微生物檢測(cè)--化妝品衛(wèi)生規(guī)范2007版

1、第四部分微生物檢驗(yàn)方法Methods of Microbiological Test一、總則General Principles1 范圍 本規(guī)范規(guī)定了化妝品微生物學(xué)檢驗(yàn)的基求。本規(guī)范適用于化妝品樣品的采集、保存及供檢樣品制備。2儀器和設(shè)備2.1天平。2.2高壓滅菌器。2.3振蕩器。2.4三角瓶，250mL。2.5玻璃珠。2.6玻璃棒。2.7刻度吸管，1mL、10mL。2.8研缽或均質(zhì)器。2.9恒溫水浴箱。3培養(yǎng)基和試劑3.1生理鹽水成分：氯化鈉8.5g蒸餾水加至1000mL溶解后，分裝到加玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)，每瓶 90mL，103.43kPa（121 15 lb）20min高壓滅菌。3.2 SC

2、DLP 液體培養(yǎng)基成分：酪蛋白胨17g大豆蛋白胨3g氯化鈉5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g卵磷脂1g吐溫 807g蒸餾水1000mL制法：先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其它成分混合，加熱溶解，調(diào) pH 為 7.27.3 分裝，103.43kPa（121 15 lb）20min 高壓滅菌。注意振蕩，使沉淀于底層的 吐溫 80 充分混合，冷卻至 25左右使用。注：如無酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。3.3滅菌液體石蠟。3.4滅菌吐溫 80。4樣品的采集及注意事項(xiàng)4.1所采集的樣品，應(yīng)具有代表性，一般視每批化妝品數(shù)量大小，隨機(jī)抽取相應(yīng)數(shù)量的包275裝單位。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別從兩個(gè)包裝

3、單位以上的樣品中共取 10g 或 10mL。包裝量小于 20g的樣品，采樣量可適當(dāng)增加樣品包裝數(shù)量。4.2供檢驗(yàn)樣品，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)。容器不應(yīng)有破裂，在檢驗(yàn)前不得打開，防 止樣品被污染。4.3接到樣品后，應(yīng)立即登記，編寫檢驗(yàn)序號(hào)，并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)。如不能及時(shí)檢驗(yàn)， 樣品應(yīng)放在室溫陰涼干燥處，不要冷藏或冷凍。4.4若只有一個(gè)樣品而同時(shí)需做多種分析，如細(xì)菌、毒理、化學(xué)等，則宜先取出部分樣品 做細(xì)菌檢驗(yàn)，再將剩余樣品做其它分析。4.5 在檢驗(yàn)過程中，從打開包裝到全部檢驗(yàn)操作結(jié)束，均須防止微生物的再污染和擴(kuò)散， 所用器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在無菌室內(nèi)進(jìn)行，或在相應(yīng)條件下，按無菌

4、操作 規(guī)定進(jìn)行。4.6 如檢出糞大腸菌群或其它致病菌，自報(bào)告發(fā)出之日起該菌種及被檢樣品應(yīng)保存一個(gè)月。5 供檢樣品的制備5.1 液體樣品5.1.1 水溶性的液體樣品，可量取 10mL 加到 90mL 滅菌生理鹽水中，如樣品少于 10mL， 仍按 10 倍稀釋法進(jìn)行。如為 5mL 則加到 45mL 滅菌生理鹽水，混勻后，制成 1：10 檢液。 5.1.2 油性液體樣品，取樣品 10mL，先加 5mL 滅菌液體石蠟混勻，再加 10mL 滅菌的吐溫 80，在 4044水浴中振蕩混合 10min，加入滅菌的生理鹽水 75mL（在 4044水浴中預(yù)溫），在 4044水浴中乳化，制成 1：10 的懸液。5.

