08分生思考題大字

1、丁 一1. 乳糖操縱子 含有三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，半乳糖苷酶：催化乳糖分解為葡萄糖和半乳糖； 半乳糖苷透過(guò)酶：促進(jìn)乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)菌；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙?；福齻€(gè)基因的上游 只有一個(gè)共同的啟動(dòng)子Piac。此外，在啟動(dòng)子的下游和上游還分別有操縱序列Oiac和CAP結(jié)合位點(diǎn)，這三者共同構(gòu)成了乳糖操縱子的調(diào)控區(qū)，這一區(qū)域是控制結(jié)構(gòu)基因是否 轉(zhuǎn)錄的開(kāi)關(guān)在乳糖操縱子的上游還有一個(gè)調(diào)節(jié)基因I，其編碼產(chǎn)物是lac阻遏蛋白，在沒(méi)有誘導(dǎo)劑的情況下，阻遏蛋白可與操縱序列特異結(jié)合并阻止結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。 乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄起始是由CAP和阻遏蛋白兩種調(diào)控因子來(lái)控制。CAP起正調(diào)控作用。2. 真核基因組的特點(diǎn). DNA量大。. 真核

2、細(xì)胞的編碼基因大多是不連續(xù)的，由外顯子和內(nèi)含子鑲嵌排列而成。外顯子(exon)：為蛋白質(zhì)氨基酸編碼的DNA序列。內(nèi)含子(intron)：插入到編碼序列之間的非編碼序列。 內(nèi)含子功能: 含調(diào)控序列，參與基因表達(dá)。 不同的剪接，產(chǎn)生不同的產(chǎn)物。 提供變異機(jī)會(huì)，與進(jìn)化有關(guān)。. 真核生物DNA中含有大量重復(fù)序列。重復(fù)序列：在基因組中多次反復(fù)出現(xiàn)的DNA序列，按其出現(xiàn)的頻率可分為低度、中度(103-104)和高度(106)重復(fù)序列，出現(xiàn)原因：基因的多拷貝。與染色質(zhì)的構(gòu)像、著絲點(diǎn)形成有關(guān)。參與表達(dá)調(diào)控，染色質(zhì)DNA的“區(qū)間性”。. 不存在操縱子結(jié)構(gòu)。3. 真核基因轉(zhuǎn)錄前表達(dá)調(diào)控的方式是發(fā)生在基因組水平上的

3、基因結(jié)構(gòu)的改變。包括：基因丟失：體細(xì)胞分化過(guò)程中，必須將某些基因永久性關(guān)閉。最簡(jiǎn)單有效的方式將這些基因丟失?；驍U(kuò)增：發(fā)育分化、環(huán)境條件的改變，對(duì)某些基因產(chǎn)物的需要量急劇增加增加該基因的拷貝數(shù)。不適當(dāng)?shù)幕驍U(kuò)增，可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生基因重排：某些基因片段改變?cè)瓉?lái)存在的順序重新排列組合。甲基化修飾：DNA甲基化可引起構(gòu)象、穩(wěn)定性和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，并影響DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，抑制基因的轉(zhuǎn)錄。抑制取決于甲基化CpG的密度和啟動(dòng)子的強(qiáng)度，轉(zhuǎn)錄活躍的基因是低甲基化或不甲基化，而不表達(dá)基因的則高度甲基化。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)：DNA+HP+NHP+RNA4. 順式調(diào)控元件(cis-acting element,

4、CAE)與結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)的特定的DNA序列。包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉寂子、加尾信號(hào)。1）啟動(dòng)子(promoter)：與基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)有關(guān)的核心序列。啟動(dòng)子包括核心啟動(dòng)子和上游啟動(dòng)子元件。核心啟動(dòng)子（core promoter)： 足以使RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的、最少的起始子(initiator)。TATA盒功能有3：決定了轉(zhuǎn)錄的精確起始；介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成；產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄。上游啟動(dòng)子元件(upstream promoter element, UPE)： 包括CAAT盒和GC盒，提高轉(zhuǎn)錄效率。（2）增強(qiáng)子(enhancer)：位于-200-300bp區(qū)域，由多個(gè)獨(dú)立的、具有回文結(jié)構(gòu)的

