黑曲霉產(chǎn)檸檬酸

1、檸檬酸發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化 摘要  檸檬酸（2-羥基丙烷三羧酸），是重要的工業(yè)原料?？蓮闹参镌现刑崛?，也可由糖進(jìn)行發(fā)酵制得。實(shí)驗(yàn)研究了不同硫酸銨濃度分別對(duì)黑曲霉搖瓶發(fā)酵和實(shí)罐發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的影響。在菌濃度、發(fā)酵過(guò)程PH、酸度、殘?zhí)恰囟仍诎l(fā)酵過(guò)程中的變化幾個(gè)方面對(duì)實(shí)罐和搖瓶發(fā)酵進(jìn)行了相關(guān)比較。結(jié)果表明：1）搖瓶發(fā)酵的最適硫酸銨濃度為0.4%；實(shí)罐發(fā)酵最適硫酸銨濃度為0.5%，實(shí)罐發(fā)酵時(shí)硫酸銨濃度過(guò)高將產(chǎn)生大量泡沫不利發(fā)酵；2）實(shí)罐發(fā)酵與搖瓶發(fā)酵在起始含糖量、菌濃度及發(fā)酵溫度相同的情況下，隨發(fā)酵進(jìn)行，搖瓶發(fā)酵的溫度更穩(wěn)定，兩者的菌濃度、殘?zhí)?、PH值變化規(guī)律高度一致，酸度變化規(guī)

2、律基本一致。另外實(shí)驗(yàn)還就溫度對(duì)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的影響作用進(jìn)行了探討，結(jié)果表明實(shí)罐發(fā)酵的最適溫度約為35，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液水分流失過(guò)多而使發(fā)酵失敗。 1. 課題背景 1.1檸檬酸簡(jiǎn)介 檸檬酸（citric acid）是生物體主要代謝產(chǎn)物之一，在自然界中分布很廣，主要存在于檸檬、柑橘、菠蘿、梅、李、梨、桃、無(wú)花果等果實(shí)中，尤以未成熟者含量居多。 檸檬酸又名枸櫞酸，學(xué)名2-羥基丙烷三羧酸、2-羥基丙烷-1,2,3-三羧酸.分子式：C6H8O7 （相對(duì)分子質(zhì)量：192.13） 物理性質(zhì)：無(wú)色透明或半透明晶體，或粒狀、微粒狀粉

3、末，雖有強(qiáng)烈酸味，但令人愉快，稍有澀味。極易溶于水，溶解度隨溫度的升高而增大。 化學(xué)性質(zhì)：從結(jié)構(gòu)上講檸檬酸是一種三羧酸類(lèi)化合物，并因此而與其他羧酸有相似的物理和化學(xué)性質(zhì)。加熱至175°C時(shí)它會(huì)分解產(chǎn)生二氧化碳和水，剩余一些白色晶體。檸檬酸是一種較強(qiáng)的有機(jī)酸，有3個(gè)H+可以電離； 加熱可以分解成多種產(chǎn)物，與酸、堿、甘油等發(fā)生反應(yīng)。1.2檸檬酸用途檸檬酸被稱(chēng)為第一食用酸味劑，極廣泛地用作酸味劑、增溶劑、緩沖劑、抗氧化劑等，用于飲料、糖果、釀造酒、冰淇淋、酸奶、罐頭食品、豆制品與調(diào)味品等的生產(chǎn)中。另外，在藥物、美容品、化妝品工業(yè)上也有著重要的應(yīng)用。它是香料和飲料的酸化劑

4、，在食品和醫(yī)學(xué)上用作多價(jià)螯合劑，同時(shí)是化學(xué)中間體，用于制造藥物，也可用于金屬清潔劑、媒染劑等。檸檬酸的鹽類(lèi)、酯類(lèi)和衍生物也各具特點(diǎn)，用途極為廣泛而有良好的發(fā)展前景。  1.3檸檬酸循環(huán) 又稱(chēng)三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle），克雷布斯循環(huán)(Krebs cycle)。體內(nèi)物質(zhì)糖、脂肪或氨基酸有氧氧化的主要過(guò)程。通過(guò)生成的乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合生成三羧酸（檸檬酸）開(kāi)始，再通過(guò)一系列氧化步驟產(chǎn)生CO2、NADH及FADH2，最后仍生成草酰乙酸，進(jìn)行再循環(huán)，從而為細(xì)胞提供了降解乙?；峁┊a(chǎn)生能量的基礎(chǔ)。由克雷布斯（Krebs）于2

5、0世紀(jì)30年代最先提出。1.4實(shí)驗(yàn)發(fā)酵機(jī)理 1）以薯干粉、玉米粉或淀粉等糖類(lèi)為原料經(jīng)黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌（我們采用黑曲霉M288）糖化后產(chǎn)生高濃度的葡萄糖。 2）、黑曲霉利用糖類(lèi)發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸：葡萄糖以EMP（糖酵解途徑或者）、HMP（磷酸戊糖循環(huán)）兩種途徑產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脫羧形成乙酰CoA，另一方面經(jīng)CO2固定化反應(yīng)后生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰CoA縮合產(chǎn)生檸檬酸。 3）生理調(diào)節(jié)：檸檬酸是黑曲霉的良好碳源，故檸檬酸的積累是菌體代謝失調(diào)的結(jié)果。1）Mn2+抑制蛋白質(zhì)合成造成NH4+的濃度增大，從而解除對(duì)PFK的抑制，使EMP通暢；2）檸檬酸脫氫酶在

6、檸檬酸濃度高的情況下活性降低，進(jìn)一步促進(jìn)檸檬酸的積累。 1.5發(fā)酵方法發(fā)酵有固態(tài)發(fā)酵、液態(tài)淺盤(pán)發(fā)酵和深層發(fā)酵 3種方法。固態(tài)發(fā)酵是以薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的農(nóng)副產(chǎn)品為原料，配好培養(yǎng)基后，在常壓下蒸煮，冷卻至接種溫度，接入種曲，裝入曲盤(pán)，在一定溫度和濕度條件下發(fā)酵。采用固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作容易。液態(tài)淺盤(pán)發(fā)酵多以糖蜜為原料，其生產(chǎn)方法是將滅菌的培養(yǎng)液通過(guò)管道轉(zhuǎn)入一個(gè)個(gè)發(fā)酵盤(pán)中，接入菌種，待菌體繁殖形成菌膜后添加糖液發(fā)酵。發(fā)酵時(shí)要求在發(fā)酵室內(nèi)通入無(wú)菌空氣。深層發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的主體設(shè)備是發(fā)酵罐。微生物在這個(gè)密閉容器內(nèi)繁殖與發(fā)酵?，F(xiàn)多采用通用發(fā)酵罐。它的主要部件包括罐