5、2 膏、霜、乳劑半固體狀樣品5.2.1親水性的樣品：稱取 10g，加到裝有玻璃珠及 90mL 滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分 振蕩混勻，靜置 15min。用其上清液作為 1:10 的檢液。5.2.2疏水性樣品：稱取 10g，放到滅菌的研缽中，加 10mL 滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀， 再加入 10mL 滅菌吐溫 80，研磨待溶解后，加 70mL 滅菌生理鹽水，在 4044水浴中 充分混合，制成 1：10 檢液。5.3 固體樣品稱取 10g，加到 90mL 滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上 清液作為 1：10 的檢液。如有均質(zhì)器，上述水溶性膏、霜、粉劑等，可稱 10g 樣品

6、加入 90mL 滅菌生理鹽水， 均質(zhì) 1min2min；疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱 10g 樣品，加 10mL 滅菌液體石蠟，10mL 吐溫 80，70mL 滅菌生理鹽水，均質(zhì) 3min5min。二、菌落總數(shù)Aerobic Bacterial Count1 范圍 本規(guī)范規(guī)定了化妝品中菌落總數(shù)的檢驗(yàn)方法。 本規(guī)范適用于化妝品菌落總數(shù)的測(cè)定。2 定義 本規(guī)范采用下列定義菌落總數(shù)（Aerobic bacterial count）是指化妝品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如 培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH 值、需氧性質(zhì)等），1g（1mL）檢樣中所含菌落的總 數(shù)。所得結(jié)果只包括一群本方法規(guī)定

7、的條件下生長(zhǎng)的嗜中溫的需氧性菌落總數(shù)。測(cè)定菌落總數(shù)便于判明樣品被細(xì)菌污染的程度，是對(duì)樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)總評(píng)價(jià)的綜合依據(jù)。3儀器和設(shè)備3.1三角瓶，250mL。3.2量筒，200mL。3.3 pH 計(jì)或精密 pH 試紙。3.4高壓滅菌器。3.5試管：15×150mm。3.6滅菌平皿：直徑 9cm。3.7滅菌刻度吸管，10mL、1mL。3.8酒精燈。3.9恒溫培養(yǎng)箱：36±1。3.10放大鏡。4培養(yǎng)基和試劑4.1生理鹽水：見總則中 3.1。4.2卵磷脂、吐溫 80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4.2.1成分：蛋白胨20g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g卵磷脂1g吐溫 807g蒸餾水1000mL4.2

8、.2制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫 80，將其他成分（除瓊 脂外）加到其余的蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、 吐溫 80，混勻，調(diào) pH 值為 7.17.4，加入瓊脂，103.43kPa（121 15 lb）20min 高壓滅菌，儲(chǔ)存于冷暗處備用。4.30.5氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride，TTC） 成分：TTC0.5g蒸餾水100mL溶解后過濾，103.43kPa（121 15 lb）20min 高壓滅菌，裝于棕色試劑瓶，置 4冰箱 備用。5操作步驟5.1 用滅菌吸管吸取 1：10 稀釋的檢液 2mL，分別注入

9、到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿 1mL。另 取 1mL 注入到 9mL 滅菌生理鹽水試管中（注意勿使吸管接觸液面），更換一支吸管，并充 分混勻，制成 1：100 檢液。吸取 2mL，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿 1mL。如樣品含 菌量高，還可再稀釋成 1：1000，1：10000，等，每種稀釋度應(yīng)換 1 支吸管。5.2將融化并冷至 4550的卵磷脂吐溫 80 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi)，每皿約15mL，隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置 36±1培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48h±2h。另取一個(gè)不加樣品的滅菌空平皿，加入約 15mL 卵磷脂吐溫 80 營養(yǎng)瓊脂

10、培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置 36±1培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48h±2h，為空 白對(duì)照。5.3為便于區(qū)別化妝品中的顆粒與菌落，可在每 100mL 卵磷脂吐溫 80 營養(yǎng)瓊脂中加入 1mL0.5的 TTC 溶液，如有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色，而化妝品的顆粒顏色無變化。6菌落計(jì)數(shù)方法先用肉眼觀察，點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)，然后再用放大 5 倍10 倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記 下各平皿的菌落數(shù)后，求出同一稀釋度各平皿生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌 落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，該平皿不宜計(jì)數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半 中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘以

11、2，以代表全皿菌落數(shù)。7菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告方法7.1首先選取平均菌落數(shù)在 30 個(gè)300 個(gè)之間的平皿，作為菌落總數(shù)測(cè)定的范圍。當(dāng)只有 一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)（見表 1 中例 1）。 7.2若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在 30 個(gè)300 個(gè)之間， 則應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值來決定，若其比值小于或等于 2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)，若大于 2 則報(bào)告其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)（見表 1 中例 2 及例 3）。7.3若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于 300 個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋 倍數(shù)報(bào)告之（見表 1 中例 4）。7.4若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于

