免疫基礎(chǔ)—變形鏈球菌疫苗的研究進(jìn)展2002014002童亞楠

1、變形鏈球菌疫苗的研究進(jìn)展2002014002 研二隊(duì) 童亞楠 微生物學(xué)摘要：齲病是人類最常見的口腔疾病之一，嚴(yán)重威脅著人群的口腔健康。全國(guó)第三次口腔健康流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)5歲兒童乳牙患齲率為66O，齲均為35012歲兒童恒牙患齲率為289，齲均為054；3544歲中年人群患齲率為881，齲均(平均齲、失、補(bǔ)指數(shù))為451；6574歲老年人群患齲率為984，齲均(平均齲、失、補(bǔ)指數(shù))為1465。變形鏈球菌組細(xì)菌，主要是Streptococcus mutans 和Streptococcus sobrinus 被認(rèn)為是最重要的致齲微生物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究已證實(shí)，通過免疫學(xué)干預(yù)致齲菌在口腔的定植

2、能夠影響齲病的發(fā)生，防齲疫苗有望成為一種新的齲病預(yù)防措施。根據(jù)特異性抗體來源，免疫防齲可分為防齲疫苗主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫防齲兩種途徑。本文就現(xiàn)有的齲齒疫苗做出綜述，簡(jiǎn)單的介紹一下齲病的分子學(xué)發(fā)生機(jī)制和齲齒疫苗的發(fā)展歷程和現(xiàn)有種類。關(guān)鍵詞：齲病，變形鏈球菌，疫苗一齲病的分子學(xué)發(fā)病機(jī)制齲病是乳酸等有機(jī)酸溶解牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)中的無機(jī)物的結(jié)果。這些有機(jī)酸是口腔生物膜中特定細(xì)菌尤其是變異鏈球菌屬(Mutans Streptococci)的代謝終產(chǎn)物, 而變異鏈球菌廣泛存在于人類和其他種系動(dòng)物的口腔中, 與齲病密切相關(guān)。變異鏈球菌是齲病的主要病原菌之一,變異鏈球菌表面蛋白對(duì)細(xì)菌在牙面的初始黏附及菌體之間的聚集

3、起重要作用。有研究證實(shí)表面蛋白抗原/的陽(yáng)性免疫與抗蛋白P1單克隆抗體的陰性免疫都能抑制變異鏈球菌致齲,因此表面蛋白P1已被看作齲病疫苗開發(fā)的潛在抗原1。齲病的發(fā)生分為三個(gè)階段。第一階段為微生物在牙齒表面獲得性薄膜上的初始黏附, 此過程受變異鏈球菌表面蛋白抗原AgI / II(或稱PAc )的調(diào)節(jié)2。第二階段是依靠于蔗糖和變異鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTFs)和葡聚糖結(jié)合蛋白(GBPs)存在的聚集階段。在葡聚糖被水解為葡萄糖和果糖后,GTFs合成a-1, 3和a-1, 6葡聚糖。第三階段, 多價(jià)的葡聚糖與變異鏈球菌表面的GBPs和GTFs中的葡聚糖結(jié)合區(qū)相互作用, 細(xì)菌的大量聚集導(dǎo)致菌斑的形成, 在

4、糖基質(zhì)存在時(shí), 產(chǎn)生大量的乳酸, 引起釉質(zhì)脫礦, 齲損形成。二主動(dòng)免疫防齲主動(dòng)免疫防齲是以人工接種的方法給機(jī)體輸入致病的特異性抗原，激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生與之相對(duì)應(yīng)的特異性抗體，中和致齲菌的毒性因子。用于主動(dòng)免疫的預(yù)防生物制品稱為防齲疫苗，傳統(tǒng)的防齲疫苗主要是全菌疫苗和亞單位疫苗。由于全菌疫苗誘導(dǎo)的抗體可與心內(nèi)膜發(fā)生交叉反應(yīng)，未被采用。純化的亞單位疫苗雖不會(huì)引起心臟交叉反應(yīng)，并可抑制致齲菌的粘附、定植3，但其免疫原性較弱，需皮下、鼻內(nèi)等多種途徑聯(lián)合免疫才能激發(fā)有效的免疫應(yīng)答。近年來，已研究出新型防齲疫苗，主要包括基因工程重組疫苗、合成多肽疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗和DNA 疫苗。1全菌疫苗：早期的

