Allprep RNADNAmiRNAprotein分提試劑盒操作方法及步驟說明書

1、 TRIpure Reagent 抽提指南 目錄號(hào) RP02 使用手冊(cè) 實(shí)驗(yàn)室使用，僅用于體外 TRIpure Reagent 抽提指南 目錄號(hào) RP02 使用手冊(cè) 實(shí)驗(yàn)室使用，僅用于體外 TRIpure Reagent 抽提指南 目錄號(hào) RP02 使用手冊(cè) 實(shí)驗(yàn)室使用，僅用于體外Allprep組織/細(xì)胞miRNA/RNA/DNA/Protein分提試劑盒目錄號(hào)：RN47v 適用范圍：適用于快速從同一個(gè)動(dòng)物細(xì)胞或者組織樣品中同時(shí)提取分離基因組DNA和包含miRNA的總RNA和Protein(如購買額外miRNA吸附柱子和配套溶液，還可以將同一個(gè)樣品的總RNA和miRNA分離并提取，富集miRN

2、A。），不需要使用DNase消化，RNA可直接用于反轉(zhuǎn)錄PCR，熒光定量PCR.。v 試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性：試劑盒組成保存50次(RN4701) 裂解液RLT Plus室溫50 ml Wash Solution 1室溫12 ml第一次使用前加入28ml無水乙醇Wash Solution 2/3室溫10 ml第一次使用前加入42ml無水乙醇RNase-free H2O室溫10 ml 抑制物去除液IR室溫25 ml 漂洗液WB室溫15ml第一次使用前按說明加指定量乙醇緩沖液APP室溫60 ml 洗脫緩沖液EB室溫10 ml 基因組DNA吸附柱DA和收集管室溫50套 RNA吸附柱RA和收集管室溫

3、50套 本試劑盒在室溫儲(chǔ)存12個(gè)月不影響使用效果。儲(chǔ)存事項(xiàng)：1. 所有的溶液應(yīng)該是澄清的，如果環(huán)境溫度低時(shí)溶液可能形成沉淀，此時(shí)不應(yīng)該直接使用，可在37水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。2. 不合適的儲(chǔ)存于低溫（4或者20）會(huì)造成溶液沉淀，影響使用效果，因此運(yùn)輸和儲(chǔ)存均在室溫下（1525）進(jìn)行。3. 避免試劑長時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、PH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。v 注意事項(xiàng)1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000 rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。2. 樣品處理量絕對(duì)不要超過基因組吸附柱DA和和RNA吸附柱RA處理能

4、力，否則造成DNA殘留或者產(chǎn)量降低。不同組織細(xì)胞種類RNA/DNA相差極大，例如胸腺脾臟DNA含量豐富，超過5mg就會(huì)超過柱子處理能力。COS細(xì)胞RNA含量豐富，超過3x106細(xì)胞就會(huì)超過柱子吸附能力。所以開始摸索實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時(shí)寧可使用較少的樣品處理量，如細(xì)胞不超過3-4x106，組織不超過10mg。將來根據(jù)樣品試驗(yàn)情況增加或者減少處理量。3. 裂解液RLT Plus 、抑制物去除液IR、Wash solution 1、Wash solution 2/3中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水

5、沖洗。4. 該試劑盒如需要用于植物樣品尤其是多糖多酚次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富的困難樣品的DNA/miRNA/RNA提取，請(qǐng)咨詢技術(shù)人員，可能需要用到其它試劑。5. 如購買額外miRNA吸附柱子和配套溶液，還可以將同一個(gè)樣品的總RNA和miRNA分離并提取，富集miRNA。請(qǐng)咨詢我們。6. 關(guān)于DNA 的微量殘留：一般說來任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留（DNase消化也無法做到100%無殘留），本公司的Allprep組織/細(xì)胞miRNA/DNA/Protein分提試劑盒，由于采取了本公司獨(dú)特的緩沖體系和基因組DNA分離清除技術(shù)，絕大多數(shù)DNA已經(jīng)被清除，不需要DNase消化

6、，可直接用于反轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量PCR。個(gè)別特殊情況如DNA含量過于豐富造成殘留或者要進(jìn)行嚴(yán)格的mRNA表達(dá)量分析熒光定量PCR，我們建議在進(jìn)行模板和引物的選擇時(shí)：1) 選用跨內(nèi)含子的引物,以穿過mRNA中的連接區(qū),這樣DNA就不能作為模板參與擴(kuò)增反應(yīng)。2) 選擇基因組DNA和cDNA上擴(kuò)增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對(duì)。v 操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）提示：ð 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液RW瓶、漂洗液WB和70%乙醇瓶中加入指定量無水乙醇!1. 組織培養(yǎng)細(xì)胞a. 收集<107懸浮細(xì)胞到一個(gè)1.5ml離心管，對(duì)于貼壁細(xì)胞，孔板培養(yǎng)可以直接裂解，細(xì)胞瓶培養(yǎng)應(yīng)該先用胰蛋白酶消化后

