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1、植物體內(nèi)游離氨基酸總量的測定方法一:一、原理游離氨基酸的氨基可與水合茚三酮反響, 產(chǎn)生藍紫色化合物, 其顏色的深淺 與游離氨基酸的含量成正比。二、儀器設備分光光度計;電子天平;容量瓶 25ml 或 50ml 3 個;漏斗直徑 6 厘米 3 個、濾紙適量;20ml刻度試管7支;移液管0.5ml 3支、5ml 1支;試管 架;玻棒;吸耳球;剪刀;移液管架;橡皮筋、塑料薄膜封試管口 ;吸 水紙;擦鏡紙適量;電爐;水浴鍋含鐵絲筐 。三、試劑1. 3% 茚三酮試劑稱 3g 茚三酮用 95%乙醇溶解定容到 100ml 容量瓶里,貯于棕色瓶中。此試 劑應放在冷涼處,不宜久放,使用期約 10 天。2. 氰酸鹽
2、緩沖液按以下方法配制 :1NaCN±備液 0.01mol/L 490mg心。2醋酸緩沖液:稱360g醋酸鈉含三分子結晶水溶于約300ml無氨蒸 餾水中,加 66.67ml 冰醋酸再用無氨蒸餾水稀釋至 1L。取溶液120ml,用溶液2定容到1L。3. 標準氨基酸精確稱取在80°C下烘干的亮氨酸13.1mg或ay mol,或氨基氮7卩g。4. 95% 乙醇;異丙醇分析純 。四、操作步驟1. 標準曲線的制作取20ml刻度試管18支,按下表1參加各試劑。加完試劑后混勻,在100C水浴中加熱12min加熱時封口,取出在冷水中迅 速冷卻,立即于每管中參加 5ml 95%乙醇,塞好塞子,
3、猛搖試管,使加熱時 形成的紅色產(chǎn)物被空氣中的氧所氧化而褪色,此時溶液呈藍紫色。于 570nm 波長下測其光密度以空白管為參比 ,以氨基酸濃度為橫坐標,光密度為 縱坐標,繪制標準曲線,求出直線方程。2. 樣品提取 選取有代表性的植物葉片 或其它組織,洗凈擦干, 剪碎 混勻,迅速稱取0.100.20g視氨基酸含量多少而定,共稱3份,分別加 入20ml刻度試管中,再加蒸餾水10ml蓋塞或系上塑料薄膜,置沸水浴 中 20min 以提取游離氨基酸, 到時取出在自來水中冷卻, 把上清液濾入 25ml 容量瓶中,之后再往試管中加5ml蒸餾水,置沸水浴上再加熱10min,過濾 并反復沖洗殘渣,最后定容至刻度,
4、搖勻。3. 樣品測定 另取 4支潔凈枯燥的試管,其中 3支分別參加 0.5ml 提取 液,另一支加0.5ml蒸餾水,然后在上述4支試管中分別參加NaCh緩沖液、 水合茚三酮各0.5ml,加完試劑后蓋塞,置沸水浴上加熱 12min,冷卻后, 再分別加5ml 95匯醇,搖勻,以空白作參比,在波長570nm下測其光密度。根據(jù)光密度查標準曲線 或用回歸方程計算 即可求出提取液中氨基酸的濃 度。方法二:一、原理游離氨基酸的氨基可與水合茚三酮反響, 產(chǎn)生藍紫色化合物, 其顏色的深淺 與游離氨基酸的含量成正比。二、儀器設備分光光度計;電子天平;容量瓶 25ml 或 50ml 3 個;漏斗直徑 6 厘米 3
5、個、濾紙適量; 20ml 刻度試管 7 支;移液管 0.5ml 3 支、 5ml 1 支;試管架;玻棒;吸耳球;剪刀;移液管架;橡皮筋、塑料薄膜封試管口;吸水紙;擦 鏡紙適量;電爐;水浴鍋含鐵絲筐。三、試劑1. 3% 茚三酮試劑稱 3g 茚三酮用 95%乙醇溶解定容到 100ml 容量瓶里,貯于棕色瓶中。 此試 劑應放在冷涼處,不宜久放,使用期約 10 天。2. 氰酸鹽緩沖液 按以下方法配制:1NaCN 貯備液 0.01mol/L 490mg/L 。2醋酸緩沖液:稱 360g 醋酸鈉含三分子結晶水溶于約 300ml 無氨 蒸餾水中,加 66.67ml 冰醋酸再用無氨蒸餾水稀釋至 1L。取溶液1
6、20ml,用溶液2定容到1L。3. 標準氨基酸精確稱取在80 °C下烘干的亮氨酸13.1mg或a丙氨酸8.9mg丨溶于10% 的異丙醇中,并在 100ml 容量瓶中用 10%異丙醇稀釋至刻度,混勻,即為 1mm ol/L 的標準氨基酸貯備液,置冰箱中保存。為了制備工作液,可取貯備液與等量 無氨蒸餾水混合,此液濃度為0.5mmol/L ,艮卩1ml含氨基酸0.5卩moj或氨基氮 7 ug4. 95%乙醇;異丙醇分析純 。四、操作步驟1.標準曲線的制作 取20ml刻度試管18支,按下表1參加各試劑。加完 試劑后混勻,在100 C水浴中加熱12min加熱時封口,取出在冷水中迅速冷 卻,立即
7、于每管中參加5ml 95%乙醇,塞好塞子,猛搖試管,使加熱時形成的 紅色產(chǎn)物被空氣中的氧所氧化而褪色,此時溶液呈藍紫色。于570nm波長下測其光密度以空白管為參比,以氨基酸濃度為橫坐標,光密度為縱坐標,繪制 標準曲線,求出直線方程。表1各試管參加試劑量營號I-J衣7LM2茹口16.11碗翼譽警tnl0 I0.50無更応他.酬0l403020.1C0.5酩一靳豔昭円常旳.030550.505勒即三鵝眉囁畑10.50.5CJ0 JOJ0.C50!OilS2302樣品提取 選取有代表性的植物葉片或其它組織,洗凈擦干,剪碎混勻,迅速稱取0.10視氨基酸含量多少而定,共稱 3份,分別參加20ml 刻度試
8、管中,再加蒸餾水10ml蓋塞或系上塑料薄膜,置沸水浴中20min以 提取游離氨基酸,至叩寸取出在自來水中冷卻,把上清液濾入 25ml容量瓶中,之 后再往試管中加5ml蒸餾水,置沸水浴上再加熱10min,過濾并反復沖洗殘渣, 最后定容至刻度,搖勻3樣品測定 另取4支潔凈枯燥的試管,其中3支分別參加0.5ml提取液, 另一支加0.5ml蒸餾水,然后在上述4支試管中分別參加NaCN緩沖液、水合 茚三酮各0.5ml,加完試劑后蓋塞,置沸水浴上加熱 12min,冷卻后,再分別加 5ml 95%乙醇,搖勻,以空白作參比,在波長 570nm下測其光密度。根據(jù)光密度查標準曲線或用回歸方程計算即可求出提取液中氨基酸的濃 度。4. 計算游離氨基酸含量CxTk14(NH2if式中
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