12、30 個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍 數(shù)報(bào)告之（見表 1 例 5）。7.5若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在 30 個(gè)300 個(gè)之間，其中一個(gè)稀釋度大于 300 個(gè)，而相鄰的另一稀釋度小于 30 個(gè)時(shí)，則以接近 30 或 300 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見 表 1 中例 6）。7.6若所有的稀釋度均無菌生長(zhǎng)，報(bào)告數(shù)為每 g 或每 mL 小于 10CFU。7.7菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告，菌落數(shù)在 10 以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)值報(bào)告之，大于 100 時(shí)，采用二位有 效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五入法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面零的個(gè)數(shù)， 可用 10 的指數(shù)來表示（見表 1 報(bào)告方式欄）。在

13、報(bào)告菌落數(shù)為“不可計(jì)”時(shí)，應(yīng)注明樣品的 稀釋度。表 1細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果及報(bào)告方式例不同稀釋度平均菌落數(shù)兩稀釋度菌落總數(shù)報(bào)告方式次10-110-210-3菌數(shù)之比（CFU/mL 或 CFU/g） （CFU/mL 或 CFU/g）11365164201640016000 或 1.6×10422760295461.63800038000 或 3.8×10432890271602.22710027000 或 2.7×1044不可計(jì)4650513513000510000 或 5.1×105527115270270 或 2.7×1026不可計(jì)305123050

14、031000 或 3.1×1047000×10*CFU：菌落形成單位。三、糞大腸菌群Fecal Coliforms1范圍 本規(guī)范規(guī)定了化妝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn)方法。 本規(guī)范適用于化妝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn)。2定義 本規(guī)范采用下列定義糞大腸菌群（Fecal coliforms） 系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌，在 44.5±0.5培養(yǎng) 24h48h 能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。 該菌直接來自糞便，是重要的衛(wèi)生指示菌。3儀器3.1恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱：44±0.5。3.2溫度計(jì)。3.3顯微鏡。3.4載玻片。3.5接種環(huán)。3.6電磁爐。3.7三角瓶，25

15、0mL。3.8試管：15×150mm。3.9小倒管。3.10pH 計(jì)或 pH 試紙。3.11高壓滅菌器。3.12滅菌吸管，10mL、1mL。3.13滅菌平皿：直徑 90mm。4培養(yǎng)基和試劑4.1雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基 成分：蛋白胨40g豬膽鹽10g乳糖10g1.4 溴甲酚紫水溶液5mL卵磷脂2g吐溫 8014g蒸餾水1000mL制法：將卵磷脂、吐溫 80 溶解到少量蒸餾水中。將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶解到其余的 蒸餾水中，加到一起混勻，調(diào) pH 到 7.4，加入 0.4溴甲酚紫水溶液，混勻，分裝試管（每支試管中加一個(gè)小倒管）。68.95kPa（115 10 lb）20min 滅菌

16、。4.2伊紅美蘭（EMB）瓊脂成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氫二鉀2g瓊脂20g2伊紅水溶液20mL1.5 美藍(lán)水溶液13mL蒸餾水1000mL制法：先將瓊脂加到 900mL 蒸餾水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀蛋白胨，混勻， 使之溶解。再以蒸餾水補(bǔ)足至 1000mL。校正 pH 值為 7.27.4，分裝于三角瓶?jī)?nèi)，103.43kPa（121 15 lb）15min 高壓滅菌備用。臨用時(shí)加入乳糖并加熱融化瓊脂。冷至 60左右無 菌操作加入滅菌的伊紅美藍(lán)溶液，搖勻。傾注平皿備用。4.3蛋白胨水（作靛基質(zhì)試驗(yàn)用） 成分：蛋白胨（或胰蛋白胨）20g氯化鈉5g蒸餾水1000mL制法：將上述成分加熱

17、融化，調(diào) pH 值為 7.07.2，分裝小試管，103.43kPa（121 15 lb）15min 高壓滅菌。4.4靛基質(zhì)試劑柯凡克試劑：將 5g 對(duì)二甲氨基苯甲醛溶解于 75mL 戊醇中，然后緩慢加入濃鹽酸 25mL。 試驗(yàn)方法：接種細(xì)菌于蛋白胨水中，于 44±0.5培養(yǎng) 24h±2h。沿管壁加柯凡克試劑 0.3mL0.5mL，輕搖試管。陽性者于試劑層顯深玫瑰紅色。 注：蛋白胨應(yīng)含有豐富的色氨酸，每批蛋白胨買來后，應(yīng)先用已知菌種鑒定后方可使用。4.5革蘭氏染色液：4.5.1 染液制備4.5.1.1 結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫1g95乙醇20mL1草酸銨水溶液80mL將結(jié)晶紫溶于

