多菌靈降解菌的降解特性及GFP標(biāo)記

1、.多菌靈降解菌的降解特性及GFP標(biāo)記【摘要】：多菌靈(carbendazim，MBC)，化學(xué)名稱為N-(2-苯并咪唑基)氨基甲酸甲酯，是一種高效廣譜低毒的內(nèi)吸性殺菌劑，屬于苯胺類苯并咪唑衍生物，其使用X圍較廣，既可作為工業(yè)殺菌劑，又可作為一種有內(nèi)吸活性的植物殺菌劑，用于水果保鮮、蔬菜、果樹和谷類作物的病害防治。多菌靈化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在土壤中降解半衰期較長，能持久地殘留在使用部位，易致累積效應(yīng)，其在水體和土壤中的累積會對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成威脅。有研究表明，微生物降解是沉積環(huán)境中多菌靈去除的主要途徑。因此尋找并研究多菌靈降解菌是十分必要的。XX省農(nóng)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已分離篩選出一株細(xì)菌NY97-1，經(jīng)

2、試驗(yàn)證明該菌具有降解多菌靈的特性，若能進(jìn)一步研究其降解能力、降解條件，為其在生物修復(fù)中的應(yīng)用提供依據(jù)和實(shí)驗(yàn)材料，無疑具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。綠色熒光蛋白(GFP)基因作為標(biāo)記基因，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物學(xué)方面，由于其表達(dá)穩(wěn)定，容易觀測，因此，可以以GFP作為報(bào)告基因，對菌株NY97-1進(jìn)行GFP標(biāo)記，為今后研究多菌靈降解菌在自然環(huán)境中的定殖、分布及動態(tài)變化打下基礎(chǔ)。本文的主要研究內(nèi)容有如下幾個(gè)方面：1該菌株NY97-1的16SrDNA經(jīng)同源序列比對，同源性為99以上，結(jié)合生理生化指標(biāo)鑒定其屬于短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)。2經(jīng)BamHI酶切的啟動子探針載體pUC19-gfp

3、與NY97-1基因組DNA的Sau3AI酶切片段酶連，酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化EcoliDH5a，建立Bp的啟動子基因文庫。挑選其中的兩個(gè)強(qiáng)陽性克隆，亞克隆來自短小芽孢桿菌總基因組的啟動子活性片段F4、F5，構(gòu)建大腸桿菌-短小芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體pNW33N-GFP4、pNW33N-GFP5。通過電轉(zhuǎn)化得到gfp在Bp中的兩株標(biāo)記菌株。在熒光顯微鏡下，觀察到了明亮的綠色熒光，證明活性片段F4、F5均具有組成型啟動子的功能，實(shí)現(xiàn)了GFP基因在Bp中組成型表達(dá)，且遺傳穩(wěn)定，為今后研究多菌靈降解菌Bp在自然環(huán)境中的定殖、分布及動態(tài)變化打下了基礎(chǔ)。3本文研究并建立了多菌靈在降解培養(yǎng)基中的殘留檢測方法。該方法采用甲

4、醇和水溶液的混合液作提取劑，檢測結(jié)果表明：該方法的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度等指標(biāo)均符合農(nóng)藥殘留分析的基本要求，同以往所報(bào)道的方法相比具有樣品前處理過程相對簡單，回收率高，重復(fù)性好，且費(fèi)用較低等特點(diǎn)，適合于該降解菌的降解能力的檢測。4本文對多菌靈降解菌株NY97-1的降解性能進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：該菌株對多菌靈有較強(qiáng)的降解能力。細(xì)菌菌株NY97-1在多菌靈濃度為100mg·L(-1)的條件下，30振蕩培養(yǎng)24h，多菌靈的降解率達(dá)78.66。外界條件對降解菌的降解也有顯著影響。培養(yǎng)基初始pH在610的X圍內(nèi)均可以高效降解多菌靈，pH為4時(shí)，對降解起較大的抑制作用。在多菌靈的濃度為10300

