藥物的雜質(zhì)檢查

1、第三章 藥物的雜質(zhì)檢查第一節(jié) 概述一、藥物的純度要求1藥物純度：指藥物的純潔程度。2. 藥物純度的要求是不斷提高：3.藥物的純度是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中“檢查”項(xiàng)下控制. 內(nèi)容：雜質(zhì)名稱、項(xiàng)目、檢查方法、允許的限量.4.藥物純度的評(píng)價(jià)應(yīng)把藥物的性狀、理化常數(shù)、雜質(zhì)檢查、含量測定等作為一個(gè)有聯(lián)系的整體來評(píng)價(jià)藥物的純度。5.藥用規(guī)格與化學(xué)試劑 藥用：對(duì)生物體引起的生理和毒副作用化學(xué)試劑：對(duì)化學(xué)使用的目的考慮，對(duì)生物體引起的生理 和毒副作用不考慮。雜質(zhì)的認(rèn)識(shí)：是逐漸積累起來的.定義:任何影響藥物純度的物質(zhì)統(tǒng)稱為雜質(zhì)。雜質(zhì)的研究是藥品研發(fā)的一項(xiàng)重要內(nèi)容。它包括選擇合適的分析方法，準(zhǔn)確地分辨與測定雜質(zhì)的含量并綜合藥

2、學(xué)、毒理及臨床研究的結(jié)果確定雜質(zhì)的合理限度。這一研究貫穿于藥品研發(fā)的整個(gè)過程。二、雜質(zhì)的來源與種類 了解藥物中的雜質(zhì)的來源和種類，可制定出檢查的項(xiàng)目和方法.雜質(zhì):藥物中存在的無治療作用，影響藥物的療效和穩(wěn)定性,甚至對(duì)人體健康有害的物質(zhì)。雜質(zhì)檢查（純度檢查）：利用各種分析技術(shù)，對(duì)藥物中無治療作用、影響藥物穩(wěn)定性和療效以及危害人體健康的物質(zhì)進(jìn)行檢查。（一）雜質(zhì)的來源 有兩個(gè)方面：一是在生產(chǎn)過程中引入；二是在貯藏過程中引入。1. 生產(chǎn)過程中引入的雜質(zhì)：主要指藥物在合成過程中，未反應(yīng)的原料、中間體和副產(chǎn)物.2.貯藏過程引入的雜質(zhì)主要指外界條件的變化或微生物的作用可能發(fā)生的水解、氧化、異構(gòu)化、晶型轉(zhuǎn)化、

3、聚合等變化，而產(chǎn)生的有關(guān)雜質(zhì)。（二）雜質(zhì)的種類與分類 按雜質(zhì)的來源分為一般雜質(zhì)和特殊雜質(zhì)；按性質(zhì)可分為信號(hào)雜質(zhì)和有害雜質(zhì);按結(jié)構(gòu)組成可分為無機(jī)雜質(zhì)和有機(jī)雜質(zhì)。一般雜質(zhì)是指在自然界中分布較廣泛，在多種藥物的生產(chǎn)和貯藏過程中容易引入的雜質(zhì)。特殊雜質(zhì)是指在個(gè)別藥物的生產(chǎn)和貯藏過程中容易引入的雜質(zhì)。信號(hào)雜質(zhì)一般無害，但其含量的多少可以反映出藥物的純度水平，氯化物、硫酸鹽等就屬于信號(hào)雜質(zhì)。有害雜質(zhì)，如重金屬、砷鹽、氰化物等，對(duì)人體有害，在藥品標(biāo)準(zhǔn)中必須嚴(yán)格控制。 按理化性質(zhì) 有機(jī)雜質(zhì)、無機(jī)雜質(zhì)、殘留溶劑；按照其來源 工藝雜質(zhì)（包括合成中未反應(yīng)完全的反應(yīng)物、試劑、中間體、 副產(chǎn)物等）降解產(chǎn)物從反應(yīng)物及試劑

