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文檔簡(jiǎn)介

1、2011-08, 32 (4)中國(guó)煙草科學(xué) Chinese Tobacco Science31煙草NtLS基因RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化王衛(wèi)鋒,太帥帥,王 魯,劉貫山,李鳳霞,高曉明,孫玉合*(農(nóng)業(yè)部煙草類作物質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,青島266101)摘 要:腋芽的形成涉及多個(gè)調(diào)控基因,其中關(guān)鍵基因編碼的蛋白屬于植物特有的GRAS蛋白家族,它的突變或功能缺失將影響腋生分生組織的形成。筆者利用RACE技術(shù)克隆了煙草 NtLS基因(GenBank登錄號(hào)EU935581),NtLS與調(diào)控植物腋生分生組織形成的基因 LS/LAS/MOC1序列高度相似。本研究從該基因上

2、選取干擾片段,構(gòu)建了含有反向重復(fù)序列的RNAi干擾表達(dá)載體,并通過農(nóng)桿菌侵染的方法轉(zhuǎn)染煙草W38,以期為NtLS基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞:煙草;NtLS; RNA干擾中圖分類號(hào):TS413文章編號(hào):1007-5119(2011)04-0031-05 DOI : 10.3969/j.issn.1007-5119.2011.04.008Construction of RNAi Vector ofNtLS Gene and its Transformation in TobaccoWANG Weife ng, TAI Shuaishuai, WANG Lu, LIU Gua nsha n, L

3、I Fe ngxia, GAO Xiaomi ng, SUN Yuhe(Key Laboratory of Tobacco Quality Control, Ministry of Agriculture, Tobacco Research Institute, Chinese Academy of AgriculturalSciences, Qingdao 266101, China)Abstract: Axillary bud formation involves many regulatory genes, one of key factors belongs to the plant

4、specific protein family GRAS. Mutation or function missing of these genes would affect the axillary formation. The tobacco NtLS gene (EU935581) was cloned by RACE technology in our lab. The sequences of NtLS are highly similar to those of LS/LAS/MOC1, which regulate the formation of axillary meriste

5、ms. The interference fragments were chosen fromNtLS and the RNAi expression vectors wereconstructed and transformed into Nicotiana tabacum W38 by agrobacterium-mediated leaf disc transformation methods, to form basis for further study of NtLS function.Keywords: tobacco; NtLS; RNAi 1 *4-2012 Chirui A

6、cademic Journal Ekctronic PuKlijihing House. All rights reserved, http:/wavi. Jidt2011-08, 32 (4)中國(guó)煙草科學(xué) Chinese Tobacco Science#煙葉生產(chǎn)中,打頂之后煙株上的腋芽會(huì)迅速發(fā) 生。腋芽的生長(zhǎng)會(huì)消耗大量養(yǎng)分,如不及時(shí)去除, 將導(dǎo)致煙葉產(chǎn)量減少,品質(zhì)下降。目前去除腋芽主要靠人工抹杈和使用抑芽劑。人工抹杈不但費(fèi)工 費(fèi)時(shí),而且抹杈造成的傷口利于一些病原菌的入 侵,容易造成病害傳播2。而抑芽劑多為有機(jī)合成, 存在著影響煙葉品質(zhì)、毒性殘留以及環(huán)境污染等冋 題,而且使用成本較高。從腋芽形

7、成的分子機(jī)理入 手,利用分子育種手段可能是解決煙草腋芽問題的 一條有效途徑。腋芽的形成由胚后發(fā)育形成的腋生分生組織 決定,在腋生分生組織形成過程中涉及多個(gè)調(diào)控基 因,女口 LS、LAS、MOC1等,這類基因編碼的 基金項(xiàng)目:國(guó)家煙草專賣局重點(diǎn)資助項(xiàng)目(110200701021)蛋白屬于植物特有的 GRAS蛋白家族,它們的突變 或功能缺失將影響腋生分生組織的形成。本研究利 用RACE技術(shù)克隆了煙草 NtLS基因(Gen Ba nk登 錄號(hào)EU935581 ),該基因的全長(zhǎng) cDNA序列為1 847 bp,編碼區(qū)為1 224 bp,編碼407個(gè)氨基酸,基因 序列不含有內(nèi)含子。NtLS與調(diào)控植物腋生

8、分生組 織形成的基因 LS/LAS/MOC1序列高度相似。為了 明確NtLS的功能,經(jīng)過序列比對(duì)分析,我們從該 基因上選取干擾片段,構(gòu)建了含有反向重復(fù)序列的 RNAi干擾表達(dá)載體pART27-FR,并通過農(nóng)桿菌侵 染的方法轉(zhuǎn)化煙草品種W38,獲得了轉(zhuǎn)化煙草幼苗,為從分子手段研究煙草腋芽形成與控制奠定了 基礎(chǔ)。 1 *4-2012 Chirui Academic Journal Ekctronic PuKlijihing House. All rights reserved, http:/wavi. Jidt2011-08, 32 (4)中國(guó)煙草科學(xué) Chinese Tobacco Scienc

