東南大學(xué)1265 分子生物學(xué)

1、基因是DNA 或 RNA 分子中有特定遺傳功能的一段序列。 是能夠表達(dá)和產(chǎn)生基因產(chǎn)物（蛋白質(zhì)或RNA）的核苷酸序列。其內(nèi)容可擴(kuò)展至包括兩側(cè)對基因表達(dá)的起始和終止所必需的調(diào)控序列。順式作用元件:(cis-acting element)是能影響基因表達(dá)，但不編碼RNA和 蛋白質(zhì)的DNA序列。包括啟動子和上游啟動子元件、反應(yīng)元件、增強(qiáng)子Poly(A)、加尾信號 反式作用因子 (trans-acting factor)指能直接或間接地識別或結(jié)合在各類順式作用元件核心序列上參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的蛋白質(zhì)。啟動子（promoter）是RNA聚合酶特異性識別結(jié)合和啟動轉(zhuǎn)錄的DNA序列。有方向性，位于轉(zhuǎn)錄起始

2、位點(diǎn)上游。增強(qiáng)子（enhancer）能與反式作用因子結(jié)合，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，在基因任意位置都有效、無方向性。C 值是一種生物單倍體基因組 DNA 的總量。 真核細(xì)胞基因組的最大特點(diǎn)是它含有大量的重復(fù)序列，而且功能 DNA 序列大多被不編碼蛋白的 DNA 所隔開。這就是 C 值反?，F(xiàn)象。DNA 的轉(zhuǎn)座是由可移位因子介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。根據(jù)轉(zhuǎn)座作用機(jī)制的不同，可分為復(fù)制性轉(zhuǎn)座和非復(fù)制性轉(zhuǎn)座。 端粒酶是一種核糖核酸蛋白酶，由 RNA 和蛋白質(zhì)構(gòu)成，具逆轉(zhuǎn)錄活性，能夠以自身的RNA 為模版，通過多次互補(bǔ)配對，延長染色體端粒 3末端。轉(zhuǎn)座成分（transposable elements）又稱移動基因（m

3、ovable genes），或稱為跳躍基因（jumping genes）。指一些可以在染色體基因組上從一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置，甚至在不同染色體之間躍遷的 DNA 成分。轉(zhuǎn)座是在轉(zhuǎn)座酶的作用下，轉(zhuǎn)座因子或是直接從原來位置上切離下來，然后插入新的位置，或是染色體上的 DNA 序列轉(zhuǎn)錄成 RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，再插入染色體上新的位置。 端粒的功能人體細(xì)胞端粒長度約為 515 Kb，其功能在于保護(hù)染色體免受核酶降解，防止斷端、融合、重排或降解。 如果端粒長度縮短到極限如4 Kb以下時，細(xì)胞則會喪失分裂增殖能力而發(fā)生凋亡。端?？s短被認(rèn)為是正常細(xì)胞分裂與老化的分子信號，端粒被稱為細(xì)胞壽命的“分

4、裂鐘”。端粒酶是依賴RNA的 DNA聚合酶，實(shí)質(zhì)是一種逆轉(zhuǎn)錄酶。 能識別特定的端粒重復(fù)序列，以自身 RNA的部分序列(5-CUAACCCUAAC-3)為模板，合成新的端粒重復(fù)序列，使端粒延長，保持染色體的完整。 原核生物基因表達(dá)調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平，其次是翻譯水平。原核生物基因表達(dá)調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平，即對RNA合成的調(diào)控。通常有兩種方式： (1) 起始調(diào)控，即啟動子調(diào)控，(2) 終止調(diào)控(衰減子調(diào)控) 轉(zhuǎn)錄的選擇性：在細(xì)胞周期的某個階段，或不同類型的細(xì)胞中，某些特定的基因被轉(zhuǎn)錄，而多數(shù)其它基因處于封閉狀態(tài)，即轉(zhuǎn)錄有時間和空間上的嚴(yán)格調(diào)控。 核酸的凝膠電泳指按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，分

5、為瓊脂糖(agarose)凝膠和聚丙烯酰胺(polyacrylamide) 凝膠，是分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段。 印跡技術(shù)是 利用各種物理方法使電泳中的生物大分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane, NC)等各種膜上，使之成為固相化分子。Southern 印跡雜交 (Southern blotting) 是將電泳分離的待測 DNA片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交的過程。用于DNA定性、定量分析。 PCR 技術(shù)是體外快速擴(kuò)增特定基因或 DNA 序列最常用的方法。 整個反應(yīng)包括 DN