4、中混入的雜質(zhì)等。；按照其毒性 毒性雜質(zhì)、普通雜質(zhì)；按化學(xué)結(jié)構(gòu) 如甾體、生物堿、幾何異構(gòu)體、光學(xué)異構(gòu)體聚合物等。 三、雜質(zhì)檢查方法1.標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法(限量檢查法) 一般在納氏比色管中進(jìn)行，同時(shí)取兩只比色管（樣品管和對(duì)照管）做平行試驗(yàn)來檢查。如通過顏色和濁度對(duì)照。2.靈敏度法 用反應(yīng)的靈敏度來控制雜質(zhì)限量，即在供試品溶液中加入試劑，在試驗(yàn)條件下，不得有正反應(yīng)進(jìn)行。如蒸餾水中氯化物的檢查，加入酸性硝酸銀不得發(fā)生渾濁。3.比較法 取一定量的供試品，在規(guī)定的條件下測定待檢雜質(zhì)的吸光度與規(guī)定的限量的比較，來判斷供試品中雜質(zhì)的限量。四、雜質(zhì)的限量檢查1雜質(zhì)限量 定義：藥物中所含雜質(zhì)的最大允許量。通常用百分之幾或

5、百萬分之幾（ppm）來表示。2雜質(zhì)限量的計(jì)算 雜質(zhì)限量的計(jì)算公式：雜質(zhì)限量 = 雜質(zhì)的最大允許量÷供試品的量×100% = 標(biāo)準(zhǔn)液濃度×體積÷供試品的量×100%，L（%） = C×V/S×100% 例1對(duì)乙?；又械穆然锏臋z查：已知：S = 2.0g×25/100；C = 10g/ml；V = 5.0ml求： L = ？解： L = C×V/S×100% = 10×5.0/2.0×106×25/100×100% = 0.01% 例2葡萄糖中重金屬的檢查

6、：已知：S = 4.0g；C = 10g/ml；L = 5×10-6，求： V = ？ 解：V = L×S / C = 5×10-6×4.0/10×10-6 = 2.0(ml)例3葡萄糖中砷鹽的檢查：已知：V = 2.0ml；C = 1g/ml；L = 0.0004%，求： S = ？ 解： S = C×V / L = 1×10-6×2.0/4×10-6 = 0.5( g )例4磷酸可待因中嗎啡的檢查：已知：V = 5.0ml；C = 0.02 mg/ml；S = 0.1g求： L = ？ 解： L =

7、C×V / S = 5.0×0.02/0.1×1000 ×100%= 0.1%注意點(diǎn) 單位一致 稀釋倍數(shù) 表示方法（%，mmp）第二節(jié) 一般雜質(zhì)的檢查方法一、氯化物的檢查1原理：是利用氯化物在硝酸性溶液中與硝酸銀試液作用，生成氯化銀的白色渾濁液，與一定量標(biāo)準(zhǔn)氯化鈉溶液在相同條件下生成的氯化銀混濁液比較，以判斷供試品中氯化物是否超過限量。 Cl- + Ag+ AgCl2條件： Cl-:0.05mg0.08mg/50ml,即相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)氯化鈉溶液58ml。酸度 稀硝酸10ml/50ml; 溫度 30403干擾的排除（1）供試品液混濁：可用含硝酸的蒸餾水洗凈濾紙

8、中氯化物后過濾來消除混濁對(duì)氯化物檢查的干擾。 （2）供試品有色：可采用內(nèi)消色法，按中國藥典附錄規(guī)定的方法處理二、硫酸鹽檢查法 1原理 是利用SO42-在鹽酸酸性溶液中與氯化鋇試液作用，生成硫酸鋇的白色渾濁液，與一定量標(biāo)準(zhǔn)硫酸鉀溶液在相同條件下生成的硫酸鋇渾濁液比較，以判斷供試品中硫酸鹽是否超過限量。2條件：SO42- 0.10.5mg/50ml, 即相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)硫酸鉀溶液15ml。酸 度 稀鹽酸2ml/50ml。3干擾的排除：供試品有色：可采用內(nèi)消色法。三、鐵鹽檢查法（一）硫氰酸鹽法1原理 Fe3+ + 6SCN- Fe(SCN)6-3- 紅色 2條件：Fe3+ 0.01mg0.05mg/50m