5、mg·L(-1)時(shí)，菌株NY97-1對多菌靈的降解率為42.4490.07。在3540時(shí)對農(nóng)藥降解率最高，經(jīng)高溫高壓處理后的菌液對多菌靈仍有降解作用，說明對降解起主要作用的物質(zhì)耐熱性好。共存底物有機(jī)氮可以促進(jìn)菌株NY97-1的降解能力，而無機(jī)氮源尿素對菌株NY97-1的降解能力起抑制作用。5實(shí)驗(yàn)證明菌株NY97-1是一株多功能菌株，不僅具有降解多菌靈的功效，而且對多種枯萎菌具有拮抗效果。對番茄枯萎菌(Fusariumoxysporum(Schl.)f.sp.Lycopersici(Sacc.)SnyderetHansen)、青椒枯萎菌(Fusariumoxysporum(Schl.)

6、f.sp.vasinfectum(Snyd.etHans)、西瓜枯萎菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum(E.F.Smith)SnyderetHansen)、仙客來枯萎菌(Fusariumsp)、一品紅枯萎菌(Fusariumsp)、黃瓜枯萎菌(Fusariumoxysporum(Schl.)f.sp.cucumerinumOwen)的抑制率分別為50.8，50.8，54.1，37.5，31.6，42.5。6多菌靈單劑對供試的六種枯萎菌菌絲生長具有明顯的抑制效果，但10的NY97-1活體菌液與多菌靈混配會降低多菌靈的毒力，表現(xiàn)為混配劑3d及7d時(shí)EC_(50)均比多菌靈

7、單劑的EC_(50)大。這表明NY97-1與多菌靈共存時(shí)主要表現(xiàn)其降解作用。該結(jié)果對指導(dǎo)NY97-1的合理使用有重要意義。盡管其具有生防與降解雙重功效，但在實(shí)際應(yīng)用中仍以降解環(huán)境中殘留的多菌靈進(jìn)行生物修復(fù)為主。7研究了多菌靈處理土壤的盆栽黃瓜子葉期及開花期不同器官中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、ATP酶活性的變化。結(jié)果表明多菌靈對花期不同器官中SOD、CAT、GPx、ATP酶活性所產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用顯著大于子葉期的。多菌靈對花期根莖葉及子葉期葉中SOD活性誘導(dǎo)作用明顯。多菌靈對花期根葉及子葉期葉中CAT有明顯的誘導(dǎo)作用，對花期莖及子葉期莖有明顯的抑制

8、作用。而GPx花期及子葉期莖中有明顯的誘導(dǎo)作用。這說明隨著黃瓜的生長其抵抗逆境的能力也在增強(qiáng)。在子葉期，子葉在抵抗逆境的過程中發(fā)揮著重要的作用?！娟P(guān)鍵詞】：多菌靈生物降解短小芽孢桿菌GFP標(biāo)記抗氧化酶系統(tǒng)【學(xué)位授予單位】：XX大學(xué)【學(xué)位級別】：博士【學(xué)位授予年份】：2007【分類號】：X172【目錄】：中文摘要13-16英文摘要16-20第一章前言20-421.生物降解20-291.1微生物在生物圈進(jìn)化中的作用201.2生物降解及生物降解能力20-211.3生物降解與微生物生理活性物質(zhì)211.4檢測生物降解能力的原則21-221.5利用環(huán)境樣品和純培養(yǎng)菌進(jìn)行生物降解實(shí)驗(yàn)22-292.綠色熒光蛋

9、白在環(huán)境微生物中的應(yīng)用29-362.1綠色熒光蛋白簡介292.2綠色熒光蛋白分子的結(jié)構(gòu)及特性29-302.3綠色熒光蛋白的性質(zhì)30-312.4綠色熒光蛋白的檢測方法31-322.5綠色熒光蛋白在微生物降解污染物研究中的應(yīng)用32-363.殺菌劑多菌靈研究進(jìn)展36-403.1理化性質(zhì)363.2生態(tài)毒理36-373.3多菌靈的殘留檢測方法37-393.4多菌靈的生物修復(fù)技術(shù)39-403.5多菌靈的降解機(jī)制404.本論文的研究目的重點(diǎn)及意義40-42第二章多菌靈降解菌NY97-1分類學(xué)地位的確定42-511.材料與方法42-481.1實(shí)驗(yàn)材料42-431.2形態(tài)特征及生理生化反應(yīng)43-451.3以染色