5、核苷酸組成，以單拷貝或多拷貝的形式存在。促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄活性。特點(diǎn)：具有組織特異性。無(wú)基因特異性。無(wú)方向性。遠(yuǎn)距離作用。具有相位性。（3）沉寂子(silencer) :抑制基因轉(zhuǎn)錄。CD4/CD8基因在胸腺中受到沉寂子對(duì)其細(xì)胞亞型和成熟過(guò)程特異性的選擇表達(dá)。（4）加尾信號(hào)：在poly A尾位點(diǎn)上游10-20bp 處，常見(jiàn)1保守的AATAA序列，如去除此序列，基因會(huì)連續(xù)轉(zhuǎn)錄下去而不終止。5. RNA“編輯” (RNA editing):是RNA分子上的一種修飾，通過(guò)核苷酸插入、缺失、替換，使信息改變，產(chǎn)生氨基酸序列不同的多種蛋白質(zhì)，以擴(kuò)大遺傳信息，提高生物適應(yīng)。6. 反式作用因子的結(jié)構(gòu)由位于不同染色

6、體或同一染色體上相距較遠(yuǎn)的基因編碼的蛋白質(zhì)因子。反式作用因子的結(jié)構(gòu)：一個(gè)完整的反式作用因子含有2個(gè)必不可少的結(jié)構(gòu)域，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain)和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(trans-activating domain)。反式作用因子通過(guò)前者與DNA特定序列結(jié)合，通過(guò)后者發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活化功能。組織特異性轉(zhuǎn)錄因子常常只具有2個(gè)結(jié)構(gòu)域之一，因此其僅僅在那些提供了其缺失部分蛋白質(zhì)的細(xì)胞中互補(bǔ)為具有2個(gè)結(jié)構(gòu)域的DBP，才能發(fā)揮作用。（1）DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域鋅指結(jié)構(gòu)域(zinc finger motif)：最常見(jiàn)、最普通。結(jié)合特異性可能由位于指狀結(jié)構(gòu)基部的非保守氨基酸決定。同源盒結(jié)構(gòu)域(h

7、omodomain, HD)：同源盒(homebox)：同源盒基因家族各基因間均有1相同的保守序列（約183bp），稱(chēng)同源盒。同源盒結(jié)構(gòu)域(homodomain, HD)：同源盒產(chǎn)物蛋白中所具有的1非常相似的結(jié)構(gòu)域。亮氨酸拉鏈(leucine zipper)：通過(guò)該結(jié)構(gòu)域可形成同源或異源二聚體，二個(gè)分子螺旋的亮氨酸一側(cè)是形成二聚體的基礎(chǔ)，形同拉鏈。 堿性螺旋袢螺旋：底部的DNA結(jié)合螺旋（單體的N-末端）被非螺旋的袢所分隔。（2）轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域：酸性螺旋結(jié)構(gòu)域(acidic -helix domain)：含有較多負(fù)電荷，并能形成親脂性螺旋。富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域。富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域。反式作用因子的作用

8、機(jī)制：（1）轉(zhuǎn)錄因子相互作用：轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同結(jié)合通過(guò)HMG1促進(jìn)，引起的增強(qiáng)子序列的彎曲是增強(qiáng)體形成的關(guān)鍵。（2）競(jìng)爭(zhēng)性排除組蛋白：序列特異性轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物穩(wěn)定結(jié)合，可競(jìng)爭(zhēng)性地排除組蛋白，阻斷其對(duì)轉(zhuǎn)錄的抑制作用。（3）與核基質(zhì)蛋白作用：某些轉(zhuǎn)錄因子的活化區(qū)域與核基質(zhì)結(jié)合，將基因錨定于那些具有其他轉(zhuǎn)錄因子及隨后過(guò)程所必需因子的區(qū)域，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。（4）DNA解旋作用：某些轉(zhuǎn)錄因子(TFH)具有DNA解旋酶的作用，在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)使DNA雙螺旋解旋。1. 衰老細(xì)胞的特征。一.衰老細(xì)胞的生物學(xué)特征。（1）細(xì)胞阻滯于G1期，無(wú)法進(jìn)入S期。 （2）不可逆喪失對(duì)有絲分裂原的反應(yīng)能力。（3）調(diào)控細(xì)胞生

9、長(zhǎng)的關(guān)鍵基因的表達(dá)發(fā)生變化， 正向轉(zhuǎn)錄因子抑制，負(fù)向調(diào)控因子過(guò)量表達(dá)。（4）細(xì)胞的功能“脫分化”。 （5）發(fā)生凋亡的能力下降。二.衰老細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。 (1) 細(xì)胞核增大，核內(nèi)出現(xiàn)包含物，核膜內(nèi)陷，染色質(zhì)凝聚。 （2）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)色素積累。（3）線粒體數(shù)目減少，體積增大。（4）Golgi體囊泡腫脹，并出現(xiàn)扁平囊泡斷裂崩解，分泌及運(yùn)輸功能衰退。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列無(wú)序，膜腔擴(kuò)大甚至崩解，膜上核糖體數(shù)量減少。（5）細(xì)胞膜流動(dòng)性減低，干擾了膜蛋白的正常結(jié)構(gòu)與功能。2. 端粒與端粒酶。端粒(telomere)：由幾百個(gè)簡(jiǎn)單無(wú)信息的重復(fù)序列構(gòu)成的3端凸出的特殊結(jié)構(gòu)。功能：1.保護(hù)染色體末端。 2.防止染色體復(fù)制時(shí)末