9、l, 即相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液15ml;酸度 稀鹽酸4ml/50ml。 3干擾的排除（1） 當(dāng)有Fe2+存在時(shí)，加氧化劑過硫酸銨氧化Fe2+成Fe3+。（2） 當(dāng)供試液管與對(duì)照溶液管色調(diào)不一致，或所呈硫氰酸鐵的顏色較淺不便比較時(shí)，可分別移入分液漏斗中，加正丁醇或異戊醇提取，分別取提取液比色。(二）巰基醋酸法1. 原理 巰基醋酸還原Fe3+為Fe2+，在氨堿性試液中與Fe 2 +作用生成紅色配位離子。 2. 說明 加巰基醋酸溶液前，先加枸櫞酸溶液，使其與鐵離形成配位離子，以免在氨堿性溶液中產(chǎn)生氫氧化鐵沉淀。（此法靈敏度比較高，但試劑較貴）四、重金屬檢查法重金屬是指在實(shí)驗(yàn)室條件下與S2-作用顯色的金屬雜

10、質(zhì)，如銀、鉛、汞、銅、鎘、錫、銻、鉍等，由于藥品生產(chǎn)過程中遇到鉛的機(jī)會(huì)比較多，鉛在體內(nèi)友易積蓄中毒，故檢查時(shí)以鉛作為代表。中國藥典（2000年版）重金屬的檢查法一共收載了四種方法第一法為硫代乙酰胺法；第二法是將供試品在500600熾灼破壞后，再按第一法檢查；第三法是檢查能溶入堿溶液，而不溶于酸溶液的藥物，在堿性條件下用硫化鈉作顯色劑；第四法為微孔濾膜法，比較供試溶液和對(duì)照溶液鉛斑的顏色，來判斷供試品種的重金屬是否超過限量。重點(diǎn)討論第一法。1原理 2條件：Pb2+10µg20µg/27ml,相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液12ml。酸 度 pH 3.03.5. 3干擾的排除：(1) 供試品有

11、色：可采用外消色法消除干擾。 (2) 供試品有微量Fe3+:在弱酸性溶液中氧化硫化氫析出硫，產(chǎn)生混濁影響比色，可加Vc或鹽酸羥胺使Fe3+氧化成Fe2+離子再檢查。 五、砷鹽檢查法中國藥典采用古蔡法和二乙基二硫代氨基甲酸銀法（Ag-DDC）檢查藥物中的微量的砷鹽。 （一）古蔡法(Gutzeit,BP也采用此法） 1. 原理 2. 裝置與試劑作用(1) 驗(yàn)砷儀 砷化氫發(fā)生瓶;中空磨口塞;導(dǎo)氣管 (2) 試劑的作用 KI-SnCl2的作用：交替還原作用；首先將AsO43-還原成AsO33-，生成的碘再被還原成碘離子。 Zn粒與氯化亞錫作用，在其面上形成Zn-Sn齊，起去極化作用。 Pb(AC)2棉

12、的作用是消除供試品可能含有的少量的硫化物。3. 干擾的排除（1）供試品為S2-,SO32-, S2O32-等: 因在酸中生成H2S,SO2,與HgBr作用生成HgS或Hg，干擾砷斑檢查。用硝酸氧化成硫酸鹽可消除。（2）供試品為Fe3+ 能消耗KI，SnCl2 應(yīng)測定條件，先可加足量KI。（3）含銻藥物 銻鹽被還原為SbH3與HgBr2試紙作用，產(chǎn)生灰色銻斑，干擾砷斑的檢查，可改用Betterdorff法。（二）Ag-DDC法(二乙基二硫代氨基甲酸銀，USP采用此法)1.原理：是利用砷化氫與Ag-DDC吡啶溶液作用，使Ag-DDC中的銀還原為紅色膠態(tài)銀，以Ag-DDC溶液為空白，于510nm的波

