬分別為0.32、0.67、0.46。三個峰并未完全分離，其中前兩個峰離的 較近。5) IgG2 有三個主峰，保留時間分別為16.320min、16.511min、17.307min、17.484min；峰高分別為20.72、27.20 13.15

39、、18.80;峰寬分別為0.58、0.79、0.32、0.38。四個峰也并未完 全分離，其中前兩個峰和后兩個峰分別離的較近，第一、三號主峰可以視作第二、四號主峰的 附屬峰。、6) IgG1和IgG2的色譜圖的重疊圖如圖十二所示：“兒 S«»hpI D *UfI,TR*1! * Mif ”的用心 mi IH醇21H中中SF X 靜mrii rwri, Boivi>i!i： qA"圖十二：IgG1和IgG2色譜圖重疊圖圖中顯示IgG1和IgG2的色譜圖有點相似，但可以明顯得出 IgG1和IgG2是不同物質。7)凝膠柱層析結果顯示丫 -球蛋白為單一的一個峰，親和層

40、析結果顯示 丫 -球蛋白有兩個 峰IgG1與IgG2,而RPHPLC IgG1和IgG2的純度，又顯示出數個主峰。這表明 RFHPLC 的靈敏度是最高的，一般而言 RPHPLC結果顯示一個色譜峰即表示一個純品。3. 6總體分析在實驗的最開始，最關鍵的是仔細聽老師對于實驗的介紹，記下每一個實驗要點。如果 這一步沒有仔細聽講，將會在后面的實驗中遇到很多難題。因此這是整個實驗最重要的一步。 在本次實驗中由于有了前兩天的一批同學的實驗作為前提，因此有了許多讓我們借鑒，避免我 們實驗中走彎路的經驗。這也是這次實驗讓我們慶幸的地方。雖然在實驗中也遇到了一些意外，但是基本都能很好地解決。整個實驗做下來，使用

41、了很多儀器，接觸了許多的操作方法。特別是在第二天的操作中， 接觸到了 HPLC的使用，花了一個上午的時候詳細了解了一些基本的原理和操作注意事項，并 且了解了真空冷凍干燥機的一些使用須知，這對于以后自己的實驗都是非常有幫助的。整個實 驗的過程總體還是相當順利的， 實驗結果也比較理想。在實驗中首先應該了解清楚實驗的原理， 必須嚴格遵循標準的操作來進行實驗。比如在上樣的時候，針應該如何操作，應該嚴格按照要 求，在使用之前應該把所有要點在心中牢記，這樣不會導致因為某一個步驟的失誤造成重大損失。在上樣以后，膠就不能再移動了，否則這樣會影響跑膠的效果。如此這些實驗中最細小的要點，都是非常關鍵的，這直接影響

42、了實驗結果的質量。在實驗中，應該注重協(xié)作。當實驗儀器要排隊使用的時候，更需要實驗人員的分工合作。四、參考文獻1.Hardy W B. Physiol J.(London),1899(24):2882.Hardy W B. Proc. Roy. Soc.,1900(66):1103.Hardy W B. Physiol J.(London),1905(33):2514.Tiselius A. Trans. Faraday Soc.,1937(33):5245.Longsworth L G. Chem. Rev.,1942(30):3236 .Armstrong S H, Jr Budka M J

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