10、端丟失，導(dǎo)致染色體斷端融合。 3.固定染色體的位置。端粒DNA附著于核基質(zhì)。端粒酶(telomerase)：一個(gè)自帶引物的逆轉(zhuǎn)錄酶，由酶蛋白和RNA組成，含有1個(gè)159nt的RNA部件，該部件含有與端粒d(TTGGGG)重復(fù)序列互補(bǔ)的(AACCCCAAC)序列。3. 錯(cuò)配修復(fù)基因。屬于管家基因，可查出并糾正DNA復(fù)制及DNA損傷過(guò)程中未配對(duì)的堿基，保證復(fù)制和重組的精確性。邢 文 英1.G蛋白、一般是指與膜受體偶聯(lián)的異三聚體G蛋白, 由、三種亞基組成 。分子量100kD左右。蛋白在結(jié)構(gòu)上沒(méi)有跨膜蛋白的特點(diǎn)，它們通過(guò)對(duì)其亞基上氨基酸殘基的脂化修飾作用將G蛋白錨定在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)。其主要類(lèi)型有Gs、Gi

11、、Gq、Gt等。2.SH2結(jié)構(gòu)域、由約100個(gè)氨基酸殘基組成，介導(dǎo)信號(hào)分子與含磷酸酪氨酸蛋白分子的結(jié)合。這種結(jié)合依賴于酪氨酸殘基的磷酸化及其周?chē)陌被釟埢鶚?gòu)成的基序（motif）。 3.SH3結(jié)構(gòu)域、由約50100個(gè)氨基酸殘基組成，介導(dǎo)信號(hào)分子與富含脯氨酸的蛋白分子的結(jié)合，其親和力與脯氨酸殘基及鄰近氨基酸殘基所構(gòu)成的基序序列相關(guān)。4.JAK、 是胞質(zhì)內(nèi)的一類(lèi)非受體酪氨酸蛋白激酶家族，已發(fā)現(xiàn)有4個(gè)成員，即JAK1、JAK2、JAK3及TYK2。其結(jié)構(gòu)不含SH2 、SH3，C端具有兩個(gè)相連的激酶區(qū)， N端的幾個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)段無(wú)酶活性，可能在受體蛋白與JAK偶聯(lián)中發(fā)揮作用。5.STAT又稱(chēng)為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子

12、和轉(zhuǎn)錄激活子，具有信號(hào)傳遞和轉(zhuǎn)錄因子雙重功能。包括STAT1STAT6， STAT的C末端有SH2結(jié)構(gòu)域，而且有一保守的酪氨酸位點(diǎn)，該位點(diǎn)被激活的JAK磷酸化，使STAT活化。二、問(wèn)答：1.簡(jiǎn)述G蛋白跨膜傳遞信息的機(jī)制當(dāng)受體未與配體結(jié)合時(shí)，G蛋白的三個(gè)亞基呈聚合狀態(tài)，亞基與GDP結(jié)合，無(wú)活性。當(dāng)受體與配體結(jié)合時(shí)，活化的受體將導(dǎo)致G蛋白亞基釋放它原來(lái)結(jié)合的GDP，代之以GTP，從而使G蛋白激活?；罨腉蛋白三聚體解離成G-GTP和G兩部分，不再和受體結(jié)合。通常由G-GTP（有時(shí)由G）結(jié)合并激活（或抑制）質(zhì)膜中的某種酶，這種酶產(chǎn)生第二信使。G具有GTP酶的活性，把它所結(jié)合的GTP水解成GDP和Pi