9、e32作者簡(jiǎn)介:王衛(wèi)鋒,男,碩士,研究方向?yàn)闊煵莘肿佑N。E-mail: sdwangweifeng。*通信作者,E-mail: yhsun收稿日期:2010-06-21 1 *4-2012 Chirui Academic Journal Ekctronic PuKlijihing House. All rights reserved, http:/wavi. Jidt34中國(guó)煙草科學(xué)2011年第32卷1材料與方法1.1 材料用于載體構(gòu)建的基本質(zhì)粒pKANNIBAL 和PART27 由 Peter M. Water-house 實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。煙草 品種W38及根癌農(nóng)桿菌菌株 EHA105為本實(shí)驗(yàn)

10、室 保存。大腸桿菌感受態(tài)菌株(DH5 a)、植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化有限公司,Taq酶、限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA片段純 化試劑盒以及瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自大連寶 生物生物工程有限公司, T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB 公司,小牛小腸堿性磷酸酶( CIAP )購(gòu)自MBI公 司,其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。1.2方法1.2.1干擾片斷的選擇及引物設(shè)計(jì)選取NtLS基因上的非保守區(qū)段 7081 041 bp間長(zhǎng)334 bp的序列 作為干擾片段。根據(jù)干擾片段的堿基順序以及 pKANNIBAL 上intron兩端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn), 分別設(shè)計(jì)正、反向插入片段的擴(kuò)增引物。正向片段 引

11、物 F1 : ata ctc gag CGA TCC ACA TCG TTG ATT TTG(引入 XhoI 酶切位點(diǎn)),F2 : ata ggt acc ATC CTT AAC TTT TCG CGG TCT T (引入 Kpnl 酶切位點(diǎn)), 預(yù)期擴(kuò)增片段為352 bp;反向片段引物 R1 : ata tct aga CGA TCC ACA TCG TTG ATT TTG (引入 XbaI 酶切位點(diǎn)),R2: ata aag ctt ATC CTT AAC TTT TCG CGG TCT T (引入Hindlll酶切位點(diǎn)),預(yù)期擴(kuò)增片 段為352 bp。1.2.2正、反向片段擴(kuò)增及中間載體

12、構(gòu)建以煙草W38基因組DNA為模板,分別利用正、反向片段 引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 C變性30 s, 57C復(fù)性30 S, 72 C延伸45 s, 30個(gè)循環(huán)后72C延 伸7 min PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,分別利用XhoI/Kpnl、 XbaI/Hindlll兩對(duì)限制性內(nèi)切酶和 T4連接酶,將正、 反向片段插入pKANNIBAL上的多克隆位點(diǎn),構(gòu) 建中間載體 pKANNIBAL-FR ,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸 桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5 a),在含有 Kan (50 mg/L) 的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,挑取單菌落經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng) 后提取質(zhì)粒,進(jìn)行Xhol/Xbal雙酶切鑒定。1.2.3 RNA 干擾

13、表達(dá)載體的構(gòu)建用Notl分別酶切中間載體 pKANNIBAL-FR 和表達(dá)載體 pART27 , 電泳回收 RNAi表達(dá)序列和酶切后的 pART27。T4 連接酶連接RNAi表達(dá)序列與CIAP處理酶切后的 pART27 ,連接后的轉(zhuǎn)化、篩選、及酶切鑒定同1.2.2 , 并送大連寶生物生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序 上游引物為:CTA TCC TTC GCA AGA CCC T ,測(cè) 序下游引物為:TAG GCG TCT CGC ATA TCT C , 將構(gòu)建正確的RNAi干擾表達(dá)載體命名為 pART27-FR。1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化體篩選采用凍融8法將pART27-FR導(dǎo)入農(nóng)桿菌 E

14、HA105,葉盤法 轉(zhuǎn)化煙草W38。轉(zhuǎn)化體篩選的 MS培養(yǎng)基中含有 Kan (100 mg/L)和 Carb (300 mg/L)。1.2.5轉(zhuǎn)化煙草幼苗的 PCR檢測(cè)以轉(zhuǎn)化煙草幼 苗的基因組總DNA為模板,根據(jù)RNAi表達(dá)序列 上35S啟動(dòng)子、正(反)向特異片段以及終止子的 序列,分別設(shè)計(jì)針對(duì)轉(zhuǎn)化煙草幼苗的正(反)向插 入片段的檢測(cè)引物。正向插入片段檢測(cè)引物PF-1:CCA CTA TCC TTC GCA AGA CC , PF-2: CGG TCT TTC AAG AGC CTG TG,擴(kuò)增片段大小為 388 bp。 反向插入片段檢測(cè)引物 RT-1: TTA CAG TTG GGA AAT