5、防齲疫苗研究，主要是利用變鏈菌全細(xì)胞制備滅活死疫苗和減毒活疫苗。通過對(duì)大鼠、猴等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫研究發(fā)現(xiàn)，免疫后的動(dòng)物唾液和血清中抗變鏈菌抗體水平明顯升高，能有效地抑制變鏈菌在牙面的聚集，降低齲病的發(fā)生率。這一時(shí)期的研究充分表明，利用變鏈菌全細(xì)胞多價(jià)疫苗可防止齲病的發(fā)生。但進(jìn)一步研究顯示，與其他鏈球菌相似，變鏈菌某些抗原或成分可誘發(fā)與人心臟組織發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體。2純抗原亞單位疫苗：80年代開始，隨著對(duì)變鏈菌細(xì)胞壁各種抗原性多聚物的逐漸認(rèn)識(shí)，免疫防齲轉(zhuǎn)入以變鏈菌單一抗原成分制備亞單位防齲疫苗的研究。研究的焦點(diǎn)集中于兩種候選疫苗，即變鏈菌主要表面蛋白抗原（pAc或Ag、pl、SpaA等）和葡糖基轉(zhuǎn)

6、移酶（gTase），它們?cè)诮閷?dǎo)變鏈菌對(duì)牙面的粘附和定殖過程中起著重要作用。近10年的大量研究證實(shí)，用pAc和gTase主動(dòng)免疫能明顯抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和自愿受試者牙面變鏈菌的粘附和齲病發(fā)生率，且純化的抗原不會(huì)介導(dǎo)心臟交叉反應(yīng)。但研究者發(fā)現(xiàn)，由于純抗原免疫原性較弱，單一免疫常難以同時(shí)激發(fā)有效的系統(tǒng)和局部免疫反應(yīng)。因此，學(xué)者們嘗試了經(jīng)口服、鼻內(nèi)注射、皮下注射和腹腔注射等多種途徑并加以佐劑進(jìn)行免疫。盧志山等構(gòu)建了含變形鏈球菌表面蛋白抗原唾液結(jié)合區(qū)(saliva·binding region，SBR)基因的重組原核表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌后提取純化SBR蛋白，通過頜下腺注射途徑免疫小鼠后證實(shí)能夠

7、誘導(dǎo)血清和唾液中特異性抗SBR IgG抗體及唾液中特異性抗SBR IgA抗體。吳補(bǔ)領(lǐng)等,純化了變形鏈球菌葡聚糖結(jié)合蛋白A(slueanbinding protein A，GbpA)的葡聚糖結(jié)合區(qū)(slueanbinding domain，GBD)，經(jīng)皮下免疫大鼠，可顯著提高特異性血清IsG和唾液IgX的水平，證明變形鏈球菌GbpA的GBD具有免疫原性。43. 基因工程重組疫苗基因工程重組疫苗是利用基因重組技術(shù)，將PAc、SpaA、GTF 等毒性因子的編碼基因片段與質(zhì)粒載體重組后，置入細(xì)菌、酵母等受體細(xì)胞，使之?dāng)y帶和表達(dá)特異性蛋白抗原。常用的載體菌有減毒鼠傷寒沙門菌和乳鏈球菌。胡曉莉等5用攜帶變

8、異鏈球菌表面抗原蛋白基因片段的重組減毒傷寒沙門菌經(jīng)口服、皮下、黏膜下等途徑免疫定菌鼠，可在鼠血清及唾液中檢測(cè)到抗PAc 抗體，提示重組減毒傷寒沙門菌可誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。為了增強(qiáng)免疫應(yīng)答，可以設(shè)計(jì)融合多個(gè)表位的基因工程重組疫苗，如融合變異鏈球菌PAc 的唾液結(jié)合區(qū)和GTF 的催化活性區(qū)。李富祥等6將PAc 基因的A 區(qū)和P 區(qū)融合制備AP 重組蛋白(rsAP) ，再經(jīng)過腸激酶切除質(zhì)粒融合標(biāo)簽和經(jīng)鎳親和層析純化后，得到rsAP 目的蛋白，結(jié)果顯示，純化的rsAP 目的蛋白具有較好的抗原性，可與MT8148 抗體血清和rsAP抗體血清發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)。4.合成多肽疫苗自90代年以來，隨著免疫學(xué)