13、，從而使G失活，然后再與G亞基結(jié)合生成無(wú)活性G·GDP，受體的作用終止。 在動(dòng)物細(xì)胞中，G蛋白偶聯(lián)受體改變細(xì)胞內(nèi)第二信使?jié)舛鹊耐緩街饕袃蓷l：一是cAMP途徑，通過(guò)G蛋白作用于腺苷酸環(huán)化酶，調(diào)節(jié)cAMP的產(chǎn)生。二是IP3、DG和 Ca2+途徑，通過(guò)G蛋白作用于磷脂酶C，產(chǎn)生中介信使分子IP3和DG，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+。2.舉例說(shuō)明cAMP信號(hào)傳遞途徑、cAMP信號(hào)傳遞途徑：在骨骼肌細(xì)胞中，糖原的合成和降解均受腎上腺素的調(diào)節(jié)。當(dāng)動(dòng)物恐懼或緊張時(shí)，腎上腺分泌腎上腺素。當(dāng)受體與配體結(jié)合時(shí)，活化的受體將導(dǎo)致G蛋白亞基釋放它原來(lái)結(jié)合的GDP，代之以GTP，從而使G蛋白激活?；罨腉蛋白三聚體

14、解離成G-GTP和G兩部分，不再和受體結(jié)合。G-GTP（有時(shí)由G）結(jié)合并激活腺苷酸環(huán)化酶，使胞內(nèi)cAMP濃度增加。細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的突然迅速增加，可激活PKA ，活化的PKA催化將ATP末端磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到靶蛋白特異位點(diǎn)的Ser/Thr殘基上，從而調(diào)節(jié)與糖代謝有關(guān)的靶蛋白的活性。比如，磷酸化糖原合成酶，引起糖原合成抑制；磷酸化糖原磷酸化激酶，后者使糖原磷酸化酶活化，使糖原磷酸化分解活化。3.試述RPTKRas信號(hào)傳遞途徑EGF受體在膜上以無(wú)活性的單體形式存在，配體EGF與受體結(jié)合并引起構(gòu)象變化，導(dǎo)致受體二聚化，激活受體本身的酪氨酸蛋白激酶活性，發(fā)生自身磷酸化。Tyr殘基和其周?chē)陌被釟埢鶚?gòu)成

15、一個(gè)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，它可與具有SH2結(jié)構(gòu)域的靶蛋白結(jié)合傳遞信息。自身磷酸化的RTK磷酸化Grb2和SOS，使其活化，進(jìn)而激活Ras蛋白。在Ras蛋白下游的蛋白激酶激酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)中，信號(hào)蛋白依次是：Raf蛋白，又名MAPKKK。MEK蛋白：又名MAPKK。MAP激酶：即MAPK。MAPK的靶蛋白。4. 簡(jiǎn)述JAK-STAT信號(hào)傳遞途徑。答：JAK-STAT途徑：（1）配體與受體結(jié)合導(dǎo)致受體二聚化；（2）二聚化受體激活JAK；（3）JAK將STAT磷酸化；（4）STAT形成二聚體，暴露出入核信號(hào)；（5） STAT進(jìn)入核內(nèi)，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。名詞：1.cyclin box各類(lèi)周期蛋白均含有一段約100個(gè)氨基酸

16、的保守序列，稱(chēng)為周期蛋白盒(cyclin box),介導(dǎo)周期蛋白與CDK結(jié)合。2.R點(diǎn)(restriction point) G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)在哺乳動(dòng)物中稱(chēng)R點(diǎn)(restriction point)，控制細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)的G1進(jìn)入DNA合成期，相關(guān)的事件包括：DNA是否損傷？細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì)胞體積是否足夠大？問(wèn)答：1. 簡(jiǎn)述細(xì)胞周期各時(shí)相cyclin的種類(lèi)及作用。cyclin 的種類(lèi)繁多，分別參與細(xì)胞周期中不同時(shí)相的調(diào)節(jié)。分為G1型、G1/S型S型和M型4類(lèi)。G1期 細(xì)胞在生長(zhǎng)因子的刺激下，G1期cyclin D表達(dá)，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，磷酸化的Rb釋放出

17、轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)許多基因的轉(zhuǎn)錄。 G1/S期 cyclinE與CDK2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G1/S限制點(diǎn)而進(jìn)入S期。 S期 將CyclinA的抗體注射到細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能抑制細(xì)胞的DNA合成，推測(cè)CyclinA是DNA復(fù)制所必需的。G2/M期 cyclinA、cyclinB與CDK1結(jié)合，CDK1使底物蛋白磷酸化,如將組蛋白H1磷酸化導(dǎo)致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體等下游細(xì)胞周期事件M期 在分裂中期當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時(shí)，通過(guò)一種未知的途徑，激活后期促進(jìn)因子APC ，負(fù)責(zé)將泛素連接在cyclinB上，導(dǎo)致cyclinB被蛋白酶體降解，完成一個(gè)細(xì)胞周期。2. 簡(jiǎn)述細(xì)胞周期的主要檢驗(yàn)點(diǎn)（c