13、長處，測定吸收度，供試品溶液的吸收度不得大于標(biāo)準(zhǔn)砷溶液的吸收度。2.試劑的作用：同古蔡法。六、溶液顏色檢查法溶液顏色檢查法是控制藥物中有色雜質(zhì)量的方法。中國藥典 （2000年版）收載有三種方法： K2Cr2O7 黃、綠 1. 標(biāo)準(zhǔn)比色液進(jìn)行比較的方法 標(biāo)準(zhǔn)比色液 CoCl2 橙黃,橙紅 2. 分光光度法 CuSO4 棕紅 3. 色差計(jì)法 通過測定供試品與標(biāo)準(zhǔn)比色液或水之間的色差值七、易炭化物檢查法是檢查藥物中遇硫酸易炭化或易氧化而呈色的微量有機(jī)雜質(zhì)。這類雜質(zhì)多數(shù)結(jié)構(gòu)未知，常采用與標(biāo)準(zhǔn)比色液比色的方法進(jìn)行檢查。(標(biāo)準(zhǔn)比色液為CoCl2, K2Cr2O7, CuSO4) 八、溶液澄清度檢查法是檢查

14、藥物中的微量不溶性雜質(zhì)。常采用與濁度標(biāo)準(zhǔn)液比濁的方法進(jìn)行檢查。濁度標(biāo)準(zhǔn)液制備原理：九、熾灼殘?jiān)鼨z查法BP稱硫酸灰分（sulphated ash)：是檢查有機(jī)藥物中混入的各種無機(jī)雜質(zhì)。常采用重量方法進(jìn)行檢查。 十、干燥失重檢查法主要檢查藥物中的水分及其他揮發(fā)性的物質(zhì)。常采用重量方法進(jìn)行檢查。常用的方法有四種：（一）常壓恒溫干燥法;（二）干燥劑干燥法;（三)減壓干燥法； (四）熱分析法：熱重分析法、差示熱分析、差示掃描量熱法 1.熱重分析法（thermogravimetric analysis, TGA)在程序升溫下，測量物質(zhì)的質(zhì)量與溫度的關(guān)系，研究物質(zhì)在加熱同時(shí)失重的情況下，所發(fā)生的質(zhì)的變化，常

15、用于藥物穩(wěn)定性的研究；貴重和易氧化藥物的干燥失重測定。(長春堿)2.差示熱分析（differentialtherml analysis , DTA)是在程序升溫下，測量被測物質(zhì)和參比物之間的溫差與溫度關(guān)系的一種技術(shù)。參比物是一種惰性物質(zhì)，在加熱過程中不發(fā)生相變和化學(xué)變化。因此溫差(T)只與被測物質(zhì)的量質(zhì)變化有關(guān)。T=0 被測物未發(fā)生吸熱或放熱反應(yīng);T= - 為吸熱峰;T= + 為放熱峰.3.差示掃描量熱法是在程序升溫下，測量維持樣品和參比物的溫度相同，系統(tǒng)所需供給樣品隨溫差變化的能量的一種技術(shù)。DSC與DTA的不同之處是記錄方式不同，是記錄系統(tǒng)供給的能量，吸熱供給能量；放熱減少供給的能量。在藥

16、物分析中應(yīng)用與DTA相同。DSC-TG常聯(lián)合用。十一、有機(jī)溶劑殘留量測定法ChP(1995)主要檢查藥物在生產(chǎn)過程中引入的有害的有機(jī)溶劑(如苯、氯 仿、二氯甲烷、吡啶、甲苯、環(huán)氧乙烷、二氧六環(huán)等）。常采用 氣相色譜法方法進(jìn)行檢查。常用的方法有二種： 直接進(jìn)樣法和 頂空進(jìn)樣法（試用于揮發(fā)性大的樣品測定）。色譜系統(tǒng)性試驗(yàn)的要求：(1) N1000;(2) 用內(nèi)標(biāo)法測定時(shí)，要求R1.5;(3)外標(biāo)法測定時(shí)，待測物的峰面積的RSD10%。 殘留有機(jī)溶劑測定的方法和限量第三節(jié) 特殊雜質(zhì)的檢查方法一、利用藥物和雜質(zhì)在物理性質(zhì)上的差異（一）臭味及揮發(fā)性質(zhì)的差異例如：黃凡士林中異性有機(jī)物檢查：本品2.0g,直