9、、分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，從分子水平對(duì)變鏈菌PAc和gTase的認(rèn)識(shí)逐步深入。目前，編碼這兩種抗原的基因PAc和GTF已被克隆，核苷酸序列已基本清楚。用PAc和gTase分子中與某特定功能相關(guān)并具有免疫原性的核酸序列制備多肽防齲疫苗，已成為免疫防齲研究的熱門。目前研究證實(shí)，PAc分子的N末端唾液結(jié)合區(qū)（SBR）、粘附功能區(qū)（8161213位殘基）、A區(qū)的T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原決定簇等；gTase分子的氨基末端的酶促區(qū)（CAT）、羧基末端的葡聚糖結(jié)合區(qū)（GLU）和高度保守的酶活性片段（GGY和AND）等是理想的候選多肽。 由于多肽疫苗僅為病原體的單一保護(hù)性抗原或某一抗原決定簇，

10、單純以游離的多肽免疫動(dòng)物，常不能產(chǎn)生理想的免疫效果，也需將其結(jié)合至大分子載體上以增強(qiáng)其免疫原性。將 PAcSBR與CT-B嵌合并以CT為佐劑，經(jīng)鼻內(nèi)免疫大鼠，可激發(fā)高水平的唾液抗 PAcIgA抗體，并導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物齲活性下降。以SBR與CTA2/b嵌合口服免疫小鼠，也能激發(fā)高水平的特異性唾液sIgA和血清IgG抗體。另外大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素b亞單位（lT-B）也被證實(shí)能增加連接的SpaA多肽的免疫原性和生物學(xué)活性。 另外，改變多肽結(jié)構(gòu)也是增強(qiáng)其免疫原性的有效手段。Senpuku等（1996）發(fā)現(xiàn)將PAc分子的兩個(gè)肽段聯(lián)接后免疫動(dòng)物，比分別用單一肽段免疫所激發(fā)的抗體

11、rPAc抗體明顯升高。因此認(rèn)為，將多肽偶聯(lián)成束能顯著增強(qiáng)其免疫原性。Smith等（1997）將GTF酶活性片段GGY和AND以賴氨酸為核心分別構(gòu)建有8條支鏈結(jié)構(gòu)的多肽疫苗，經(jīng)唾液腺周圍免疫大鼠，結(jié)果顯示，將抗原決定簇設(shè)計(jì)成這種結(jié)構(gòu)具有高度的免疫原性，能誘導(dǎo)高水平的特異性唾液IgA抗體，并使動(dòng)物齲齒發(fā)生率顯著降低。合成肽疫苗是根據(jù)毒性因子基因的核酸序列人工合成多肽抗原，再配以合適的佐劑或載體制成的疫苗。有報(bào)道，人工合成的變異鏈球菌GTF 第549 567 位多肽序列HDS 能刺激實(shí)驗(yàn)鼠產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，減少齲病發(fā)生。Culshaw 等7合成了20 個(gè)變異鏈球菌GTF 的20 位多肽序列片段，其

12、中17 位具有較高的MHC分子結(jié)合活性、3 位具有GTF 酶活性，免疫實(shí)驗(yàn)鼠顯示，MAP11 ( 第847 866位多肽序列) 能誘導(dǎo)強(qiáng)大的免疫應(yīng)答，抑制GTF 的功能，可顯著降低齲病的程度。劉建偉和凌均綮8以PAe多肽(301319)作為抗原，以聚谷氨酸芐酯一聚乙二醇一聚谷氨酸芐酯包裹抗原制備防齲微球疫苗，經(jīng)I=I服免疫SD大鼠，發(fā)現(xiàn)PAc多肽抗原微球疫苗口服組的變形鏈球茵數(shù)及磨牙齲齒Keyes計(jì)分均顯著低于對(duì)照組，尤以光滑面齲的減少更為顯著。宋長(zhǎng)征等用化學(xué)方法合成含有GTF催化和GBD的27個(gè)氨基酸殘基的肽段，并與佐劑偶聯(lián)制成疫苗免疫小鼠。結(jié)果證明融合多肽疫苗可有效誘導(dǎo)小鼠抗體的產(chǎn)生，其免

13、疫血清不僅可以拮抗GTF的酶活性，而且可以明顯抑制變形鏈球菌的黏附。5. DNA 疫苗DNA疫苗（是指將編碼某種蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達(dá)載體直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。該疫苗既具有減毒疫苗的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)又無逆轉(zhuǎn)的危險(xiǎn)，因此越來越受到人們的重視，被看作是繼傳統(tǒng)疫苗及基因工程亞單位疫苗之后的第三代疫苗9。DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是編碼免疫原或與免疫原相關(guān)的真核表達(dá)質(zhì)粒DNA（有時(shí)也可是RNA），它可經(jīng)一定途徑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，被宿主細(xì)胞攝取后轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性和特異性2