18、heck point）及功能。 主要檢驗(yàn)點(diǎn)包括： G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)：控制細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)的G1進(jìn)入DNA合成期，相關(guān)的事件包括：DNA是否損傷？細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì)胞體積是否足夠大？ S期檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA復(fù)制是否完成？G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)：是決定細(xì)胞一分為二的控制點(diǎn)，相關(guān)的事件包括： 所有DNA都正確復(fù)制了嗎？DNA是否有損傷？細(xì)胞體積是否足夠大？ 中-后期檢驗(yàn)點(diǎn)（紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)）：所有染色體都排列在紡錘體上了嗎？任何一個(gè)著 絲點(diǎn)沒(méi)有正確連接到紡錘體上，引起細(xì)胞周期中斷.3. 試述CDK1不同位點(diǎn)氨基酸殘基磷酸化/去磷酸化對(duì)其活性的調(diào)節(jié)。以P34cdc2 (CDK1)為例，如果對(duì)P34cdc2(CDK

19、1)磷酸化作用位點(diǎn)不同，則對(duì)該酶的活性分別產(chǎn)生正向和負(fù)向的控制。完整的P34cdc2(CDK1)-cyclin復(fù)合物需要磷酸化才能被激活，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂。P34cdc2(CDK1)的Thr14和Tyr15的磷酸化引起P34cdc2(CDK1)-cyclin復(fù)合物的失活. P34cdc2(CDK1)的Thr161的磷酸化是酶的活性所必需的。當(dāng)磷酸酶-1將此位點(diǎn)的磷酸水解，P34cdc2又失去激酶活性。朱 曉 燕1.基因診斷（gene diagnosis）采用分子生物學(xué)的技術(shù)方法來(lái)分析受檢者的某一特定基因結(jié)構(gòu)（DNA水平）或功能（RNA）水平是否異常，以此來(lái)對(duì)相應(yīng)的疾病進(jìn)行診斷，是病因診斷。

20、2.SSCP把PCR后獲得的雙鏈DNA加熱變性后形成單鏈DNA，相同長(zhǎng)度的DNA單鏈由于堿基順序不同，它們?cè)谥行跃郾□０纺z中可有不同的構(gòu)象而導(dǎo)致電泳速度的不同，這種現(xiàn)象稱(chēng)為單鏈構(gòu)象多態(tài)性。3.PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),又叫體外基因擴(kuò)增技術(shù)。利用人工合成的一對(duì)引物，在被擴(kuò)增DNA模板鏈的兩端形成雙鏈，由DNA聚合酶催化一對(duì)引物之間的聚合反應(yīng)。4.DNA指紋: 針對(duì)重復(fù)序列人工合成寡核苷酸片斷作為探針，與經(jīng)過(guò)酶切的人基因組DNA進(jìn)行southren blot雜交，可以得到大小不等的雜交帶而且雜交帶的數(shù)目和分子量大小具有個(gè)體特異性，就象人的指紋一樣，以因而把這種雜交帶圖譜稱(chēng)。5.基因干預(yù)(gene

21、 interference)指采用特定的方式抑制某個(gè)基因（多是過(guò)度表達(dá)的癌基因）的表達(dá)，或者通過(guò)破壞某個(gè)基因而使之不表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。6.RNA干擾RNAi（RNA interference）是指在生物體細(xì)胞內(nèi)，短雙鏈RNA（dsRNA）引起同源mRNA的特異性降解，因而抑制相應(yīng)基因表達(dá)的過(guò)程。 反義RNA：能與mRNA互補(bǔ)配對(duì)的RNA分子，配對(duì)后在空間上妨礙以此mRNA為模板的蛋白質(zhì)合成，因而可在翻譯水平調(diào)控基因表達(dá)。問(wèn)答：1 簡(jiǎn)述癌基因及其激活機(jī)制。癌基因:指細(xì)胞基因組中具有能夠使正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化基因。是細(xì)胞內(nèi)控制細(xì)胞生長(zhǎng)的基因，具有潛在的誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的話特性，在癌基因異

