202X_202X學(xué)年高中生物專(zhuān)題5課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課件新人教版選修1

1、課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1.能進(jìn)行PCR技術(shù)的基本操作。2.能記住PCR的原理。3.能說(shuō)出PCR的應(yīng)用。一二三四五一、PCR原理1.細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制所需基本條件DNA分子能準(zhǔn)確復(fù)制的原因有哪些?提示:DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提供模板;堿基互補(bǔ)配對(duì)。一二三四五2.子鏈延伸的方向(1)DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?通常將DNA的羥基末端稱(chēng)為3端,而將磷酸基團(tuán)的末端稱(chēng)為5端。DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA,而只能從3端延伸DNA鏈,因此,DNA復(fù)制需要引物。(2)DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸。3.DNA分子復(fù)制的人工控制(1)雙鏈的解開(kāi)是進(jìn)行DNA復(fù)制的前提。在體外可通過(guò)控制溫度來(lái)

2、實(shí)現(xiàn)。在80100 的溫度范圍內(nèi),DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體,雙鏈分開(kāi),這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為變性。 (4)高溫可以打開(kāi)DNA雙鏈,但會(huì)導(dǎo)致普通的DNA聚合酶失活。后來(lái)耐高溫的TaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用,大大增加了PCR的效率。一二三四五(3)PCR利用了DNA的熱變性原理,通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合。(4)由于PCR過(guò)程的溫度高,會(huì)導(dǎo)致普通的DNA聚合酶失活,后來(lái)耐高溫的TaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用,大大增加了PCR的效率。(5)PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行,需提供:DNA模板,分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物,四種脫氧核苷酸,耐熱的DNA聚合酶,同時(shí)通過(guò)控制溫度使DNA復(fù)制在

3、體外反復(fù)進(jìn)行。一二三四五二、PCR的反應(yīng)過(guò)程1.PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán),每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。2.在循環(huán)之前,常要進(jìn)行一次預(yù)變性,以便增加大分子模板DNA徹底變性的概率。3.過(guò)程(1)變性:當(dāng)溫度上升到90 以上時(shí),雙鏈DNA解聚為單鏈。(2)復(fù)性:當(dāng)溫度下降到50 左右時(shí),兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。(3)延伸:當(dāng)溫度上升到72 左右時(shí),合成新的DNA鏈。4.從第二輪循環(huán)開(kāi)始,上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng),并且由引物延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物結(jié)合,進(jìn)行DNA的延伸,這樣,DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列,使這段固定長(zhǎng)度的序

4、列呈指數(shù)擴(kuò)增。一二三四五三、實(shí)驗(yàn)操作在PCR實(shí)驗(yàn)中,通常要用到微量離心管。具體操作時(shí),用微量移液器依次加入各種組分。一二三四五四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1.為避免外源DNA等因素的污染,PCR實(shí)驗(yàn)中使用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。2.緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份,并在-20 儲(chǔ)存。3.在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí),每吸取一種成分后,移液器上的槍頭都必須更換。所有成分加入后蓋嚴(yán)離心管口的蓋子。4.混勻后要離心處理,使反應(yīng)液集中在離心管底部,再放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。你知道怎樣獲得大量的乙肝病毒基因嗎?提示:采用PCR技術(shù)對(duì)乙肝病毒基因進(jìn)行迅速擴(kuò)增。一二三四五五、DNA含量的測(cè)定

5、1.理論上DNA擴(kuò)增呈指數(shù)增長(zhǎng),即一條DNA片段循環(huán)n次后產(chǎn)物DNA的數(shù)目為2n,但實(shí)際可能會(huì)有諸多因素影響DNA含量,所以需要對(duì)DNA含量進(jìn)行測(cè)定。2.DNA在260 nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰,峰值的大小與DNA的含量有關(guān),可以利用DNA這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測(cè)定。比較細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制與體外DNA擴(kuò)增(PCR) 題型一題型二題型一 PCR的原理及應(yīng)用【例題1】 下列關(guān)于PCR的描述,錯(cuò)誤的是()A.PCR技術(shù)的原理是DNA復(fù)制B.PCR是一種酶促反應(yīng),需耐高溫的解旋酶和DNA聚合酶C.一個(gè)DNA片段經(jīng)PCR擴(kuò)增,理論上可以形成2n個(gè)DNA片段(n代表循環(huán)次數(shù))D.PCR利用DNA的

6、熱變性原理來(lái)控制DNA的解聚與結(jié)合解析:PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù),以極少量的DNA為模板,DNA聚合酶從引物的3端連接脫氧核苷酸,短時(shí)間內(nèi)迅速?gòu)?fù)制上百萬(wàn)份的DNA拷貝。PCR利用DNA的熱變性原理來(lái)解旋,不需要解旋酶。答案:B題型一題型二反思領(lǐng)悟DNA復(fù)制時(shí)要解螺旋,細(xì)胞內(nèi)DNA的解旋需要解旋酶催化,而體外DNA復(fù)制時(shí)一般是加熱解旋。題型一題型二題型二 PCR技術(shù)操作【例題2】 在PCR實(shí)驗(yàn)操作中,下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是 ()A.在微量離心管中添加各種試劑時(shí),只需一個(gè)槍頭B.離心管的蓋子一定要蓋嚴(yán),防止液體外溢C.用手輕彈離心管壁的目的是使反應(yīng)液充分混合D.離心的目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部,提高反應(yīng)效果解析:在微量離心管