14、種免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而起到免疫保護(hù)作用。較早的DNA 疫苗有針對(duì)變異鏈球菌PAc 蛋白A 區(qū)和P 區(qū)的防齲DNA 疫苗pCIAP，以及同時(shí)針對(duì)變異鏈球菌PAc 蛋白A 區(qū)、P 區(qū)和GTF 蛋白GLU 區(qū)的融合防齲DNA 疫苗pGLUAP，經(jīng)免疫定菌鼠后，均可誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)，抑制齲病的發(fā)生和發(fā)展，且pGLUAP 防齲效果優(yōu)于pCIAP10。之后樊明文等11又研制出能把抗原靶向引導(dǎo)至樹突狀細(xì)胞的靶向防齲DNA 疫苗pGJAP和臨床研究用靶向防齲DNA 疫苗pGJAP/VAX，并證實(shí)了pGJAP 在動(dòng)物體內(nèi)能正確表達(dá)，并且pGJAP較pGLUAP能誘導(dǎo)更強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，防齲效果更好。蘇凌云12等

15、用變形鏈球茵GbpA的GBD真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA31-GBD經(jīng)頜下腺周圍皮下注射免疫sD大鼠，觀察誘導(dǎo)的血清和唾液特異性抗體反應(yīng)，并采用齲齒動(dòng)物模型評(píng)價(jià)疫苗的防齲保護(hù)作用，結(jié)果表明相對(duì)于空白對(duì)照組，疫苗免疫組的血清中特異性IgG及唾液中特異性IgA明顯升高，實(shí)驗(yàn)組齲齒計(jì)分明顯低于對(duì)照組。邢泉等建編碼小鼠細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen 4, CTLA4)胞外區(qū)、人IgG1鉸鏈區(qū)與Fc段、變形鏈球菌(Streptococcus mutans) PAc區(qū)和GLU區(qū)的靶向防齲質(zhì)粒(pmGJA-P),構(gòu)建編碼人CD5分子引導(dǎo)序列、人IgGl鉸鏈區(qū)

16、與Fc段、PAc區(qū)和GLU區(qū)的非靶向防齲質(zhì)粒做為對(duì)照(pCDA-P).然后,將BALB/c小鼠分成三組,每組20只,分別經(jīng)過鼻腔滴注途徑給予靶向防齲疫苗(給予pmGJA-P鼻腔滴注),非靶向防齲疫苗(給予pCDA-P滴注)和空質(zhì)粒組(給予PCI滴注,陰性對(duì)照組)。結(jié)果顯示,靶向防齲疫苗可能通過提高抗原呈遞的效果,促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟,并由此提高DCs對(duì)抗原的攝取和提呈能力,促進(jìn)DCs的生存,進(jìn)而加強(qiáng)DCs對(duì)T、B細(xì)胞的激活,加強(qiáng)粘膜免疫。13三被動(dòng)免疫被動(dòng)免疫是直接向機(jī)體輸入外源性特異抗體，中和致齲菌的毒性因子，使機(jī)體免受致齲菌影響的方法。被動(dòng)免疫的抗體主要包括抗齲齒單抗( 單克隆抗體) 、抗齲

17、齒血清抗體、抗齲齒牛奶抗體、抗齲齒雞蛋黃抗體、轉(zhuǎn)基因植物抗體等。1.抗齲齒單抗是將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)變異鏈球菌某單一抗原免疫后的小鼠脾細(xì)胞融合，融合后的雜交瘤細(xì)胞可無限增殖傳代，并不斷產(chǎn)生抗齲齒單抗。有學(xué)者曾將抗變異鏈球菌表面抗原AgI /II 單抗用于人體試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)抗AgI/II單抗可以在一段時(shí)間內(nèi)有效減少或消除變異鏈球菌在牙面的定植。Rebekah 等(2011)14發(fā)現(xiàn)，抗AgI/II 單抗( MAb Guys13) 除對(duì)細(xì)菌本身作用外，可能還具有免疫調(diào)節(jié)作用，可改變適應(yīng)性免疫應(yīng)答的特異性、亞型和功能活動(dòng)。2.抗齲齒血清抗體血清中含有IgG 等免疫球蛋白，用變異鏈球菌或遠(yuǎn)緣鏈球菌的抗原成