7、吹打下來收集。b. 13，000rpm離心10秒（或者300xg離心5分鐘），使細(xì)胞沉淀下來。完全吸棄上清，留下細(xì)胞團(tuán)，注意不完全棄上清會(huì)稀釋裂解液導(dǎo)致產(chǎn)量純度降低。c. 輕彈管壁將細(xì)胞沉淀完全松散重懸，加350l（<5x106細(xì)胞）或600l（5x106-1x107細(xì)胞）裂解液RLT Plus，吹打混勻后用手劇烈振蕩20秒充分裂解。d. 勻漿：（處理細(xì)胞量極少時(shí)<1x105一般不需要，渦旋振蕩一分鐘勻漿）。用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配0.9mm針頭) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到滿意勻漿結(jié)果(或者電動(dòng)勻漿30秒) ，可以剪切DNA，降低粘稠度防堵塞柱子和提高產(chǎn)量。

8、e. 將裂解混合物或勻漿混合物全部加到DNA吸附柱上（吸附柱放在收集管內(nèi)）。f. 接操作步驟項(xiàng)下3。2. 動(dòng)物組織（例如鼠肝腦）a. 電動(dòng)勻漿：新鮮組織用解剖刀迅速切成小碎塊,加入350l(<20mg組織)或者600l(20-30mg組織)的裂解液RLT Plus 后電動(dòng)徹底勻漿20-40秒。b. 液氮研磨+勻漿：在液氮中研磨組織成細(xì)粉后，取適量組織細(xì)粉(20mg/30mg)轉(zhuǎn)入裝有350l/600l組織裂解液RLT Plus的1.5ml離心管中， 用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配0.9mm針頭) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到滿意勻漿結(jié)果(或者電動(dòng)勻

9、漿30秒) ，可以剪切DNA，降低粘稠度防堵塞柱子和提高產(chǎn)量。c. 將勻漿后裂解物13，000rpm離心3分鐘,沉淀可能存在的裂解困難的碎片或者不溶物，將裂解物上清全部加到DNA吸附柱上（吸附柱放在收集管內(nèi)）。d. 接操作步驟項(xiàng)下3。3. 13,000 rpm離心30秒，保留濾過液（miRNA/RNA/Protein在濾過液中）。DNA吸附柱子（膜上吸附有基因組DNA）短時(shí)間可存放4度備用。確保離心后液體全部濾過去，膜上沒有殘留，如有必要，可以加大離心力和離心時(shí)間。以下步驟為提取RNA步驟：4. 用微量移液器較精確估計(jì)濾過液體積（350l或者600l左右，濾過時(shí)候損失體積應(yīng)該減去），加入1.2

10、5倍體積的無水乙醇，此時(shí)可能出現(xiàn)沉淀,但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。5. 立刻將混合物(每次小于700l，多可以分兩次加入)加入一個(gè)RNA吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心30秒，保留濾過液以備提取Protein。濾過液含有Protein，請(qǐng)轉(zhuǎn)入一個(gè)合適大?。ㄖ辽?倍濾過液體積）的離心管，保留被用于步驟17開始的Protein提取。裝濾過液體和乙醇混合物的DNA吸附柱的收集管（混合物轉(zhuǎn)入RNA吸附柱后剩下的空收集管）需要保留，將DNA吸附柱放回此收集管保留在4，備用于步驟11開始的基因組DNA提取。6. 加700l Wash Solution 1（請(qǐng)先檢

11、查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。7. 加入500l Wash Solution 2/3（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500l Wash Solution 2/3，重復(fù)一遍。8. 將吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。9. 取出吸附柱RA，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50l RNase free water， 室溫放置1分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。10. 如得到的RNA可

12、以立即用于下游反應(yīng)或者盡快置于低溫保存。以下步驟為提取DNA步驟：11. 在步驟3的DNA吸附柱上加入500l抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。12. 加入700l漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。13. 加入500l漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。14. 將DNA吸附柱放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。15. 取出DNA吸附柱，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100l洗脫緩沖液EB （洗脫緩沖液事先在65-70水浴中預(yù)熱

13、效果更好）， 室溫放置3-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積， 但是最小體積不應(yīng)少于50l，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。16. DNA可以存放在2-8，如果要長時(shí)間存放，可以放置在20。以下步驟為提取Protein步驟：17. 將步驟5的濾過液中加入等體積的緩沖液APP，渦旋振蕩混勻，室溫放置15分鐘沉淀Protein。18. 13,000rpm離心5-10分鐘，小心棄上清。加入0.5ml 70%乙醇，顛倒后離心1分鐘，小心棄上清，留下蛋白沉淀，盡量將殘留液體用移液器吸干凈。19. 室溫晾干沉淀5-10分鐘，注意一定讓乙醇揮發(fā)干凈，以免下游試驗(yàn)受影響。20. 將蛋白沉淀溶解于30-150l 1x 蛋白上樣緩沖液（如需要蛋白定量，緩沖液中不應(yīng)該加入溴酚蘭）或其它下