22、常表達(dá)時(shí)，其產(chǎn)物可使細(xì)胞無(wú)限分裂。原癌基因激活的機(jī)制（一）點(diǎn)突變； c-Ha-ras 35位堿基不同，正常細(xì)胞編碼甘氨酸，腫瘤細(xì)胞編碼纈氨酸。 原癌基因的表達(dá)產(chǎn)物多具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能，當(dāng)點(diǎn)突變發(fā)生后， （1）該蛋白質(zhì)的活性可能大大增強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞增殖的刺激作用也增強(qiáng)； （2）可能使該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性增加，導(dǎo)致其在胞內(nèi)的濃度增加，對(duì)增殖刺激的時(shí)間和強(qiáng)度也隨之增加； （3）可能會(huì)引起RNA的錯(cuò)誤剪接（splicing site）而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。 （二）獲得外源啟動(dòng)子、增強(qiáng)子，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，表達(dá)活性增強(qiáng)。如獲得前病毒LTR(長(zhǎng)末端重復(fù)序列)；獲得上游遠(yuǎn)端的增強(qiáng)子。 某些不含v-onc的弱轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)

23、錄病毒,而其前病毒含有強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(long terminal repeated sequence, LTR)，若插入（insertion）到細(xì)胞癌基因鄰近位置,便會(huì)使該細(xì)胞癌基因過(guò)度表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。  （三）原癌基因因甲基化程度降低DNA分子中的甲基化（methylation）對(duì)于保持雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，阻抑基因的轉(zhuǎn)錄具有重要作用。（四）原癌基因擴(kuò)增（c-myc）原癌基因通過(guò)某些機(jī)制在原染色體上復(fù)制出多個(gè)拷貝，導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物異常增多而加速細(xì)胞增殖。 （五）染色體易位(基因易位或重排) 癌基因從所在染色體的正常位置上易位（trnaslocation）至另一染色體

24、的某一位置上，使其調(diào)控環(huán)境發(fā)生改變，從相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)為激活狀態(tài)。 2 簡(jiǎn)述基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)。（1）、核酸分子雜交：按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，將不同來(lái)源的序列互補(bǔ)大量的DNA/DNA,RNA/RNA互補(bǔ)配對(duì)成雙鏈雜交分子。原位雜交：用核苷酸探針對(duì)特殊的核苷酸順序在其原位進(jìn)行雜交，可用于DNA,RNA的定位研究。（2）、聚合酶鏈反應(yīng)：利用人工合成的一對(duì)引物，在被擴(kuò)增的(DNA)模板鏈的兩端形成雙鏈，由DNA聚合酶催化一對(duì)引物之間的聚合反應(yīng)。（3）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析：把PCR后獲得的雙鏈DNA加熱變性后形成單鏈DNA，相同長(zhǎng)度的DNA單鏈由于堿基順序不同，它們?cè)谥行跃郾□０纺z中可有不

25、同的構(gòu)象而導(dǎo)致電泳速度的不同，這種現(xiàn)象稱(chēng)為單鏈構(gòu)象多態(tài)性。（4）、限制酶酶譜分析：基因突變致酶切位點(diǎn)的丟失或相對(duì)位置發(fā)生改變，以此酶消化待測(cè)DNA和野生型對(duì)照DNA,通過(guò)比較二者的酶切片斷的長(zhǎng)度、數(shù)量上的差異就可判斷待測(cè)DNA的突變情況。（5）、DNA序列測(cè)定；分子克隆到載體上，或直接對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。（6）、DNA芯片技術(shù)：將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上。3 簡(jiǎn)述基因治療的主要策略基因標(biāo)記(gene labeling) 解決：1外源基因能否安全地轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)，2從患者體內(nèi)取出的細(xì)胞能否檢測(cè)到轉(zhuǎn)移基因的存在。 Neo基因（新霉素抗性基

26、因），逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，便于跟蹤這種標(biāo)記細(xì)胞?；蛑脫Q（基因矯正） 特定的目的基因?qū)胩囟ǖ募?xì)胞，通過(guò)定位重組或同源重組糾正缺陷基因或異常序列。利用基因打靶技術(shù)，實(shí)現(xiàn)基因同源重組。基因添加（基因增補(bǔ)） 導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因1. 導(dǎo)入正常的基因補(bǔ)償缺陷基因的功能2. 導(dǎo)入新的基因，利用表達(dá)產(chǎn)物治療。如將細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，即屬于這一類(lèi)?；蚋深A(yù)(gene interference) 指采用特定的方式抑制某個(gè)基因（多是過(guò)度表達(dá)的癌基因）的表達(dá)，或者通過(guò)破壞某個(gè)基因而使之不表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。主要方式：1.反義RNA 導(dǎo)入寡核苷酸抑制內(nèi)源基因的表達(dá)2.核酶