17、火加熱無辛味。濃過氧化氫中不揮發(fā)性雜質(zhì)檢查：10ml水浴蒸干殘?jiān)?5mg（二）顏色差異例如：磺胺嘧啶中有色偶氮苯化合物的檢查：取本品2.0g，加NaOH試液10ml，加水25ml，與黃色3號(hào)比色液比，不得更深。（三）溶解行為的差異：例如：吡哌酸中堿中不溶物吡哌酸甲酯（I）和（II）檢查.（四）旋光性質(zhì)的差異：例如：硫酸阿托品中莨菪堿檢查：本品溶液(50mg/ml)-0.4（五）對(duì)光吸收性質(zhì)的差異1. 紫外分光光度法：例如: 地蒽酚中二羥基蒽醌的檢查.再如：苯丙醇中苯丙酮的檢查：可利用供試液的吸收度比來控制雜質(zhì);純品苯丙醇A247nm/A258nm= 0.59; 99.5% 時(shí)A247nm/A2

18、58nm= 0.79;因此規(guī)定供試品A247nm/A258nm 0.79; 即所含苯丙酮0.5%.2.原子吸收分光光度法：是通過測定藥物中所含待測元素原子蒸氣，吸收發(fā)自光源的該元素特定波長的程度，以求出藥物中待測元素的含量。限量檢查時(shí)：對(duì)照品液 = 供試品 + 限量- a 供試品液 = - b符合規(guī)定時(shí) b (a-b); b (a-b)不合格。3.紅外分光光度法：主要用于藥物中無效或低效晶型檢查，如甲苯咪唑中A晶型檢查4.熒光分析法 (六)吸附或分配性的差異 1.薄層色譜法(TLC) (2)高低濃度對(duì)比品法2.紙層析法(PC)常用于極性大的藥物的分離、分析，如地高辛中的有關(guān)雜質(zhì)的檢查。3.高效

19、液相色譜法(HPLC)（1）峰面積歸一化法：L% = Ai /(Ai + A主）×100% 例如：利巴韋林中有關(guān)雜質(zhì)的檢查：對(duì)照品液(5g/ml)進(jìn)樣10l,調(diào)靈敏度，使主峰達(dá)滿量程的20%25%,樣品液(0.4mg/ml)進(jìn)樣10l, 雜質(zhì)Ai(Ai+A主）的1.0%.（2）不加校正因子主成分對(duì)照法：對(duì)照品液為供試品的稀釋液進(jìn)樣測得A主,供試品液進(jìn)樣測得Ai 其AiA主,即為合格.例如:甲硝唑中2-甲基-5-硝基咪唑:對(duì)照品液(0.01mg/ml)進(jìn)樣20l,調(diào)靈敏度，使主峰達(dá)10%30%,樣品液(0.14mg/ml)進(jìn)樣20l,雜質(zhì)AiA主的1.0%.（3）內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供

20、試品中雜質(zhì)的含量：對(duì)照品+內(nèi)標(biāo) 進(jìn)樣求校正因子（f)=(As/Cs)/(AR/CR) 供試品+內(nèi)標(biāo) 進(jìn)樣求AX.AS,則雜質(zhì)濃度CX = f ×AX/(AS/CS)4.氣相色譜法(GC)主要用于藥物中揮發(fā)性的雜質(zhì)檢查，其檢查方法與HPLC法相同。二、利用藥物和雜質(zhì)在化學(xué)性上的差異（一）酸堿性的差異：1.規(guī)定消耗滴定液體積：例如己酸羥孕酮中正己酐、對(duì)甲苯磺酸檢查：(NaOH 0.02mol/L)取本品0.20g + 中性乙醇 + 溴麝香草酚藍(lán) 微藍(lán)色0.50ml 2.pH法：例如乙琥胺中2-甲基-2-乙基丁二酸檢查：0.01g/ml pH3.04.5. 3.指示劑法：例如苯巴比妥中苯基丙二酰脲檢查：其水溶液不得使甲基橙顯紅色。（二）氧化還原性的差異：例如：NaCl中I-和Br-檢查EOCl/2Cl- =+1.3595V EOBr/2Br- =+1.065V EOI/2I- =+0.5345V ,因此+NaNO2+H2SO4+淀粉顯藍(lán)色.再例如：鹽酸嗎啡中阿樸嗎啡的檢查：