7、體、攪拌器、冷卻裝置、空氣分布裝置、消泡器，軸封及其他附屬裝置。發(fā)酵罐徑高比例一般是1:2.5，應(yīng)能承受一定的壓力,并有良好的密封性。除通用式發(fā)酵罐外，還可采用帶升式發(fā)酵罐、塔式發(fā)酵罐和噴射自吸式發(fā)酵罐等。 為了得到產(chǎn)檸檬酸的優(yōu)良菌種，通常是從不同地區(qū)采集的土壤或從腐爛的水果中分離篩選，然后通過(guò)物理和化學(xué)方法進(jìn)行菌種選育。例如薯干粉深層發(fā)酵檸檬酸的菌種就是通過(guò)檸檬酸不斷變異和選育得到的。菌種適合在高濃度下發(fā)酵，產(chǎn)酸水平較高。    1.6黑曲霉菌檸檬酸發(fā)酵的影響因素 檸檬酸的發(fā)酵因菌種、工藝、原料而異，但在發(fā)酵過(guò)程中還需要掌握一定的溫

8、度、通風(fēng)量及pH值等條件。一般認(rèn)為，黑曲霉適合在2830時(shí)產(chǎn)酸。溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致菌體大量繁殖，糖被大量消耗以致產(chǎn)酸降低，同時(shí)還生成較多的草酸和葡萄糖酸；溫度過(guò)低則發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)。微生物生成檸檬酸要求低pH，最適pH為24，這不僅有利于生成檸檬酸，減少草酸等雜酸的形成，同時(shí)可避免雜菌的污染。檸檬酸發(fā)酵要求較強(qiáng)的通風(fēng)條件，有利于在發(fā)酵液中維持一定的溶解氧量。通風(fēng)和攪拌是增加培養(yǎng)基內(nèi)溶解氧的主要方法。隨著菌體生成，發(fā)酵液中的溶解氧會(huì)逐漸降低，從而抑制了檸檬酸的合成。采用增加空氣流速及攪拌速度的方法，使培養(yǎng)液中溶解氧達(dá)到60飽和度對(duì)產(chǎn)酸有利。檸檬酸生成和菌體形態(tài)有密切關(guān)系，若發(fā)酵后期形成正常的菌球體，有利

9、于降低發(fā)酵液粘度而增加溶解氧，因而產(chǎn)酸就高；若出現(xiàn)異狀菌絲體，而且菌體大量繁殖，造成溶解氧降低，使產(chǎn)酸迅速下降。 盡管經(jīng)過(guò)幾十年的研究，關(guān)于檸檬酸發(fā)酵機(jī)制仍然有很多不夠了解的地方，檸檬酸的合成積累涉及到一系列的酶，它們是相互關(guān)聯(lián)的，影響制約檸檬酸發(fā)酵的因子也是多種多樣的，發(fā)酵液中金屬離子的含量對(duì)檸檬酸的合成有非常重要的作用，過(guò)量的金屬離子引起產(chǎn)酸率的降低，鐵離子能刺激烏頭酸水合酶的活性，從而影響檸檬酸的積累。檸檬酸發(fā)酵用的糖蜜原料，因含有大量金屬離子，必須應(yīng)用離子交換法或添加亞鐵氰化鉀脫鐵方能使用。然而微量的鋅、銅離子又可以促進(jìn)產(chǎn)酸。相對(duì)來(lái)說(shuō)，發(fā)酵培養(yǎng)基中的金屬離子以及小分子量的有機(jī)

10、物是比較容易控制的因子。但是每種因子的影響不是絕對(duì)的，如金屬離子Fe2+ 、Mn2+ 等，他們并不是可以無(wú)條件降低其濃度，同時(shí)它們也是微生物其它正常代謝途徑中必須因子，我們只能尋找一個(gè)最合適于檸檬酸發(fā)酵的濃度。 資料表明：高濃度Mn2+將刺激乙酰輔酶A，造成草酰乙酸濃度下降，不利于合成檸檬酸。銅離子能抑制檸檬酸裂解酶活力6，培養(yǎng)基中加Cu2+ ，有利于達(dá)到最高檸檬酸產(chǎn)量。檸檬酸在順烏頭酸酶的催化下轉(zhuǎn)化為順烏頭酸，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為異檸檬酸，F(xiàn)e2+是烏頭酸水合酶專(zhuān)一激活劑，但檸檬酸發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，需要少量鐵存在以促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和為檸檬酸合成作準(zhǔn)備，隨后要控制Fe2+&

11、#160;的存在才能開(kāi)始并大量積累檸檬酸。Johnson等在研究黑曲霉的CO2 固定作用時(shí)發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)CO2 固定系統(tǒng)，這兩個(gè)系統(tǒng)需要Mg2+、K + 。也有說(shuō)幾種常見(jiàn)的金屬離子對(duì)檸檬酸合成酶的抑制作用，且Ca2+> Mg2+ >Na+ >K+ ，當(dāng)然還與離子強(qiáng)度有關(guān)。 AMP、無(wú)機(jī)磷和NH4+對(duì)磷酸果糖激酶(PFK)有活化作用，NH4+還能有效的解除檸檬酸和ATP對(duì)其抑制，NH4+的濃度和檸檬酸生產(chǎn)速度有密切關(guān)系。發(fā)酵過(guò)程中加入甲醇能明顯提高檸檬酸產(chǎn)量。其可能的機(jī)理為：甲醇抑制a一酮戊二