15、 TGG GTT CG , RT-2: CAT AGG CGT CTC GCA TAT CTC ,擴(kuò)增片段大小為 411 bp。擴(kuò)增片段 回收、純化后,進(jìn)行測(cè)序。2 結(jié)果2.1正、反向片段的 PCR擴(kuò)增以W38基因組DNA為模板,分別用攜帶有酶 切位點(diǎn)的正、反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳檢測(cè)擴(kuò) 增產(chǎn)物,擴(kuò)增片段大小與預(yù)期一致。將目的條帶回 收進(jìn)行酶切反應(yīng)。2.2 中間載體pKANNIBAL-FR 的酶切鑒定純化后的正反向片段分別利用Xhol/Kpnl、Xbal/HindHI兩對(duì)限制性內(nèi)切酶和 T4連接酶,對(duì)應(yīng) 插入在pKANNIBAL 多克隆位點(diǎn)上,經(jīng) Xhol/Xbal 雙酶切鑒定,酶切片段大

16、小與預(yù)期大小一致,說明 1 *94-2012 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights 第4期王衛(wèi)鋒等:煙草NtLS基因RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化35已成功構(gòu)建了中間載體pKANNIBAL-FR ,形成在PPDK)內(nèi)含子序列兩邊分別含有正、反向NtLS基因丙酮酸磷酸雙激酶(pyruvate orthophosphate dikinase,特異片段的RNAi表達(dá)盒(圖1 )。 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihin

17、g House. Al rights reserved, http:Anki.iidt第4期王衛(wèi)鋒等:煙草NtLS基因RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化# 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihing House. Al rights reserved, http:Anki.iidt第4期王衛(wèi)鋒等:煙草NtLS基因RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化#CaMV35S啟動(dòng)子NotI XhoIPPDK內(nèi)含子OCS終止子forward fragme ntreverse fragme nt日川冷川險(xiǎn)圖1 NtLs - RNAi表達(dá)盒示意圖F

18、ig. 1 Expression box of NtLS-RNAi注: forward fragment:正向插入的s基因的352 bp片段;reverse fragment:反向插入的 基因的352 bp片段 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihing House. Al rights reserved, http:Anki.iidt第4期王衛(wèi)鋒等:煙草NtLS基因RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化# 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihing House. A

19、l rights reserved, http:Anki.iidt第4期王衛(wèi)鋒等:煙草NtLS基因RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化362.3 RNA干擾表達(dá)載體pART27-FR的測(cè)序鑒定將構(gòu)建的干擾表達(dá)載體送大連寶生物生物工 程有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明已成功構(gòu)建了RNAi干擾表達(dá)載體 pART27-FR (圖2 )。2.4轉(zhuǎn)化煙草幼苗的 PCR檢測(cè)以轉(zhuǎn)化煙草幼苗的基因組總DNA為模板,以正向插入片段檢測(cè)引物 PF-1和PF-2進(jìn)行PCR擴(kuò) 增;以反向插入片段檢測(cè)引物 RT-1和RT-2進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果表明,RNAi干擾表 達(dá)載體pART27-FR已成功轉(zhuǎn)入煙草

20、 W38中(圖3)。 3討論RNA干擾(RNAi )在許多生物中普遍存在, 在真核生物中RNAi的功能主要表現(xiàn)在抵抗病毒復(fù) 制表達(dá)、抑制轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座以及調(diào)控基因表達(dá)等方 面,利用RNAi技術(shù)對(duì)于研究植物基因功能和轉(zhuǎn)基 因植物具有積極的意義。目前,植物RNAi介導(dǎo)的方法主要包括正義 RNA介導(dǎo)的共抑制、反義 RNA 介導(dǎo)的基因抑制、病毒介導(dǎo)的基因沉默(virusinduced gene silencing , VIGS ) 和 hpRNA 介導(dǎo)的基9因沉默。其中,VIGS法采用幼苗或植株局部接種 的方式,不能穩(wěn)定遺傳,因而無法對(duì)萌發(fā)期和幼苗10期表達(dá)的基因功能進(jìn)行研究。正義RNA介導(dǎo)的共抑制和反義

