Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量

1、Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量一、 實驗?zāi)康?#216; 掌握Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的原理、操作技術(shù)Ø 掌握制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的要領(lǐng)，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品溶液中待測定物質(zhì)含量。Ø 提高在嚴(yán)格時間限定下的實驗操作能力。二、 實驗原理蛋白質(zhì)分子中酪氨酸可以和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍(lán)色反應(yīng)，此法由folin在1921年開創(chuàng)。1951年，Lowry對此法進(jìn)行了改進(jìn)，先于標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng)，提高了靈敏度。第一步：雙縮脲反應(yīng)在堿性溶液中,雙縮脲(H2NOCNHCONH2)能與Cu2+作用,形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物。即在堿性溶液中，蛋白

2、質(zhì)分子中的具有雙縮脲結(jié)構(gòu)的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu2+作用生成紫紅色的蛋白質(zhì)- Cu2+復(fù)合物。第二步：Folin-酚顯色反應(yīng)Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)(鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物)。蛋白質(zhì)- Cu2+復(fù)合物中所含的帶酚羥基的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比較即可求出樣品中蛋白質(zhì)的含量。三、 實驗材料（一）樣品健康人血清（300倍稀釋，正常人血清蛋白質(zhì)含量：6080 g/L）（二） 試劑牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（200g/ml），

3、堿性硫酸銅溶液，F(xiàn)olin-酚試劑（三） 儀器與器材V-1100分光光度計，恒溫水浴箱，移液管（2mL），洗耳球，試管6支，試管架，加樣槍，加樣槍架四、 實驗步驟（一） 操作步驟 見表1-1 表1-1 folin-酚試劑法定量蛋白質(zhì)實驗步驟步驟操作1.反應(yīng)體系取6支試管編號，按下表加入試劑，混勻試劑（ml） 空白管 標(biāo)準(zhǔn)管 樣品管 1 2 3 4 5 6牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 - 0.2 0.4 0.6 0.8 -樣品液 - - - - - 0.5蒸餾水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.52.雙縮脲反應(yīng)向各管內(nèi)分別加入堿性硫酸銅溶液2.0ml，搖勻，室溫放置10min3.folin-酚

4、反應(yīng)向各管加入folin-酚試劑0.2ml，2s內(nèi)迅速搖勻。40水浴10min后，冷卻至室溫4.比色測定用500ml波長比色，用1號管作空白對照，讀取各管吸光度值，每管重復(fù)測三次，求平均值用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（二） 注意事項1. 操作控制：folin-酚試劑加到堿性銅-蛋白質(zhì)溶液中后，必須立即混勻，使還原反應(yīng)發(fā)生在磷鉬酸-磷鎢酸被破壞之前2. 時間控制：因反應(yīng)顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間。第1值試管加入2.0ml堿性硫酸銅試劑后，開始計時，1min后，第2支試管再加入2.0ml堿性硫酸銅，以此類推。余下試劑的加入步驟和檢測中，每支試管間均需嚴(yán)格執(zhí)行1min鐘的時間間隔操作。五

5、、 實驗結(jié)果與分析1. 現(xiàn)象與圖片記錄 操作現(xiàn)象雙縮脲反應(yīng)：各管內(nèi)分別加入堿性硫酸銅溶液2.0ml，搖勻，室溫放置10min后溶液呈無色透明，無明顯現(xiàn)象 folin-酚反應(yīng)初：各管加入folin-酚試劑0.2ml，2s內(nèi)迅速搖勻25號試管溶液變黃色，顏色逐漸加深，6號試管黃色深度介于2號和3號試管之間將各試管40水浴10min,冷卻至室溫25號試管溶液變藍(lán)色，顏色逐漸加深，6號試管藍(lán)色深度介于2號與3號試管之間2. 數(shù)據(jù)記錄 按照表1-1記錄各管在500nm波長測得的吸光度值表1-2 500nm波長吸光度值記錄測定次數(shù)各管吸光度值A(chǔ)500 1 2 3 4 5 6120 0.127 0.275

6、0.336 0.465 0.1630 0.128 0.275 0.336 0.466 0.1643 0 0.128 0.276 0.336 0.467 0.165各管平均值 0 0.128 0.275 0.336 0.466 0.1643. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以A500為縱坐標(biāo)，牛血清清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液為橫坐標(biāo)，根據(jù)所得數(shù)據(jù)描點連線，所繪制曲線如下從圖中可以看出線性方程:y=0.003x, 將樣品溶液的吸光度（即y值）代入方程，求得樣品濃度為55g/ml4. 結(jié)果計算血清蛋白濃度(g/ml)=樣品蛋白質(zhì)濃度×2×300 =55g/ml×2×300 =33000g/m

7、l = 33g/L 本次實驗中所測結(jié)果為33g/L，相比較正常范圍（6080 g/L），結(jié)果明顯偏低，故認(rèn)為此次實驗并未成功，問題分析如下5. 問題分析問題解析實驗所測血清蛋白濃度偏低1. 洗滌試管后未等試管晾干直接進(jìn)行實驗，導(dǎo)致試管內(nèi)殘留的蒸餾水稀釋了樣品液2. 使用加樣搶移取樣品液時可能少量樣品液殘留于槍頭3. Folin-酚反應(yīng)時因?qū)嶒炇覔矶?，器材使用受限，?dǎo)致反應(yīng)時間間隔控制不一致，樣品液（在第6支試管內(nèi)）反應(yīng)時間相對偏過短6. 回顧與反思ü Folin-酚試劑法的優(yōu)缺點有哪些？優(yōu)點：儀器配置要求較低，使用試劑量少，節(jié)約資源 靈敏度相比雙縮脲試劑法高缺點：操作步驟多，耗時長 Folin-酚試劑專一性較低，干擾物質(zhì)多，穩(wěn)定性差ü