12、酸脫氫酶活力，提高丙酮酸羧化酶的活力，增加檸檬酸穿過(guò)細(xì)胞膜能力，降低胞內(nèi)檸檬酸濃度，促進(jìn)檸檬酸的合成，甲醇還能抑制檸檬酸裂解酶的活力。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，甲醇對(duì)細(xì)胞有一定毒性影響。據(jù)報(bào)道，某些氨基酸，B族維生素和生物素也能提高檸檬酸產(chǎn)量，另有多種化合物，如NaF、乙二胺四乙酸鈉等，也能增加檸檬酸積累，還有植酸、植酸鈉、物理因素能提高檸檬酸產(chǎn)量。3. 工作內(nèi)容 3.1 實(shí)驗(yàn)菌株 黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌株M228。 3.2 主要儀器 電子天平、生化培養(yǎng)箱、10L機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐、配套設(shè)備（空壓機(jī)、過(guò)濾器、蒸汽發(fā)生器等）、立式滅菌鍋、恒溫水浴鍋

13、、血球計(jì)數(shù)板和顯微鏡、臺(tái)式高速離心機(jī)、堿式滴定裝置、離心機(jī)、電磁爐。 3.3 種子培養(yǎng) 茄形瓶斜面培養(yǎng)擴(kuò)大制備孢子。馬鈴薯培養(yǎng)基，35恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)34天。標(biāo)準(zhǔn)糖液中加入0.5%的硫酸銨，八層紗布封口，121滅菌20min，用無(wú)菌移液管吸取25mL無(wú)菌水至茄形瓶斜面內(nèi)，并用酒精燈燒過(guò)的接種環(huán)輕輕刮下孢子，搖勻后倒入已冷卻好的100mL的種子培養(yǎng)基內(nèi)，包扎好后搖床35、200r/min培養(yǎng)20h17。3.4 培養(yǎng)條件3.4.1糖化清液  細(xì)度為40目以上玉米粉15g與100mL去離子水混合調(diào)成漿乳，調(diào)節(jié)pH為5.5-6.0， 加熱并攪拌

14、升溫至（65±1），按20U/g原料加入-淀粉酶及1g/LCaCl2，攪拌均勻，恒溫保持60min，液化15min后用0.1%碘液檢測(cè)不顯藍(lán)色或極微淡藍(lán)色，即糖化完全。四層紗布過(guò)濾于250ml三角瓶即得糖化清液。 3.4.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)  標(biāo)準(zhǔn)糖液100ml，加入硫酸銨后于121滅菌20min，冷卻至室溫，接種。搖床35、200r/min培養(yǎng)。 3.4.3 實(shí)罐發(fā)酵培養(yǎng)  玉米粉900g,加入6L去離子水調(diào)成漿乳，調(diào)節(jié)pH為5.5-6.0，加入發(fā)酵罐，按20U/g原料加入-淀粉酶及1g/LCaCl2，攪拌均勻，恒溫保持30

15、-60min，液化20min后用0.1%碘液檢測(cè)不顯藍(lán)色或極微淡藍(lán)色為止。再加入0.5%的硫酸銨。蒸汽實(shí)罐滅菌后，火焰法接種，200r/min,35下通空氣發(fā)酵，罐壓控制在表壓0.1MPa。通風(fēng)量控制0-18h:200-400L/h，18h以后：600-800L/h。接種后半小時(shí)測(cè)總糖一次（取發(fā)酵液5mL），并記錄PH和通風(fēng)量。以后每4小時(shí)記錄PH和通風(fēng)量，每八小時(shí)測(cè)殘?zhí)呛退岫纫淮危ㄈ“l(fā)酵液10mL，離心取上清），最后一個(gè)班次每2小時(shí)測(cè)1次。3.5 分析方法 3.5.1 殘?zhí)菧y(cè)定  菲林熱滴定定糖法（空白滴定+樣品溶液預(yù)滴定+樣品溶液正式滴定）。

16、0;3.5.2總糖測(cè)定 取5ml發(fā)酵液，加50ml水和7.5ml濃硫酸，加熱至沸，保持5min，急速冷卻。冷后用40% NaOH溶液中和至PH7-8，定容至500ml，取樣后以殘?zhí)菧y(cè)定方法進(jìn)行測(cè)量。 3.5.3 酸度測(cè)定20  取5ml發(fā)酵液，離心取上清液，精確吸取4ml，加入100ml錐形瓶中，加入2-3滴0.1%酚酞指示劑，用0.1429 molL（5.75gNaOH溶于煮沸過(guò)的冷蒸餾水中，定容到1000ml，混勻后標(biāo)定）進(jìn)行滴定，滴定至微紅色，平行滴定3次，記錄平均消耗NaOH的體積。滴定1ml樣品液，每消耗1ml0.1429m

17、ol/LNaOH時(shí)的溶液為1%酸度，也即為發(fā)酵液產(chǎn)酸率（%）。 3.5.4 PH測(cè)定  精確PH試紙、PH計(jì)（臺(tái)式）、發(fā)酵罐PH電極。 3.5.5 菌種質(zhì)量檢查 (黑曲霉菌)在發(fā)酵液成球形體，散開(kāi)的菌絲較少，菌細(xì)胞短，一頭較粗如“鞋底狀”，而污染的菌多呈菌絲狀生長(zhǎng)，一般曲霉菌細(xì)胞較長(zhǎng)而平滑。取培養(yǎng)液稀釋在顯微鏡下觀察，合格的菌絲球應(yīng)是致密形的，菌球直徑不應(yīng)超過(guò)01ram，菌絲短且粗，分支少，瘤狀，部分膨脹28。 3.5.6菌濃度測(cè)定  采用B種血球計(jì)數(shù)板，計(jì)數(shù)室體積為0.1mm3.一個(gè)計(jì)數(shù)室為一個(gè)大方格，一個(gè)大方格