18、分免疫動(dòng)物( 牛、兔等) ，能使動(dòng)物血清中產(chǎn)生IgG 抗體，可將其用于特異性致齲菌的被動(dòng)免疫。3.抗齲齒牛奶抗體牛乳中含有免疫球蛋白IgG、IgM、IgA，可針對(duì)多種致病菌產(chǎn)生被動(dòng)免疫9。用變異鏈球菌或遠(yuǎn)緣鏈球菌的抗原成分免疫牛，即可使牛乳中產(chǎn)生IgG 等抗體，可用于特異性致齲菌的被動(dòng)免疫。有報(bào)道，用變異鏈球菌PAc 的A 區(qū)和GTF 的GLU 區(qū)的融合蛋白多次免疫乳牛，可提高乳汁中的抗體滴度，將其用于人體，能抑制變異鏈球菌的定植。4.轉(zhuǎn)基因植物抗體運(yùn)用基因工程技術(shù)將特異性抗體分子導(dǎo)入植物細(xì)胞基因組中，讓轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生所需抗體，用于局部被動(dòng)免疫。植物抗體可為具有抗原結(jié)合活性的抗體小片段，也可是

19、較大的多聚抗體復(fù)合物。Ma 等( 1995)15把抗變異鏈球菌表面抗原的抗體基因?qū)霟煵?，從轉(zhuǎn)基因煙草中得到可引起細(xì)菌聚集的雜交IgAG 分子。之后，Conrad 等16將IgAG 用于志愿者，初步證明了轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)的特異性IgAG 分子可預(yù)防齲病。遵義醫(yī)學(xué)院田源等在獲得含目的基因pacA-ctxB, pacP-ctxB的轉(zhuǎn)基因番茄第三代種子的基礎(chǔ)上,應(yīng)用PCR、Western blot、ELISA技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行鑒定及目的蛋白濃度測(cè)定,進(jìn)一步對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行口服免疫實(shí)驗(yàn),初步探索表達(dá)PAcA/CTB、PAcP/CTB嵌合蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄免疫大白兔的免疫效果。表達(dá)外源目的蛋白的轉(zhuǎn)基因番

20、茄免疫新西蘭大白兔后,能有效的誘導(dǎo)動(dòng)物唾液和血液中特異性抗變異鏈球菌表面蛋白PAcA、PAcP抗體的產(chǎn)生,轉(zhuǎn)基因番茄表達(dá)的嵌合蛋白PAcA/CTB、PAcP/CTB具有較好的免疫原性。 17四，問題與展望雖然氟的推廣使用在20世紀(jì)7080年代很大程度上降低了美國(guó)等工業(yè)化國(guó)家的齲病流行情況，但至今齲病仍是最為常見的口腔疾患并且影響著60% 90%的學(xué)齡兒童和大多數(shù)的成年人，在一些發(fā)展中國(guó)家齲病發(fā)病甚至呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。齲病的預(yù)防需要綜合多種措施，更需要補(bǔ)充新的技術(shù)方法。防齲疫苗歷經(jīng)半個(gè)世紀(jì)的探索追尋、推陳出新，經(jīng)大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和幾次小規(guī)模的臨床研究反復(fù)驗(yàn)證，證明是一種安全有效的防齲方法。但任何疫苗在

21、正式應(yīng)用于人體之前都必須經(jīng)歷I、II、III期臨床研究證實(shí)其在人體的安全性和有效性，而防齲疫苗還缺乏大規(guī)模的臨床研究資料。另外，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)優(yōu)異的黏膜佐劑和投遞系統(tǒng)也需要在臨床研究中得到驗(yàn)證。預(yù)期防齲蛋白疫苗因其高度的安全性可能最早取得突破，有望成為其他防齲措施的有力補(bǔ)充。18參考文獻(xiàn):1 韓慧,張向宇；變異鏈球菌表面蛋白P1中A區(qū)和P區(qū)的研究進(jìn)展, 牙體牙髓牙周病學(xué)雜志 , 2011,21(2),106-109.2 陳筑，劉建國(guó)等，變異鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶植物表達(dá)質(zhì)粒p2355-gtfB的構(gòu)建. 廣東牙病防治,2012,20(9),473-4783 Childers NK，Zhang SS

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