6、A解鏈 （變性）、引物與模板結(jié)合（退火）、DNA合成（延伸）三步，此三步可以被不斷重復(fù)。經(jīng)多次循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈 DNA 分子數(shù)，理論上的最高值應(yīng)是 2n。 SNP（單核苷酸多態(tài)性） 指基因組 DNA 序列中由于單個核苷酸（A，T，C 和 G）的突變而引起的多態(tài)性。 基因敲除（gene knock-out）又稱基因打靶，通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，具有專一性強(qiáng)、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。完全基因敲除 指通過同源重組法完全消除細(xì)胞或者動物個體中的靶基因活性。 條件型基因敲除 指通過定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特定時間和空間的基因

7、敲除?；蚯贸饬x 研究基因功能 轉(zhuǎn)基因動物的制備 用于藥物篩選的動物模型 轉(zhuǎn)基因動物可作為“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)藥物基因工程載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，以便確保重組體穩(wěn)定傳代?？寺≠|(zhì)粒載體特點(diǎn)分子量相對較小，能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)。 具有一個以上的遺傳標(biāo)志，便于對宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇，如抗生素抗性基因，-半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。 具有多個限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)，便于外源基因的插入。穿梭質(zhì)粒載體（ shuttle

8、 plasmid vector ）指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號，因而可在兩種不同的寄主細(xì)胞存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體限制性內(nèi)切酶是識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。 限制性核酸內(nèi)切酶的來源：細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)。 病毒DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后會被降解，而宿主自身的DNA卻不發(fā)生改變，這就是限制-修飾現(xiàn)象。 主要原因是宿主體內(nèi)存在甲基化酶，該酶可特異的修飾宿主自身的DNA，防止被降解；而病毒DNA則不被修飾。影響限制酶活性的因素1）“星”活性2）甲基化3）底物性狀4）試劑 同裂酶 又稱為異源同工酶。指來源不同，但識別和切割同樣的核苷酸序列的限制性酶。 限制性內(nèi)切酶的識別序列

9、不完全相同，但切割DNA后產(chǎn)生相同的粘性末端，稱同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatible end)?；蚨鄳B(tài)性可表現(xiàn)為藥物代謝酶的多態(tài)性，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體(影響藥物的吸收、分布和排泄)的多態(tài)性以及藥物作用受體或靶點(diǎn)(如-腎上腺素能受體)的多態(tài)性。這些多態(tài)性導(dǎo)致了許多藥物療效和不良反應(yīng)的個體間差異。細(xì)胞色素P450酶系(cytochrome p450, CYP450)由一群基因超家族編碼的酶蛋白組成。它參與臨床上90%以上的藥物代謝，P450基因多態(tài)性是造成不同個體藥物代謝差異的基礎(chǔ)。涉及體內(nèi)大多數(shù)藥物代謝的CYP主要有3個基因家族CYP1、CYP2、CYP3。 影響目的基因與載

10、體之間連接效率的因素DNA片段間的連接方式目的基因與載體DNA的濃度比例連接溫度與時間其他因素：連接酶純度、反應(yīng)緩沖體系等 影響細(xì)菌轉(zhuǎn)化頻率的因素 轉(zhuǎn)化DNA的濃度、純度和構(gòu)型轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生理狀態(tài)經(jīng)CaCl2 處理后的成活率轉(zhuǎn)化環(huán)境：溫度MgCl2轉(zhuǎn)化：Mg+對于維持DNA穩(wěn)定性方面，可能起到重要的作用。提高外源基因表達(dá)水平的措施1提高翻譯水平調(diào)整SD序列與ATG之間的距離 用點(diǎn)突變的方法改變某些堿基增加mRNA的穩(wěn)定性 2 使細(xì)菌的生長與外源基因的表達(dá)分開 將宿主菌的生長和外源基因的表達(dá)分成兩個階段，是減輕宿主細(xì)胞代謝負(fù)荷最常用的一個方法。一般采用溫度誘導(dǎo)或藥物誘導(dǎo)。 3 提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性

11、 表達(dá)融合蛋白 采用某種突變菌株 表達(dá)分泌蛋白 真核基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1每一種真核生物都有一定的染色體數(shù)目；2. 遠(yuǎn)大于原核基因組，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，基因數(shù)龐大；3. 真核生物基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子；4. 有大量重復(fù)序列;5. 真核基因?yàn)閿嗔鸦?6. 非編碼序列多于編碼序列;7. 功能相關(guān)基因構(gòu)成各種基因家族。運(yùn)用藥物基因組學(xué)和遺傳藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)和開發(fā)創(chuàng)新藥物的優(yōu)勢。 識別疾病和途徑基因的遺傳藥理學(xué)標(biāo)識物，針對性地選擇作用靶點(diǎn) 選擇更好的藥物候選物（早期確定候選物是否高度受基因多態(tài)性的影響，因而可減少因效應(yīng)差異而帶來的風(fēng)險） 避免高多態(tài)性藥物靶點(diǎn) 確定藥物在人體內(nèi)的代謝途徑 開發(fā)藥代動力學(xué)最穩(wěn)定的化合物