18、乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。4.5.1.2 革蘭氏碘液：碘1g碘化鉀2g蒸餾水加至300mL將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。4.5.1.3脫色液：95乙醇。4.5.1.4復(fù)染液：（1）沙黃復(fù)染液：沙黃0.25g95乙醇10mL蒸餾水90mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。（2）稀石碳酸復(fù)紅液：稱取堿性復(fù)紅 10g，研細(xì)，加 95乙醇 100mL，放置過夜，濾 紙過濾。取該液 10mL，加 5石碳酸水溶液 90mL 混合，即為石碳酸復(fù)紅液。再取此液 10mL 加水 90mL，即為稀石碳酸復(fù)紅液。4.5.2 染色法4.5.2.1將涂片

19、在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染 1min，水洗。4.5.2.2滴加革蘭氏碘液，作用 1min，水洗。4.5.2.3滴加 95乙醇脫色，約 30s，或?qū)⒁掖嫉螡M整個(gè)涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整 個(gè)涂片，脫色 10s，水洗。4.5.2.4滴加復(fù)染液，復(fù)染 1min，水洗，待干，鏡檢。4.5.3 染色結(jié)果 革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。注：如用 1:10 稀釋石碳酸復(fù)紅染色液作復(fù)染，復(fù)染時(shí)間僅需 10s。5操作步驟5.1取 10mL 1：10 稀釋的檢液，加到 10mL 雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基中，置 44±0.5培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h48h，如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報(bào)告為

20、糞大腸菌群陰性。5.2如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置 36±1培養(yǎng) 18h24h。同時(shí)取 該培養(yǎng)液 12 滴接種到蛋白胨水中，置 44±0.5培養(yǎng) 24h±2h。經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上觀察有無典型菌落生長(zhǎng)。糞大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上 的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑 色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落，亦常為糞大腸菌群，應(yīng)注意挑選。 5.3挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。5.4在蛋白胨水培養(yǎng)液中，加入靛基質(zhì)試劑約 0.5mL，觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽性者液面呈玫 瑰紅色；陰性反應(yīng)液

21、面呈試劑本色。6檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告 根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌落，并經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性短桿菌，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽性，則可報(bào)告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。四、銅綠假單胞菌Pseudomonas Aeruginosa1范圍 本規(guī)范規(guī)定了化妝品中銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)方法。 本規(guī)范適用于化妝品中銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)。2定義 本規(guī)范采用下列定義。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化 酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在 42±1條件 下能生長(zhǎng)。該菌對(duì)人有致病力，可使傷處化膿，引起敗血癥等。3儀器3.1培養(yǎng)箱：4

22、2±1、36±1。3.2三角瓶，250mL。3.3試管：15×150mm。3.4滅菌平皿：直徑 90mm。3.5滅菌刻度吸管，10mL、1mL。3.6顯微鏡。3.7載玻片。3.8接種針、接種環(huán)。3.9電磁爐。3.10高壓滅菌器。4培養(yǎng)基和試劑4.1SCDLP 液體培養(yǎng)基 見總則中 3.2。4.2十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基 成分：牛肉膏3g蛋白胨10g氯化鈉5g十六烷基三甲基溴化銨0.3g瓊脂20g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調(diào) pH 為 7.47.6，加入瓊脂，68.95kPa（115 10 lb）20min 滅菌后，制成平板備用。4

23、.3乙酰胺培養(yǎng)基成分：乙酰胺10.0g氯化鈉5.0g無水磷酸氫二鉀1.39g無水磷酸二氫鉀0.73g硫酸鎂（MgSO4.7H2O）0.5g酚紅0.012g瓊脂20g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂和酚紅外，將其它成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào) pH 為 7.2，加入瓊 脂、酚紅，103.43kPa（121 15 lb）20min 高壓滅菌后，制成平板備用。4.4綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基成分：蛋白胨20g氯化鎂1.4g硫酸鉀10g瓊脂18g甘油（化學(xué)純）10g蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加溫使其溶解，調(diào) pH 至 7.4，加入 瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝于試管內(nèi)，68