18、分成25個(gè)中格，每個(gè)中格又分為16個(gè)小格，即一個(gè)計(jì)數(shù)室由400個(gè)小方格組成。計(jì)數(shù)時(shí)，分別在左上、左下、右上、右下和正中五個(gè)中格進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后計(jì)算80個(gè)小格中平均每小格上菌細(xì)胞數(shù)，再計(jì)算400個(gè)小格即整個(gè)計(jì)數(shù)室中的菌體細(xì)胞數(shù)。位于中格線(xiàn)上的菌體只記此中格的上方及右方線(xiàn)上的細(xì)胞；凡菌體母細(xì)胞分裂的子細(xì)胞達(dá)母細(xì)胞大小的一半時(shí)，即可作為兩個(gè)細(xì)胞計(jì)。計(jì)算公式：每毫升發(fā)酵液中黑曲霉菌細(xì)胞數(shù)=（80小格內(nèi)細(xì)胞數(shù)/80）*400*104*稀釋倍數(shù)。將樣品稀釋50倍后，采用上述方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取平均值29。 3.5.7 氧濃度測(cè)定 通風(fēng)量的控制及發(fā)酵罐氧分壓電極

19、測(cè)定。 (以下的是在學(xué)校圖書(shū)館查閱的） 3.1 引言 選育出一株優(yōu)良的高產(chǎn)菌株只是發(fā)酵工作的開(kāi)始，并不意味著就能得到高產(chǎn)，發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵參數(shù)直接影響該菌株的潛力的發(fā)揮。發(fā)酵過(guò)程中會(huì)有較多因素影響檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)量，在發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分方面影響較大的有碳源、氮源、(NH4)2SO4 添加量、各種金屬離子含量等等。在發(fā)酵培養(yǎng)條件中影響較大的有：發(fā)酵溫度、發(fā)酵初始 pH 值、發(fā)酵接種量、發(fā)酵通風(fēng)量等等?？刂七m合菌株發(fā)酵的最佳營(yíng)養(yǎng)條件和最佳發(fā)酵條件，對(duì)提高檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)量有重大影響。在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中又以通氣、攪拌對(duì)發(fā)酵影響最為顯著。由于上述發(fā)酵影響因素對(duì)黑曲霉檸檬酸發(fā)酵的影響較為顯著，所以對(duì)這些因素進(jìn)行

20、具體詳細(xì)的研究是十分必要的。 為了給黑曲霉檸檬酸發(fā)酵創(chuàng)造好的條件，本實(shí)驗(yàn)研究了玉米粉凊液發(fā)酵的工藝條件。并為黑曲霉檸檬酸補(bǔ)料發(fā)酵打下了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)利用搖瓶發(fā)酵在實(shí)驗(yàn)室采用單因子實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)研究了黑曲霉 Wsy-03 的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成（包括碳源，氮源），并對(duì)影響黑曲霉檸檬酸發(fā)酵的發(fā)酵溫度、發(fā)酵初始 pH 及過(guò)程中 pH的控制、發(fā)酵接種量進(jìn)行了研究，利用小型自控發(fā)酵罐對(duì)發(fā)酵溶解氧對(duì)黑曲霉檸檬酸發(fā)酵的影響形成進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以尋求最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵控制條件，同時(shí)檸檬酸的補(bǔ)料發(fā)酵的研究提供可靠依據(jù)和堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。3.2 實(shí)驗(yàn)材料3.2.1 菌種 以檸檬酸主要生產(chǎn)菌株黑曲霉(Aspergillus

21、niger)作為實(shí)驗(yàn)菌株。3.2.2 培養(yǎng)基(1) 玉米粉種子培養(yǎng)基：自來(lái)水與玉米粉按質(zhì)量比 4：1 的比例混合，110保溫并不斷攪拌，并加入 -高溫淀粉酶，恒溫 20min-30min，用碘指示劑檢驗(yàn)不變藍(lán)，即糖化完全，冷卻，回復(fù)原來(lái)體積，得到 20玉米粉糖化液。將 20玉米粉糖化液經(jīng)兩層紗布過(guò)濾得糖化清液。用鹽酸調(diào)節(jié) pH 到 4.5，250mL 搖瓶加人 50mL的 20玉米粉糖化液，紗布封口，121滅菌 30min，得種子培養(yǎng)基。(2) 玉米粉發(fā)酵培養(yǎng)基：將20玉米粉糖化液與過(guò)濾后的玉米糖化清液按1：5 比例混合(V/V)。在 500mL 搖瓶中加入 50mL 混合后的培養(yǎng)基，添加 0

22、.3% (NH4)2SO4，調(diào) pH4.5，紗布封口。121滅菌 30min，得發(fā)酵培養(yǎng)基。3.2.3 試劑及材料 鄰苯二甲酸氫鉀 硫酸銅 分析純 天津化學(xué)試劑有限公司鹽酸 瓊脂 碘化鉀 氫氧化鈉 分析純 萊陽(yáng)化工有限公司次甲基藍(lán) 碘 酚酞 酒石酸鉀鈉 葡萄糖 耐高溫 -淀粉酶 2 萬(wàn)酶活/mL 糖化酶 2 萬(wàn)酶活/mL 玉米粉 土豆 3.2.4 儀器設(shè)備10L 全自動(dòng)發(fā)酵罐 瑞士Bioengineering AG 空壓機(jī) 龍海力霸通用機(jī)械有限公司PH 電極；pH2050e panel 瑞士 Bioengineering AG 氧電極；DO4050e panel 瑞士 Bioengineeri

23、ng AG 3.3 實(shí)驗(yàn)方法3.3.1 初糖含量對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響 (1) 初糖濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 在無(wú)菌狀態(tài)下，分別調(diào)整發(fā)酵液初始糖濃度為 10%、14%、18%、20%，24%，在玉米液化清液中添加 17%玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接種量接種發(fā)育成熟的種子液(250mL 裝液量 50mL)，35±1，300r/min 進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，發(fā)酵開(kāi)始后，每隔 6h 分別從各個(gè)不同初糖濃度的發(fā)酵液中吸取 1ml，進(jìn)行菌絲體凈重測(cè)量，記錄凈重變化。(2) 初糖濃度對(duì)檸檬酸產(chǎn)酸的影響 在無(wú)菌狀態(tài)下，分別調(diào)整發(fā)酵液初始糖濃度為 10%、14%、18%、2