12、識別由遺傳變異引起的代謝和反應(yīng)異常 避免開發(fā)安全范圍小而又與遺傳變異密切相關(guān)的藥物 開發(fā)對遺傳變異人群有針對性作用的藥物 最大限度減少藥物相互作用（藥代酶相同底物、誘導(dǎo)和抑制）簡述真核與原核細(xì)胞中翻譯起始的主要區(qū)別。 原核細(xì)胞與真核細(xì)胞翻譯起始的主要區(qū)別是來自 mRNA 的本質(zhì)差異以及小亞基與 mRNA 起始密碼子上游區(qū)結(jié)合的能力。原核細(xì)胞 mRNA 較不穩(wěn)定，而且是多順反子，在 IF-3 介導(dǎo)下。通過16S rRNA 的3末端在核糖體結(jié)合位點(diǎn)與小亞基直接結(jié)合后，原核細(xì)胞翻譯起始復(fù)合物就裝配起來了。 而在真核細(xì)胞中， 需要幾種起始因子（eIF-4，4A，4B）幫助 mRNA 啟動，起始復(fù)合物（

13、SIC，40S 亞基，eIF-2，GTP，Met，tRNA）才能結(jié)合（在eIF-4 和eIF-3 因子的促使下）到 mRNA 帽上。一旦結(jié)合，SIC 開始向 mRNA 下游區(qū)搜索，直到找到第一個 AUG 密碼子。簡述端粒酶的作用機(jī)理和功能。 答：端粒酶是一種核糖核酸蛋白酶，由 RNA 和蛋白質(zhì)構(gòu)成，具逆轉(zhuǎn)錄活性，能夠以自身的結(jié)構(gòu) RNA 為模版，通過多次互補(bǔ)配對，延長端粒 3末端。之后合成引物，使 5端也得到延長。 功能：由于在復(fù)制過程中存在末端丟失，通過端粒酶的作用保護(hù)了染色體末端，同時使得端粒的得到延伸，防止端粒過短影響復(fù)制。DNA 修復(fù)的主要機(jī)制有哪些 答：DNA 修復(fù)主要機(jī)制有 7種：

14、 正讀碼機(jī)制，依靠 DNA聚合酶切除錯誤核苷酸，替換正確核苷酸； 錯配修復(fù)系統(tǒng)，依靠 mut 基因編碼的蛋白，特異性識別切除包含錯誤核苷酸的一段多核苷酸鏈，再由 DNA 聚合酶重新合成； 光復(fù)活作用，通過修復(fù)酶（光裂化酶）直接逆轉(zhuǎn)紫外輻射造成的嘧啶二聚體結(jié)構(gòu)； 堿基切補(bǔ)修復(fù)，糖基化酶將堿基移除，而后由核苷酸內(nèi)切酶進(jìn)行補(bǔ)切修復(fù)； 核苷酸切補(bǔ)修復(fù)，將受損傷的一段核苷酸切除，合成新的核苷酸替換錯誤片段； 重組修復(fù)，通過從受損 DNA找回序列信息來修復(fù) DNA斷裂，當(dāng) DNA兩條鏈都受損時采用這種方式； SOS 應(yīng)答，當(dāng) DNA 受到放射損傷或其它較大損傷時，形成特化的 DNA 聚合酶催化，此酶越過損傷部位直接合成 DNA闡述乳糖操縱子的組成及其調(diào)控機(jī)制。 乳糖操縱子由調(diào)控基因 lacI 、操縱基因和三個結(jié)構(gòu)基因 lac Z、lacY、lacA組成。lacZ 編碼-半乳糖苷酶，它可以切斷乳糖的半乳糖苷鍵，而產(chǎn)生半乳糖和葡萄糖。lacY編碼-半乳糖苷透性酶，它構(gòu)成轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，將半乳糖苷運(yùn)入到細(xì)胞中。lacA 編碼-半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，其功能只將乙酰-輔酶 A上的乙?；D(zhuǎn)移到-半乳糖苷上。 Lac 操縱子的調(diào)控分為正調(diào)控和負(fù)調(diào)控兩種。lacZ、Y、A 基因的轉(zhuǎn)錄是由 lacI 基因指令合成的阻遏蛋白和 cAMP 與其結(jié)合蛋白 CAP 所控制的。機(jī)體內(nèi)沒有乳糖時，l