24、.95kPa（115 10 lb）20min 高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆谩?.5明膠培養(yǎng)基成分：牛肉膏3g蛋白胨5g明膠120g蒸餾水1000mL制法：取各成分加到蒸餾水中浸泡 20min，隨時(shí)攪拌加溫使之溶解，調(diào) pH 至 7.4，分裝 于試管內(nèi)，經(jīng) 68.95kPa（115 10 lb）20min 滅菌后，直立制成高層備用。4.6硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g酵母浸膏3g硝酸鉀2g亞硝酸鈉0.5g蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中，加熱使之溶解，調(diào) pH 為 7.2，煮沸過濾后 補(bǔ)足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，68.95kPa（

25、115 10 lb）20min 滅菌后備用。4.7普通瓊脂斜面培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂外，將其余成分溶解于蒸餾水中，調(diào) pH 為 7.27.4，加入瓊脂，加熱溶 解，分裝試管，103.43kPa（121 10 lb）20min 高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆谩?操作步驟5.1增菌培養(yǎng)：取 1:10 樣品稀釋液 10mL 加到 90mL SCDLP 液體培養(yǎng)基中，置 36±1培養(yǎng) 18h24h。如有銅綠假單胞菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)液表面多有一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色 或藍(lán)綠色。5.2 分離培養(yǎng)：從培養(yǎng)液的薄膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種在十六烷三

26、甲基溴化銨瓊脂平板 上，置 36±1培養(yǎng) 18h24h。凡銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上，其菌落扁平無定型，向周 邊擴(kuò)散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素，此培 養(yǎng)基選擇性強(qiáng)，大腸艾希氏菌不能生長(zhǎng)，革蘭氏陽性菌生長(zhǎng)較差。在缺乏十六烷三甲基溴化銨瓊脂時(shí)也可用乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行分離，將菌液劃線接種于平 板上，放 36±1培養(yǎng) 24h±2h，銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落扁平，邊緣 不整，菌落周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色，其它菌不生長(zhǎng)。5.3 染色鏡檢：挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者應(yīng)進(jìn)行氧化酶 試驗(yàn)。5.4 氧化酶試驗(yàn)：

27、取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi)，用無菌玻璃棒挑取銅綠假 單胞菌可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的 1二甲基對(duì)苯二胺試液，在 15s30s 之內(nèi)，出現(xiàn)粉紅色或紫紅色時(shí)，為氧化酶試驗(yàn)陽性；若培養(yǎng)物不變色，為氧化酶試 驗(yàn)陰性。5.5 綠膿菌素試驗(yàn)：取可疑菌落 2 個(gè)3 個(gè)，分別接種在綠膿菌素測(cè)定培養(yǎng)基上，置 36±1培養(yǎng) 24h±2h，加入氯仿 3mL5mL，充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液 內(nèi)，待氯仿提取液呈藍(lán)色時(shí)，用吸管將氯仿移到另一試管中并加入 1mol/L 的鹽酸 1mL 左右， 振蕩后，靜置片刻。 如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時(shí)為陽性，

28、表示被檢物中有綠膿菌素存在。5.6硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基 中，置 36±1培養(yǎng) 24h±2h，觀察結(jié)果。凡在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體者， 即為陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)狻?.7 明膠液化試驗(yàn)，取銅綠假單胞菌可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置36±1培養(yǎng) 24h±2h，取出放冰箱 10min30min，如仍呈溶解狀或表面溶解時(shí)即為明膠 液化試驗(yàn)陽性；如凝固不溶者為陰性。5.8 42生長(zhǎng)試驗(yàn)：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上， 放在

29、42±1培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 24h48h，銅綠假單胞菌能生長(zhǎng)，為陽性，而近似的熒光假 單胞菌則不能生長(zhǎng)。6檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告 被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗(yàn)皆為陽性者，即可報(bào)告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌；如綠膿菌素試驗(yàn)陰性而液化明膠、硝酸鹽還 原產(chǎn)氣和 42生長(zhǎng)試驗(yàn)三者皆為陽性時(shí)，仍可報(bào)告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌。五、金黃色葡萄球菌Staphylococcus Aureus1范圍 本規(guī)范規(guī)定了化妝品中金黃金色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法。 本規(guī)范適用于化妝品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)。2定義 本規(guī)范采用下列定義金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureu

30、s）為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄狀排列，無芽胞， 無莢膜，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽性。該菌是葡萄球菌中對(duì)人類致病力最強(qiáng)的一種，能引起人體局部化膿性病灶，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo) 致敗血癥。3儀器和設(shè)備3.1顯微鏡。3.2恒溫培養(yǎng)箱：36±1。3.3離心機(jī)。3.4滅菌吸管，1mL、10mL。3.5滅菌試管：15×150mm。3.6載玻片。3.7酒精燈。4培養(yǎng)基和試劑4.1SCDLP 液體培養(yǎng)基 見總則中 3.2。4.27.5的氯化鈉肉湯成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉75g蒸餾水加至1000mL制法：將上述成分加熱溶解，調(diào) pH 為 7.4，分裝，103.43kPa（121 15 lb）1

31、5min 高 壓滅菌。4.3Baird Parker 平板成分：胰蛋白胨10g牛肉膏5g酵母浸膏1g丙酮酸鈉10g甘氨酸12g氯化鋰（LiCl·6H2O）5g瓊脂20g蒸餾水950mLpH7.0±0.2增菌劑的配制：30卵黃鹽水 50mL 與除菌過濾的 1亞碲酸鉀溶液 10mL 混合，保存 于冰箱內(nèi)。制法：將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解，冷至 25±1校正 pH。分裝每 瓶 95mL，103.43kPa（121 15 lb）高壓滅菌 15min。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，每 95mL 加入 預(yù)熱至 50左右的卵黃亞碲酸鉀增菌劑 5mL，搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是

32、致密不透明的。 使用前在冰箱貯存不得超過 48h±2h。4.4 血瓊脂培養(yǎng)基成分：營養(yǎng)瓊脂100mL脫纖維羊血（或兔血）10mL制法：將營養(yǎng)瓊脂加熱融化，待冷至 50左右無菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，制成 平板，置冰箱內(nèi)備用。4.5 甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g氯化鈉5g甘露醇10g牛肉膏5g0.2麝香草酚藍(lán)溶液12mL蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào) pH7.4，加入甘露醇和 指示劑，混勻后分裝試管中，68.95kPa（115 10 lb）20min 滅菌備用。4.6 兔（人）血漿制備取 3.8檸檬酸鈉溶液，103.43kPa（121

33、 15 lb）30min 高壓滅菌，1 份加兔（人）全 血 4 份，混勻靜置；2000rpm3000rpm 離心 3min5min。血球下沉，取上面血漿。5 操作步驟5.1增菌：取 1：10 稀釋的樣品接種到 90mL SCDLP 液體培養(yǎng)基中，置 36±1培養(yǎng)箱， 培養(yǎng) 24h±2h。注：如無此培養(yǎng)基也可用 7.5氯化鈉肉湯。5.2分離：自上述增菌培養(yǎng)液中，取 12 接種環(huán)，劃線接種在 Baird Parker 氏培養(yǎng)基，如 無此培養(yǎng)基也可劃線接種到血瓊脂平板，置 36±1培養(yǎng) 24h48h。在血瓊脂平板上菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶

34、血圈。在 Baird Parker 氏培養(yǎng)基 上為圓形，光滑，凸起，濕潤，直徑為 2mm3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周 圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶然會(huì)遇到 非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明帶。挑取單個(gè)菌落分純?cè)谘傊桨迳?，?36±1培養(yǎng) 24h±2h。5.3 染色鏡檢：挑取分純菌落，涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏 陽性菌，排列成葡萄狀，無芽胞，無夾膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直徑約為 0.5m 1m。5.4 甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：取上述分純菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基液面上加入2mm3mm 的滅菌液體石蠟，置 36±1培養(yǎng) 24h±2h，金黃色葡萄球菌應(yīng)能發(fā)酵甘露醇 產(chǎn)酸。5.5 血漿凝固酶試驗(yàn)：吸取 1:4 新鮮血漿 0.5mL，放入滅菌小試管中，加入待檢菌 24h±2h 肉湯培養(yǎng)物 0.5mL?；靹?，放 36±1恒溫箱或恒溫水浴中，每半小時(shí)觀察一次，6h 之內(nèi) 如呈現(xiàn)凝塊即為陽性。同時(shí)以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物及肉湯培養(yǎng)基各 0.