27、裂解特異的靶mRNA3.三鏈DNA 4.RNA干擾4. 什么是基因工程，舉例簡(jiǎn)述其過(guò)程。定義：對(duì)目的基因進(jìn)行體外重組，再將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使這個(gè)基因在受體細(xì)中復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的過(guò)程。原理：利用酶學(xué)方法，將目的DNA片段或人工合成的基因，通過(guò)運(yùn)載體在體外重組，并將重組后的DNA轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增，形成大量與親代分子完全相同的子代DNA分子，使其表達(dá)為新的性狀或用于進(jìn)一步的研究。過(guò)程：1、目的基因的獲?。≒CR,gene library)；2、載體(vector)的選擇與構(gòu)建(工具酶等）；3、目的基因與載體連接，構(gòu)建重組DNA分子；4、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子篩選；5、受體

28、細(xì)胞中目的基因的功能表達(dá)。意義：填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝?？s短了生物進(jìn)化的時(shí)間。使人們能夠?qū)ι镞M(jìn)行定向改造。柴 玉 榮1.質(zhì)粒；質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。分為兩類(lèi)：嚴(yán)緊型質(zhì)粒：在寄主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制除了受本身遺傳結(jié)構(gòu)的控制外，還受染色體的嚴(yán)緊控制，因此拷貝數(shù)較少。松弛型質(zhì)粒;復(fù)制只受本身的遺傳結(jié)構(gòu)的控制，有較多的拷貝數(shù)。2.基因文庫(kù)；一個(gè)生物體的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶部分酶切后，將酶切片段克隆在載體DNA分子中，所有這些插入了基因組DNA片段的載體分子的集合體，將包含了這個(gè)生物體的整個(gè)基因組，也就是構(gòu)成了這個(gè)生物體的基因文庫(kù)。包括G文

29、庫(kù)和C文庫(kù)。3.Real time-PCR; 又稱(chēng)實(shí)時(shí)PCR或熒光定量PCR，是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。4.多克隆位點(diǎn)（multiple cloning site）；是一段人工合成的DNA序列，含有密集排列的多種限制性酶切位點(diǎn)，以利于不同來(lái)源的外源DNA片段插入載體。5.限制性內(nèi)切酶；是一類(lèi)能夠識(shí)別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶。6.核酸雜交;核酸雜交檢測(cè)技術(shù)就是利用核酸堿基嚴(yán)格配對(duì)的特性和核酸標(biāo)記物（探針）的靈敏度而建立的檢測(cè)核酸結(jié)構(gòu)與功能的方法。核酸雜交檢測(cè)技術(shù)包括以下技術(shù)。7.T

30、-A克隆.1、Taq DNA 聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，可在 新鏈的 3' 末端添加一個(gè)核苷酸，通常為 A 2、T-vector： 普通的克隆載體切成線狀，并使之在 3' 末端含有一個(gè)凸出堿基T。Taq 酶擴(kuò)增的產(chǎn)物可與 T-載體進(jìn)行粘端互補(bǔ)連接，達(dá)到高效克隆的目的 。8. 基因芯將 DNA 分子固定于支持物上，并與標(biāo)記的樣品雜交，通過(guò)自動(dòng)化儀器檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)判斷樣品中靶分子的數(shù)量，進(jìn)而得知樣品中 mRNA 的表達(dá)量。1 舉例說(shuō)明兩種轉(zhuǎn)基因方法。轉(zhuǎn)化：普通 DNA 的轉(zhuǎn)移 轉(zhuǎn)染：病毒核酸的轉(zhuǎn)移 感染：病毒的侵染等。當(dāng)受體為細(xì)菌時(shí)：常采用電擊法、熱擊法（氯化鈣法）受體為細(xì)

31、菌真核生物時(shí)：電擊法，基因槍?zhuān)@微注射。1.電穿孔(electroporation)：利用高壓電脈沖的電激作用將外源基因?qū)爰?xì)胞的轉(zhuǎn)化方法。電擊儀: Gene Pulse® 及0.2 cm 電擊杯 電擊參數(shù)：電容-10F，電阻-400，電壓-1.5 kV；電擊緩沖液：10% 甘油或蔗糖。2.基因槍(gene gun)又稱(chēng)生物導(dǎo)彈法、微粒轟擊法：將載有外源基因的微米/亞微米級(jí)的金屬微粒（鎢或金粉）加速，高速轟擊并射入受體靶細(xì)胞的方法。是將外源基因?qū)虢M織或細(xì)胞的一種物理學(xué)轉(zhuǎn)化方法。基因槍優(yōu)點(diǎn); 靶組織的大小不受轟擊室的限制； 轟擊過(guò)程中不需真空環(huán)境，操作簡(jiǎn)便； 使用范圍廣，可用于體內(nèi)與