24、0%，24%，在玉米液化清液中添加 17%玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接種量接種發(fā)育成熟的種子液(250mL 裝液量 50mL)，35±1，300r/min 進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，發(fā)酵 72h，每組試驗(yàn)做兩個(gè)平行試驗(yàn)，測(cè)定最后的產(chǎn)酸然后求其平均值，從而確定該因素對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響。3.3.2 氮源含量對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響 (1) 有機(jī)氮源的需求量 在無(wú)菌狀態(tài)下，調(diào)整發(fā)酵液初始糖濃度18%，在玉米液化清液中分別添加12%，17%，23%的玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接種量接種發(fā)育成熟的種子液(250mL 裝液量 50m

25、L)，35±1，300r/min 進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，發(fā)酵 72h，每組試驗(yàn)做兩個(gè)平行試驗(yàn)，測(cè)定最后的產(chǎn)酸然后求其平均值，從而確定該因素對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響。(2) (NH4)2SO4 添加量對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響 在無(wú)菌狀態(tài)下，調(diào)整發(fā)酵液初始糖濃度 18%，在玉米液化清液中添加 17%的玉米液化全液，再分別添加 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接種量接種發(fā)育成熟的種子液(250mL 裝液量 50mL)，35±1，300r/min 進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，發(fā)酵 72h，每組試驗(yàn)做兩個(gè)平行試驗(yàn)，測(cè)定最后的產(chǎn)酸然后求其平均值，從而確定該因素對(duì)檸檬

26、酸發(fā)酵的影響。3.3.2 氮源含量對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響 (1) 有機(jī)氮源的需求量 在無(wú)菌狀態(tài)下，調(diào)整發(fā)酵液初始糖濃度18%，在玉米液化清液中分別添加12%，17%，23%的玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接種量接種發(fā)育成熟的種子液(250mL 裝液量 50mL)，35±1，300r/min 進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，發(fā)酵 72h，每組試驗(yàn)做兩個(gè)平行試驗(yàn)，測(cè)定最后的產(chǎn)酸然后求其平均值，從而確定該因素對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響。(2) (NH4)2SO4 添加量對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響 在無(wú)菌狀態(tài)下，調(diào)整發(fā)酵液初始糖濃度 18%，在玉米液化清液中添加 17%的玉米液化全液，再分別

27、添加 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接種量接種發(fā)育成熟的種子液(250mL 裝液量 50mL)，35±1，300r/min 進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，發(fā)酵 72h，每組試驗(yàn)做兩個(gè)平行試驗(yàn)，測(cè)定最后的產(chǎn)酸然后求其平均值，從而確定該因素對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響。3.3.3 溫度對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響 在無(wú)菌狀態(tài)下，調(diào)整發(fā)酵液初始糖濃度 18%，在玉米液化清液中添加 17%的玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接種量接種發(fā)育成熟的種子液(250mL 裝液量 50mL)，分別在 30，33，36，39，42溫度下，300r/min

28、進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，發(fā)酵 72h，每組試驗(yàn)做兩個(gè)平行試驗(yàn)，測(cè)定最后的產(chǎn)酸然后求其平均值，從而確定該因素對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響。3.3.4 接種量對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響 在無(wú)菌狀態(tài)下，調(diào)整發(fā)酵液初始糖濃度 18%，在玉米液化清液中添加 17%的玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，分別按 6%，8%，10%，12%，14%的接種量接種發(fā)育成熟的種子液(250mL 裝液量 50mL)，35±1，300r/min 進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，發(fā)酵 72h，每組試驗(yàn)做兩個(gè)平行試驗(yàn)，測(cè)定最后的產(chǎn)酸然后求其平均值，從而確定該因素對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響。3.3.5 通風(fēng)量對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響 采用 10L 全自

29、動(dòng)通風(fēng)機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，玉米粉液化清液添加 17%玉米粉液化全液，定容到8L ，添加0.3%的(NH4)2SO4，調(diào)節(jié)初始pH4.5，轉(zhuǎn)速250300r/min，。通風(fēng)量 12h 前：0.12VVM；12h-72h：0.15VVM，35±1，培養(yǎng) 72h。從發(fā)酵 16h開(kāi)始每隔 6h 取樣，測(cè)定發(fā)酵液中檸檬酸積累量、還原糖消耗量和 pH 值的變化情況。3.4 測(cè)定方法1.檸檬酸測(cè)定方法：（粗測(cè)法）采用 0.1429mol/L 氫氧化鈉溶液滴定。2. 還原糖測(cè)定：發(fā)酵液稀釋后，由斐林試劑直接測(cè)定。3. 總糖測(cè)定：發(fā)酵液經(jīng)酸水解后，由斐林試劑測(cè)糖法測(cè)定。4. 氮含量測(cè)定：凱氏定氮法。5.

30、pH 值測(cè)定：酸度計(jì)測(cè)定或者是精密 pH 試紙測(cè)定。6. 菌絲球大小測(cè)定：測(cè)微計(jì)測(cè)定。7. 孢子計(jì)數(shù)：血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法測(cè)定8. 菌絲球干重的測(cè)定：取出一定量的發(fā)酵液，離心機(jī)中 3000r/min，離心 30min，用蒸餾水洗兩遍后，倒掉清液，在烘箱中烘干后稱(chēng)重，記為菌絲凈重。9. pH 值測(cè)定：酸度計(jì)測(cè)定或者是精密 pH 試紙測(cè)定。10. 菌絲球大小測(cè)定：測(cè)微計(jì)測(cè)定。11. 孢子計(jì)數(shù)：血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法測(cè)定12. 菌絲球數(shù)量測(cè)定：吸取 1mL 生長(zhǎng)成熟的種子培養(yǎng)基，進(jìn)行一定倍數(shù)的稀釋?zhuān)陲@微鏡下進(jìn)行直接計(jì)數(shù)13. 糖酸轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式如下: 糖酸轉(zhuǎn)化率 （% ）= 式中 C最終檸檬酸酸度(g/10