10、體DNA為模板PCR擴(kuò)增16SrDNA45-461.4以單菌落為模板PCR擴(kuò)增16SrDNA46-482.結(jié)果48-502.1生理生化特性48-492.216SrDNA序列的NCBI在線BLAST比對結(jié)果49-503.討論50-51第三章NY97-1的綠色熒光蛋白標(biāo)記51-581材料與方法51-531.1實(shí)驗(yàn)材料511.2主要試劑與儀器51-521.3NY97-1基因組DNA啟動子基因文庫的構(gòu)建521.4強(qiáng)啟動子片斷的序列測定及分析521.5NY97-1組成型啟動子活性片段的亞克隆及GFP基因穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建521.6重組DNA的電轉(zhuǎn)化重組DNA的電轉(zhuǎn)化52-531.7轉(zhuǎn)化子的熒光檢測531

11、.8轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性檢測532.結(jié)果53-552.1啟動子基因文庫的構(gòu)建532.2強(qiáng)啟動子片斷的測序分析532.3穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建53-542.4轉(zhuǎn)化子的熒光檢測與穩(wěn)定性檢測54-553.討論55-58第四章NY97-1降解多菌靈的研究58-641.材料與方法58-601.1材料與儀器581.2多菌靈降解率的檢測58-591.3菌懸液的制備591.4多菌靈濃度對菌株降解多菌靈的影響591.5氮源對菌株降解多菌靈的影響591.6pH值對菌株降解多菌靈的影響59-601.7培養(yǎng)溫度對菌株降解多菌靈的影響602.結(jié)果60-622.1多菌靈標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制602.2多菌靈濃度對菌株降解多菌靈的影響60-

12、612.3氮源對菌株降解多菌靈的影響612.4pH值對菌株降解多菌靈的影響61-622.5培養(yǎng)溫度對菌株降解多菌靈的影響623.討論62-634.結(jié)論63-64第五章NY97-1對多菌靈毒力的影響64-711.試驗(yàn)材料與方法64-651.1實(shí)驗(yàn)材料64-651.2菌株NY97-1對六種病原真菌的拮抗性能測定651.3多菌靈對六種病原真菌的毒力測定651.4低濃度多菌靈與NY97-1菌液混配對六種病原真菌的共同作用652.結(jié)果65-672.1NY97-1對六種枯萎病原菌的拮抗效果65-672.2多菌靈單劑對六種枯萎病原菌的毒力測定結(jié)果672.3多菌靈與NY97-1菌液對六種枯萎病原菌的共同作用6

13、73.小節(jié)與討論67-71第六章多菌靈對黃瓜抗氧化酶及ATP酶的影響71-791.材料與方法71-731.1儀器與試劑711.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)71-721.3樣品預(yù)處理及酶活性測定72-732.結(jié)果與分析73-752.1不同濃度多菌靈對黃瓜SOD活性的影響732.2不同濃度多菌靈對黃瓜CAT活性的影響73-742.3不同濃度多菌靈對黃瓜GP_X活性的影響74-752.4不同濃度多菌靈對黃瓜Na+-ATP活性的影響752.5不同濃度多菌靈對黃瓜Mg(2+)-ATP活性的影響753.討論75-79第七章多菌靈降解菌的使用對多菌靈脅迫下黃瓜抗氧化酶及ATP酶的影響79-861.材料方法79-801.1供試土壤79-801.2供試菌株801.3殺菌劑多菌靈及其降解菌的使用801.4測定方法801.5數(shù)據(jù)處理802.結(jié)果與分析80-832.1降解菌的使用對黃瓜細(xì)菌蛋白的含量的影響80-812.2降解菌的使用對黃瓜SOD酶的影響812.3降解菌的使用對黃瓜CAT酶的影響81-822.4降解菌的使用對黃瓜ATP酶的影響82-833.討論83-86第八章本文主要研究結(jié)論及展望86-901.本文主要研究結(jié)論86-881.1關(guān)于PCR擴(kuò)增16SrDNA基因序列時(shí)模板的選