游離氨基酸總量的測(cè)定

1、植物體內(nèi)游離氨基酸總量的測(cè)定方法一：一、原理游離氨基酸的氨基可與水合茚三酮反響， 產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物， 其顏色的深淺 與游離氨基酸的含量成正比。二、儀器設(shè)備分光光度計(jì)；電子天平；容量瓶 25ml 或 50ml 3 個(gè)；漏斗直徑 6 厘米 3 個(gè)、濾紙適量；20ml刻度試管7支；移液管0.5ml 3支、5ml 1支；試管 架；玻棒；吸耳球；剪刀；移液管架；橡皮筋、塑料薄膜封試管口 ；吸 水紙；擦鏡紙適量；電爐；水浴鍋含鐵絲筐 。三、試劑1. 3% 茚三酮試劑稱 3g 茚三酮用 95%乙醇溶解定容到 100ml 容量瓶里，貯于棕色瓶中。此試 劑應(yīng)放在冷涼處，不宜久放，使用期約 10 天。2. 氰酸鹽

2、緩沖液按以下方法配制 ：1NaCN±備液 0.01mol/L 490mg心。2醋酸緩沖液：稱360g醋酸鈉含三分子結(jié)晶水溶于約300ml無氨蒸 餾水中，加 66.67ml 冰醋酸再用無氨蒸餾水稀釋至 1L。取溶液120ml，用溶液2定容到1L。3. 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸精確稱取在80°C下烘干的亮氨酸13.1mg或ay mol，或氨基氮7卩g。4. 95% 乙醇；異丙醇分析純 。四、操作步驟1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取20ml刻度試管18支，按下表1參加各試劑。加完試劑后混勻，在100C水浴中加熱12min加熱時(shí)封口，取出在冷水中迅 速冷卻，立即于每管中參加 5ml 95%乙醇，塞好塞子，

3、猛搖試管，使加熱時(shí) 形成的紅色產(chǎn)物被空氣中的氧所氧化而褪色，此時(shí)溶液呈藍(lán)紫色。于 570nm 波長(zhǎng)下測(cè)其光密度以空白管為參比 ，以氨基酸濃度為橫坐標(biāo)，光密度為 縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。2. 樣品提取 選取有代表性的植物葉片 或其它組織，洗凈擦干， 剪碎 混勻，迅速稱取0.100.20g視氨基酸含量多少而定，共稱3份，分別加 入20ml刻度試管中，再加蒸餾水10ml蓋塞或系上塑料薄膜，置沸水浴 中 20min 以提取游離氨基酸， 到時(shí)取出在自來水中冷卻， 把上清液濾入 25ml 容量瓶中，之后再往試管中加5ml蒸餾水，置沸水浴上再加熱10min，過濾 并反復(fù)沖洗殘?jiān)?，最后定容至刻度?/p>

4、搖勻。3. 樣品測(cè)定 另取 4支潔凈枯燥的試管，其中 3支分別參加 0.5ml 提取 液,另一支加0.5ml蒸餾水，然后在上述4支試管中分別參加NaCh緩沖液、 水合茚三酮各0.5ml，加完試劑后蓋塞，置沸水浴上加熱 12min，冷卻后， 再分別加5ml 95匯醇，搖勻，以空白作參比，在波長(zhǎng)570nm下測(cè)其光密度。根據(jù)光密度查標(biāo)準(zhǔn)曲線 或用回歸方程計(jì)算 即可求出提取液中氨基酸的濃 度。方法二：一、原理游離氨基酸的氨基可與水合茚三酮反響， 產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物， 其顏色的深淺 與游離氨基酸的含量成正比。二、儀器設(shè)備分光光度計(jì)；電子天平；容量瓶 25ml 或 50ml 3 個(gè)；漏斗直徑 6 厘米 3

5、個(gè)、濾紙適量； 20ml 刻度試管 7 支；移液管 0.5ml 3 支、 5ml 1 支；試管架；玻棒；吸耳球；剪刀；移液管架；橡皮筋、塑料薄膜封試管口；吸水紙；擦 鏡紙適量；電爐；水浴鍋含鐵絲筐。三、試劑1. 3% 茚三酮試劑稱 3g 茚三酮用 95%乙醇溶解定容到 100ml 容量瓶里，貯于棕色瓶中。 此試 劑應(yīng)放在冷涼處，不宜久放，使用期約 10 天。2. 氰酸鹽緩沖液 按以下方法配制：1NaCN 貯備液 0.01mol/L 490mg/L 。2醋酸緩沖液：稱 360g 醋酸鈉含三分子結(jié)晶水溶于約 300ml 無氨 蒸餾水中，加 66.67ml 冰醋酸再用無氨蒸餾水稀釋至 1L。取溶液1

6、20ml，用溶液2定容到1L。3. 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸精確稱取在80 °C下烘干的亮氨酸13.1mg或a丙氨酸8.9mg丨溶于10% 的異丙醇中，并在 100ml 容量瓶中用 10%異丙醇稀釋至刻度，混勻，即為 1mm ol/L 的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸貯備液，置冰箱中保存。為了制備工作液，可取貯備液與等量 無氨蒸餾水混合，此液濃度為0.5mmol/L ,艮卩1ml含氨基酸0.5卩moj或氨基氮 7 ug4. 95%乙醇；異丙醇分析純 。四、操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取20ml刻度試管18支，按下表1參加各試劑。加完 試劑后混勻，在100 C水浴中加熱12min加熱時(shí)封口，取出在冷水中迅速冷 卻，立即

7、于每管中參加5ml 95%乙醇，塞好塞子，猛搖試管，使加熱時(shí)形成的 紅色產(chǎn)物被空氣中的氧所氧化而褪色，此時(shí)溶液呈藍(lán)紫色。于570nm波長(zhǎng)下測(cè)其光密度以空白管為參比，以氨基酸濃度為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。表1各試管參加試劑量營(yíng)號(hào)I-J衣7LM2茹口16.11碗翼譽(yù)警tnl0 I0.50無更応他.酬0l403020.1C0.5酩一靳豔昭円常旳.030550.505勒即三鵝眉囁畑10.50.5CJ0 JOJ0.C50!OilS2302樣品提取 選取有代表性的植物葉片或其它組織，洗凈擦干，剪碎混勻，迅速稱取0.10視氨基酸含量多少而定，共稱 3份，分別參加20ml 刻度試

8、管中，再加蒸餾水10ml蓋塞或系上塑料薄膜，置沸水浴中20min以 提取游離氨基酸，至叩寸取出在自來水中冷卻，把上清液濾入 25ml容量瓶中，之 后再往試管中加5ml蒸餾水，置沸水浴上再加熱10min，過濾并反復(fù)沖洗殘?jiān)?最后定容至刻度，搖勻3樣品測(cè)定 另取4支潔凈枯燥的試管，其中3支分別參加0.5ml提取液, 另一支加0.5ml蒸餾水，然后在上述4支試管中分別參加NaCN緩沖液、水合 茚三酮各0.5ml，加完試劑后蓋塞，置沸水浴上加熱 12min，冷卻后，再分別加 5ml 95%乙醇，搖勻，以空白作參比，在波長(zhǎng) 570nm下測(cè)其光密度。根據(jù)光密度查標(biāo)準(zhǔn)曲線或用回歸方程計(jì)算即可求出提取液中氨基酸的濃 度。4. 計(jì)算游離氨基酸含量CxTk14(NH2if式中