31、0mL)； A發(fā)酵液起糖濃度(g/100mL)； B發(fā)酵結(jié)束糖濃度(g/100mL)；14. 產(chǎn)酸速率計(jì)算公式如下：產(chǎn)酸速率（ g/100mlh）= 式中 發(fā)酵最高酸度(g/100mL)； 發(fā)酵起始酸度(g/100mL)； T總發(fā)酵時(shí)間(h)。3.5 結(jié)果與討論3.5.1 培養(yǎng)基成分對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響 在檸檬酸發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵初期黑曲霉會(huì)利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分，利用碳源提供能量，利用氮源提供自身生長(zhǎng)發(fā)育所需要的蛋白質(zhì)和核酸等等。如果提供的營(yíng)養(yǎng)成分不夠就會(huì)影響黑曲霉的菌體生長(zhǎng)和發(fā)育。在發(fā)酵后期，為了使黑曲霉能有效的積累檸檬酸，必須為菌體提供限量的營(yíng)養(yǎng)因子。同時(shí)發(fā)酵液中的金屬離子和各種產(chǎn)酸刺激物和

32、抑制物都會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)和代謝檸檬酸有較大的影響。3.5.1.1 初糖含量對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響(1) 初糖含量對(duì)菌體濃度的影響 不同初糖濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)黑曲霉菌絲球的生長(zhǎng)發(fā)育有不同的影響。黑曲霉菌絲球接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后還要繼續(xù)生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的生長(zhǎng)發(fā)育，菌絲球的凈重會(huì)達(dá)到一個(gè)飽和值，然后才開(kāi)始發(fā)酵產(chǎn)酸。將黑曲霉菌絲球接種到不同糖濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中，跟蹤菌體凈重變化，了解不同初糖濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)菌絲球生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖 3.1。 從圖 3.1 可以看出，黑曲霉 Wsy-03 菌絲球在接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中以后，菌絲球還會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間會(huì)達(dá)到一個(gè)菌絲球濃度飽和值，這個(gè)飽和值在初糖濃度 18%

33、以下的發(fā)酵培養(yǎng)基中都相同，不同在于達(dá)到這個(gè)飽和值所要用的時(shí)間。從圖 3.1 中可以看出，隨著發(fā)酵液初糖濃度的提高，黑曲霉 Wsy-03 菌絲球凈重達(dá)到這個(gè)最大值所用的時(shí)間會(huì)越來(lái)越長(zhǎng)，即較高的初糖濃度會(huì)對(duì)菌絲球生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。同時(shí)也證明，從菌絲球生長(zhǎng)方面看來(lái)，控制 12%的發(fā)酵初糖，有利于補(bǔ)料發(fā)酵。(2) 初糖對(duì)產(chǎn)酸的影響 發(fā)酵液初糖濃度的高低將直接影響黒曲霉菌體的生長(zhǎng)與發(fā)育，影響檸檬酸產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率。從黑曲霉發(fā)酵檸檬酸過(guò)程分析，如果發(fā)酵液初始糖濃度過(guò)高，會(huì)對(duì)孢子的生長(zhǎng)發(fā)育有抑制作用，同時(shí)由于發(fā)酵原料是玉米液化液，所以過(guò)高的糖濃度還會(huì)使發(fā)酵培養(yǎng)基濃度過(guò)高，嚴(yán)重影響發(fā)酵液溶氧，由于在種子生長(zhǎng)初

34、期，孢子發(fā)育耗氧量非常大，所以發(fā)酵液初始糖濃度過(guò)高會(huì)嚴(yán)重影響菌絲球成型。但是，如果發(fā)酵液初始糖濃度太低，則菌絲球會(huì)長(zhǎng)的很大，且形狀不規(guī)則，生長(zhǎng)不正常。不同發(fā)酵初糖濃度對(duì)黑曲霉 Wsy-03 檸檬酸發(fā)酵的影響見(jiàn)表 3.1。 從表 3.1 可以看出，黑曲霉 Wsy-03 在發(fā)酵液初糖濃度低于 18%時(shí)，糖酸轉(zhuǎn)化率一直保持在 90%以上，且檸檬酸產(chǎn)量隨發(fā)酵液糖濃度的增加而增加。但是在初糖濃度高于 18%時(shí)，如果繼續(xù)提高發(fā)酵液初糖含量，明顯可以看出檸檬酸產(chǎn)量開(kāi)始降低，同時(shí)糖酸轉(zhuǎn)化率也開(kāi)始降低。初糖濃度為 18%時(shí)產(chǎn)酸率最高，而且糖酸轉(zhuǎn)化率能達(dá)到 90.12%，殘?zhí)呛績(jī)H為 2.92g/100mL。如果

35、從降低糧耗的角度考慮，批料發(fā)酵時(shí)選擇初糖含量在 18%最為合適，產(chǎn)酸率，糖酸轉(zhuǎn)化率都很高。同時(shí)從上表中可以看出黑曲霉 Wsy-03 菌株在初糖濃度為 14%的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵速度快，殘?zhí)菨舛鹊椭挥?0.13g/100mL，碳酸轉(zhuǎn)化率高達(dá) 91.29%，有利于流加發(fā)酵，縮短發(fā)酵時(shí)間。所以，本實(shí)驗(yàn)采用發(fā)酵液初糖濃度 18%研究批量發(fā)酵的最優(yōu)條件，采用初糖濃度 14%發(fā)酵培養(yǎng)基研究補(bǔ)料發(fā)酵的最優(yōu)條件。3.5.1.2 氮源對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響 菌體利用發(fā)酵液中的氮源是為了合成自身生長(zhǎng)發(fā)育所需要的各種蛋白質(zhì)、核酸和各種氨基酸.利用部分無(wú)機(jī)氮源作為菌體自身生長(zhǎng)代謝的調(diào)節(jié)劑。在菌體的生長(zhǎng)過(guò)程中，不同菌體利用

36、各種有機(jī)氮或無(wú)機(jī)氮的種類(lèi)是不同的。但是黑曲霉的生長(zhǎng)過(guò)程比較粗放，可以利用各種有機(jī)氮或無(wú)機(jī)氮作為其自身氮源。但是氮源的含量對(duì)黑曲霉檸檬酸的發(fā)酵卻有十分重大的影響，如果氮源含量過(guò)低，會(huì)使發(fā)酵液處于營(yíng)養(yǎng)貧瘠狀態(tài)，使得菌體不能正常的發(fā)育生長(zhǎng)，具體表現(xiàn)為菌體不能發(fā)育成為較完整的菌絲球，使得發(fā)酵產(chǎn)酸很低。但是如果發(fā)酵液中氮源含量過(guò)高，即發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)過(guò)于充足，會(huì)使得菌絲球瘋長(zhǎng)，長(zhǎng)的過(guò)大，且菌絲體過(guò)多，大大增加發(fā)酵液的粘稠度，影響發(fā)酵液溶氧，從而影響產(chǎn)酸。所以研究發(fā)酵液氮源含量對(duì)提高檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)量有重要的意義。(1) 氮源的需求量分別測(cè)定總糖含量為 18%的玉米液化清液和玉米液化全液的氮含量，具體結(jié)果見(jiàn)表 3.