21、RNA介導(dǎo)的基因抑制的基因沉默效 率為0%30% ,而hpRNA介導(dǎo)的基因沉默效率可 達(dá)到48%100%7。hpRNA介導(dǎo)的基因沉默已成 為RNAi研究的熱點(diǎn),它具有有效率高、干擾作用 持久、可穩(wěn)定遺傳給子代、應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)11。 RNAi干擾載體構(gòu)建過程中,干擾片段的長(zhǎng)度和在 靶基因中的位置將影響 RNAi的效率和效果9。因此,干擾片段的選擇是RNA干擾實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。一般情況下,選擇的干擾片段長(zhǎng)度應(yīng)在 90900 bp之間,選擇的區(qū)段可以在基因的內(nèi)部編 碼區(qū),也可以在3 或5 端的非編碼區(qū), 對(duì)于300 bp以上的干擾片段,基本可以保證被加工后所得的 前體中包含能夠有效進(jìn)行 RN

22、A干擾的dsRNA。此 外,為了避免非特異性RNA干擾的發(fā)生,在選擇干擾片段時(shí),對(duì)于基因的保守區(qū)域應(yīng)該謹(jǐn)慎對(duì)待。 在對(duì)煙草幼苗的檢測(cè)過程中,也分別根據(jù)啟動(dòng)子和 終止子序列設(shè)計(jì)了 PCR擴(kuò)增引物,試圖對(duì)包括正向 插入片段、內(nèi)含子以及反向插入片段的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò) 增。但是,這樣的嘗試都沒有成功,這很可能是由 于該片段序列特殊,能夠自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),使引 物不能與模板結(jié)合,導(dǎo)致 PCR反應(yīng)無法繼續(xù)進(jìn)行。 植物中存在著多條調(diào)控腋生分生組織形成的途徑, 對(duì)擬南芥的研究表明,LAS和RAX是兩條相對(duì)獨(dú)立 的調(diào)控途徑,LAS在REV的上游起作用,而 RAX 在CUC2的上游起作用,REV和CUC2又進(jìn)一步對(duì) 分

23、生組織標(biāo)記基因(STM)進(jìn)行調(diào)控,LAS和RAX 在功能上可能存在一定的互補(bǔ)4,12。由于植物中存在著多條調(diào)控腋生分生組織形成的途徑,NtLS基因被RNA干擾后,腋生分生組織的形成可能會(huì)從其 他途徑得到補(bǔ)償,本研究中,對(duì)于轉(zhuǎn)基因陽性煙草 的鑒定是在DNA水平的PCR檢測(cè),轉(zhuǎn)基因陽性植 株中NtLS基因在時(shí)空表達(dá)上的差異,還需進(jìn)一步 在RNA和蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行研究,并結(jié)合植株形 態(tài)觀察,以確定 NtLS基因的表達(dá)抑制效果及腋芽 發(fā)生的變化。 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihing House. Al rights reserv

24、ed, http:Anki.iidt第4期王衛(wèi)鋒等:煙草NtLS基因RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化# 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihing House. Al rights reserved, http:Anki.iidt37中國(guó)煙草科學(xué)2011年第32卷 1 *4-2012 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved,ki.iidt38中國(guó)煙草科學(xué)2011年第32卷XbjlkdnKpmXhdlF

25、midisdliignHi35s promolrXhol+ KpnlDigestionLigationintronKpnl4F-inorl 1pKANINIBAL*F6418 b pXh&l35s promoterHindIII+ XbaIDigestionLigationR-lnwrtHindlllintro hpKANNlBAL-FR6777 bpiKpnlj Finert35s promotes 忖計(jì)NotI DigestionarWEft2弓川oncokE!Ligation圖2 RNA 干擾表達(dá)載體 pART27-FR的構(gòu)建Fig.2 Construction of pART27-FR

26、 expression vector 1 *4-2012 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved,ki.iidt第4期王衛(wèi)鋒等:煙草NtLS基因RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化391 2 3 4 5 6 7 M388 bp411 bp圖3轉(zhuǎn)化煙草幼苗的檢測(cè)Fig.3 Electrophoresis testing of PCR amplification afterseedling transformation注:1: W38 , 26 :轉(zhuǎn)化煙草幼苗,7: pAR

27、T27-FR , M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) Marker I (北京全式金公司)參考文獻(xiàn)1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所.中國(guó)煙草栽培學(xué)M.上海:上??茖W(xué)技術(shù)岀版社,2005.2 陳德鑫,王鳳龍,楊清林,等.煙草抑芽劑及其使用方 法J.煙草科技,2003 (6): 46-48.3 Schumacher K, Schmitt T, Rossberg M, et al. The Lateral suppressor (Ls) gene of tomato encodes a new member of the VHIID protein familyJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96: 290-295.4 Greb T, Clarenz O, Schafer E, et al. Molecular analysis ofthe LATERAL SUPPRESSOR gene in Arabidopsis reveals a conserved control mechanism for axillary meristem formation J. Genes Dev, 2003, 17: 1175-1187.5 Li X, Qian Q, Fu Z, et al. Control of tillering in riceJ.Nature,

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