32、體外的轉(zhuǎn)化； 為便攜式裝置，使用方便，占用面積小。 2 簡(jiǎn)述DNA recombination 的連接方法。1>.粘性末端連接2>平末端連接: 兩個(gè)具有平末端的雙鏈DNA分子連接。 問(wèn)題：低效率、串珠現(xiàn)象； 提高平末端DNA連接的效率： 加入大分子凝聚劑, 如：PEG8000； 加大連接酶的量3>人工接頭連接法: 將人工合成的或來(lái)源于現(xiàn)有質(zhì)粒的一小段DNA分子(在這一小段DNA分子上有某種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列), 加到載體或外源DNA的分子上, 然后通過(guò)酶切制造粘性末端，再進(jìn)行連接的方法。 4>.同聚物加尾連接: 利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA的3端各加上一段寡

33、聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC),制成人工粘性末端；然后在DNA連接酶的作用下, 連接成為重組的DNA分子。3 試述Southern blot 原理及應(yīng)用。 Southern blotting ：用合適的限制性內(nèi)切酶消化DNA, 電泳分離DNA片段, 利用毛細(xì)作用, 使液體經(jīng)過(guò)凝膠, 使DNA片段由液流攜帶而從凝膠轉(zhuǎn)移并結(jié)合在固體支持物（硝酸纖維膜）表面，然后進(jìn)行雜交。 作用：檢測(cè)特定基因的大小、拷貝數(shù)、變異等。 流程:.1.總 DNA的抽提、質(zhì)量檢測(cè)；.2.限制性內(nèi)切酶操作；.3.DNA的瓊脂糖凝膠電泳、0.4N NaOH堿變性；.4.轉(zhuǎn)膜（毛細(xì)管滲吸或電轉(zhuǎn)移）；.5.80 處理或紫外

34、線照射將 DNA 固定在濾膜；.6.探針的制備、同位素操作等。.7.預(yù)雜交,雜交,放射自顯影.（楊 繼 要） 1.蛋白質(zhì)組及蛋白質(zhì)組學(xué)概念蛋白質(zhì)組：是蛋白質(zhì)（protein）和基因組（genome）兩個(gè)詞的組合詞，意思是proteins expressed by a genome, 即基因組表達(dá)的全套蛋白質(zhì)。由于受到基因表達(dá)調(diào)控的影響，基因表達(dá)存在著時(shí)間、空間、個(gè)體間的差異，即使在同一個(gè)體內(nèi)，不同階段和不同生理狀態(tài)下，基因表達(dá)的情況也不相同，因此蛋白質(zhì)組是一個(gè)動(dòng)態(tài)的概念。蛋白質(zhì)組學(xué)（Protemics）則是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，從整體角度，分析細(xì)胞或組織內(nèi)蛋白質(zhì)構(gòu)成的動(dòng)態(tài)變化和活動(dòng)規(guī)律的科學(xué)。

35、2.比較蛋白質(zhì)組學(xué)（表達(dá)）的技術(shù)平臺(tái)及實(shí)驗(yàn)流程技術(shù)平臺(tái)雙向凝膠電泳技術(shù)（2-DE）原理：相互垂直的兩個(gè)方向上，分別基于蛋白質(zhì)不同的等電點(diǎn)和分子量，先經(jīng)等電聚焦電泳(IEF)，再經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）把復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分分離。 其他用于蛋白質(zhì)電泳的方法: 1.差異凝膠電泳 2.毛細(xì)管電泳 3.高效液相色譜質(zhì)譜技術(shù)原理：基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）和電噴霧電離（ESI）兩種“軟電離” 技術(shù)的出現(xiàn)使得質(zhì)譜技術(shù)得到迅速的發(fā)展，成為蛋白質(zhì)鑒定的核心技術(shù)。所謂“軟電離”是指樣品分子電離時(shí)保留整個(gè)分子的完整性，不會(huì)形成碎片離子。雙向電泳與質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本技術(shù)平臺(tái)。生物信息學(xué)：隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃、計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的發(fā)展而誕生的一門(mén)新興學(xué)科，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可缺少的一部分。 在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中有兩個(gè)重要應(yīng)用：一是分析和構(gòu)建雙向凝膠電泳圖譜，二是搜索與構(gòu)建蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本流程 蛋白樣品的制備及定量-總蛋白的雙向凝膠電泳-凝膠分析軟件分析-膠內(nèi)酶解（胰肽酶）- 質(zhì)譜分析（肽質(zhì)量指紋圖譜-數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定蛋白性質(zhì)3.幾種功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法的基本原理（1）、蛋白質(zhì)芯片:是將大量蛋白質(zhì)分子按預(yù)先設(shè)置的排列固定于一種