37、2： 以玉米粉液化濾液為基料進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵時(shí)，需要補(bǔ)充一定量的氮源，通常調(diào)整氮源玉米粉液化全液，有時(shí)也用薯干粉或豆餅粉。在生產(chǎn)中調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基中不同的氮源含量，發(fā)現(xiàn)明顯影響發(fā)酵產(chǎn)酸量。為此，下面對(duì)以玉米粉液化濾液為基料，分別添加不同比例的玉米液化全液，調(diào)節(jié)不同的氮源含量。不同的氮源量對(duì)檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響見(jiàn)表 3.3。 從表 3.3 可以看出，黑曲霉 Wsy-03 以玉米粉為原料發(fā)酵檸檬酸時(shí)，蛋白質(zhì)含量在 0.32%時(shí)，即往玉米液化清液中添加 17%的玉米液化全液，檸檬酸產(chǎn)量最高達(dá)13.23g/100mL，同時(shí)糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá) 90.87%。發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量在 0.26%時(shí)，雖然糖酸轉(zhuǎn)化較高，

38、但是產(chǎn)酸量相對(duì)較低，只有 90.65%，同時(shí)過(guò)高的氮源嚴(yán)重影響了菌絲球的形成。所以本實(shí)驗(yàn)采用氮源含量在 0.32%，即添加 17%的玉米液化全液，檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)量最好。 從圖 3.2，3.3，3.4（此二圖放大倍數(shù)為 250 倍）可以看出，不同的蛋白質(zhì)含量對(duì)黑曲霉 Wys-03 菌絲球生長(zhǎng)形態(tài)有較大的影響。蛋白質(zhì)含量較少時(shí)，由于菌絲球不能得到充足的養(yǎng)分，使得菌絲球發(fā)育不好，菌球過(guò)小，且菌絲細(xì)長(zhǎng)，有的發(fā)育過(guò)短的菌絲不能纏繞成完整的菌絲球。但是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量較高時(shí)，菌絲生長(zhǎng)又會(huì)過(guò)于旺盛，大量的分散菌絲不能形成完整的菌絲球，大大的增加了發(fā)酵液的粘稠度。增加發(fā)酵液溶氧的困難。再次證明發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量在 0

39、.32%時(shí)，菌絲球纏繞較為緊密，且形成了外圍舒展的菌絲，無(wú)大量散落菌絲體分散在發(fā)酵液中，較有利于檸檬酸發(fā)酵。 (2) (NH4)2SO4 添加量對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響有實(shí)驗(yàn)證明在檸檬酸發(fā)酵的過(guò)程中，發(fā)酵培養(yǎng)基中除了添加有機(jī)氮源外，同時(shí)添加一定量的(NH4)2SO4 對(duì)檸檬酸產(chǎn)量有較明顯的提高。這是因?yàn)樵跈幟仕岚l(fā)酵的過(guò)程中，特別是在檸檬酸發(fā)酵過(guò)程的后期，開(kāi)始添加(NH4)2SO4，銨離子對(duì)菌體生長(zhǎng)無(wú)影響，同時(shí)銨離子對(duì)檸檬酸積累有調(diào)節(jié)作用，從 NH4+的代謝調(diào)節(jié)作用考慮，檸檬酸生產(chǎn)菌黑曲霉的 PFK 酶是糖酵解途徑中第一個(gè)調(diào)節(jié)酶，也是決定 EMP途徑代謝流量的最重要的關(guān)鍵酶。此酶受檸檬酸和 ATP 的

40、抑制，受 AMP、Pi、NH4+所激活，NH4+不僅能激活 PFK 酶，還能解除檸檬酸、ATP 對(duì)它的抑制作用。研究黑曲霉檸檬酸發(fā)酵過(guò)程發(fā)現(xiàn)， NH4+在細(xì)胞內(nèi)勝利濃度范圍中濃度的高低與檸檬酸生產(chǎn)率有密切的關(guān)系。所以 NH4+在發(fā)酵過(guò)程中，尤其在產(chǎn)酸階段不應(yīng)受限。也有文獻(xiàn)報(bào)道，在我國(guó)過(guò)去用樹(shù)干粉為原料發(fā)酵檸檬酸時(shí)，添加 0.01%-0.05% (NH4)2SO4，不但可以提高產(chǎn)酸，而且能夠縮短檸檬酸的發(fā)酵周期。不同 (NH4)2SO4 添加量對(duì)以玉米粉為原料檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響見(jiàn)圖 3.5： 從圖 3.5 可知，黑曲霉 Wys-03 以玉米粉為原料發(fā)酵檸檬酸時(shí)，發(fā)酵液中(NH)4SO2 的添

41、加量在 0.3%時(shí)，產(chǎn)酸量較高，同時(shí)發(fā)酵殘?zhí)呛枯^低。發(fā)酵液中(NH)4SO2 添加量高于或者是低于 0.3%，都會(huì)是產(chǎn)酸量有所下降，同時(shí)殘?zhí)呛坑兴岣?，使得糖酸轉(zhuǎn)化率下降。所以，本實(shí)驗(yàn)采用發(fā)酵液中添加 0.3%的(NH4)2SO4，以提高產(chǎn)酸3.5.1.3 培養(yǎng)基組份優(yōu)化 為了確定檸檬酸發(fā)酵中各培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)組份的最佳條件，以影響檸檬酸發(fā)酵過(guò)程中的重要因素初始總糖濃度(g/v%)、玉米液化全液添加量(v/v%)和硫酸銨含量(g/100ml)進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，最終以發(fā)酵液中檸檬酸含量(g/100mL)為指標(biāo)，確定出最佳實(shí)驗(yàn)方案。各因素水平安排見(jiàn)表 3.4。 在無(wú)菌條件下，將斜面試管培養(yǎng)

42、成熟的黑曲霉 Wys-03 孢子接入到二級(jí)種子培養(yǎng)基中(10%初糖，pH4.5)中，35±1，150r/min 恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng) 24h，鏡檢菌絲球發(fā)育狀況，將二級(jí)種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵液中進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)。以影響檸檬酸發(fā)酵過(guò)程中的重要因素：初始總糖濃度(v/v%)、接種量(%)和(NH4)2SO4 含量(g/100ml)進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，最終以發(fā)酵液中檸檬酸含量(%)和殘?zhí)牵ㄒ赃€原糖計(jì)）含量（%）為指標(biāo)。結(jié)果如表 3.5。 通過(guò)表 3.5 的正交實(shí)驗(yàn)可以看出，在黑曲霉 Wys-03 檸檬酸發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)基的三個(gè)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響大小順序是：初始總糖濃度(g/v%)

43、(NH4)2SO4 添加量(g/100ml)玉米液化全液添加量(v/v%)。從正交實(shí)驗(yàn)表中可以看出，最優(yōu)培養(yǎng)基成分是：18%的初糖含量，17%的玉米液化全液添加量，0.3%的(NH4)2SO4 添加量效果最好。但是正交實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有做這個(gè)實(shí)驗(yàn)，而實(shí)驗(yàn) 4 與本最佳實(shí)驗(yàn)最為相似。為了確定最優(yōu)發(fā)酵條件，根據(jù)上述最優(yōu)方案進(jìn)行了一次檸檬酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵最終檸檬酸含量為 13.64g/100mL，高于正交試驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn) 4，所以選擇最優(yōu)方案為以后的發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)條件。3.5.2 非營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響控制發(fā)酵培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)因子可以有效的提高檸檬酸的發(fā)酵產(chǎn)量，但是影響檸檬酸發(fā)酵的不止有發(fā)酵培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)因子同

44、時(shí)還有發(fā)酵工藝參數(shù)。3.5.2.1pH 值對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響由于酶活受 pH 值的影響十分明顯，所以發(fā)酵培養(yǎng)基中不同 pH 直接影響發(fā)酵微生物的代謝過(guò)程，同時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH 還對(duì)微生物的生長(zhǎng)影響較大。由于發(fā)酵過(guò)程中的 pH 不合適，可能影響菌體的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)而影響菌種產(chǎn)物的合成的速率和能力，因此了解不同發(fā)酵微生物的最適發(fā)酵 pH 對(duì)于提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量有重要的意義（1）發(fā)酵液初始 pH 對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響：相對(duì)于大工業(yè)發(fā)酵罐發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的搖床三角瓶發(fā)酵，調(diào)節(jié)合適的發(fā)酵初始 pH 值十分重要。特別是像檸檬酸發(fā)酵這種以淀粉作為發(fā)酵原料的發(fā)酵，發(fā)酵液初始 pH 的高低會(huì)直接影響到菌體糖化酶的活力

45、，由于檸檬酸發(fā)酵是以玉米粉為原料的發(fā)酵過(guò)程，屬于邊糖化邊生長(zhǎng)邊產(chǎn)酸的過(guò)程。初始 pH 值過(guò)低，會(huì)直接導(dǎo)致糖化酶活性低，淀粉不能完全水解，同時(shí)較低發(fā)酵 pH 值，會(huì)生成亞鐵氰化物，該化合物對(duì)黑曲霉菌體的生長(zhǎng)有毒害作用。反之如果發(fā)酵液初始 pH 值較高，會(huì)使發(fā)酵過(guò)程中草酸和葡萄糖酸大量積累，使發(fā)酵液中雜酸含量過(guò)高。不同發(fā)酵液初始 pH 值對(duì)檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響，見(jiàn)圖 3.6。 由圖 3.6 可可以看出，黑曲霉 Wys-03 在進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵時(shí)，只有發(fā)酵液初始pH 為 4.5 時(shí)，產(chǎn)酸率最高。如果發(fā)酵液初始 pH 調(diào)節(jié)過(guò)高或者過(guò)低時(shí)，都會(huì)對(duì)最后的產(chǎn)酸率有影響。究其原因主要是，pH4.5 與糖化酶的活

46、性最高 pH 值基本一致，如果起始 pH 低于 4，則低于糖化酶的作用最適范圍，會(huì)使得發(fā)酵原料得不到充分利用，進(jìn)而影響最終產(chǎn)酸率。反之如果發(fā)酵液初始 pH 過(guò)高，pH 值大于或者等于6，則黑曲霉菌絲球會(huì)出現(xiàn)老化現(xiàn)象，提前進(jìn)入衰老期，如果初始發(fā)酵 pH 值更高還會(huì)引起菌體自溶。所以，發(fā)酵液初始最適 pH 值為 4.5。（2）檸檬酸發(fā)酵過(guò)程中 pH 值的變化 黑曲霉接種到發(fā)酵培養(yǎng)基以后，首先會(huì)分泌并利用自身的糖化酶系，將發(fā)酵液中未液化完全的大分子多糖水解為單分子葡萄糖，供給黑曲霉自身生長(zhǎng)發(fā)育以及合成檸檬酸，如果發(fā)酵前期由于各種原因使得黑曲霉過(guò)早進(jìn)入到發(fā)酵產(chǎn)酸期，由于檸檬酸的積累從而引起發(fā)酵液的 pH 值下降，過(guò)低的 pH 值就會(huì)抑制黑曲霉糖化酶的活力，進(jìn)而影響原料的糖化，不僅影響黑曲霉菌絲球的生長(zhǎng)發(fā)育，而且還影響最終產(chǎn)酸率和轉(zhuǎn)化率。因此，在發(fā)酵前期保持培養(yǎng)基的 pH 值穩(wěn)定，使 pH 值保持在 45 之間，當(dāng)菌絲球開(kāi)始進(jìn)入到檸檬酸大量累積