2022年水中大腸菌群的培養(yǎng)

1、實驗三 水中大腸菌群的檢測多管發(fā)酵法一、 實驗目的1. 了解飲用水和水源水大腸菌群的原理和意義。2學習檢測水中大腸菌群的方法。二、實驗原理1.相關性大腸菌群是評價水質好壞的一個重要的衛(wèi)生指標，也是反映水體被生活污水污染的一項重要監(jiān)測工程。大腸菌群是一群以大腸埃希氏菌Escherichiacoli為主的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，在37生長時，能在48小時內發(fā)酵乳糖并產酸產氣。我國生活飲用水衛(wèi)生標準中規(guī)定一升水樣中總大腸菌群數(shù)不超過三個。大腸桿菌能發(fā)酵多種糖類產酸、產氣，是人和動物腸道中的正常棲居菌，嬰兒出生后即隨哺乳進入腸道，與人終身相伴，其代謝活動能抑制腸道內分解蛋白質的微生物生長

2、，減少蛋白質分解產物對人體的危害，還能合成維生素B和K，以及有殺菌作用的大腸桿菌素。大腸菌群細菌多存在于溫血動物糞便、人類經(jīng)?；顒拥膱鏊约坝屑S便污染的地方，人、畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為主，而外界環(huán)境中那么以大腸菌群其他型別較多。水體中的病原微生物常因數(shù)量較少而難以檢出，即使檢出結果為陰性，也不能保證無病原微生物存在；同時檢出手續(xù)也很復雜。所以，在實際工作中常借用檢查水體中有無“指示菌存在及其數(shù)量多少來判定水質是否被污染。大腸桿菌是人和許多動物腸道中最主要且數(shù)量最多的一種細菌，國家規(guī)定，每升飲用水中大腸桿菌數(shù)不應超過3個。大腸菌群是作為糞

3、便污染指標提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數(shù)的上下，說明了糞便污染的程度，也反映了對人體安康危害性的大小。因而食品中有糞便污染，那么可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體安康具有潛在的危險性。大腸菌群是評價食品衛(wèi)生質量的重要指標之一，目前已被國內外廣泛應用于食品衛(wèi)生工作中2.檢測平安大腸桿菌作為外源基因表達的宿主,遺傳背景清楚,技術操作簡單,培養(yǎng)條件簡單,大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟,倍受遺傳工程專家的重視.目前大腸桿菌是應用最廣泛,最成功的表達體系,常做高效表達的首選體系。3.抗逆性因為水中致病性的治病菌比擬少，同時飲

4、用水中的大腸桿菌的數(shù)量也是較少的，而大腸菌群與治病菌的抗逆性一樣，所以檢測大腸桿菌就能反響出水樣的質量。4. 數(shù)理統(tǒng)計通過對某些現(xiàn)象的頻率的觀察來發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象的內在規(guī)律性，并作出一定準確程度的判斷和預測；將這些研究的某些結果加以歸納整理，逐步形成一定的數(shù)學概型，這就是數(shù)理統(tǒng)計的原理。就本次實驗來講，15支培養(yǎng)液中其中有三類，5支裝入的10ml水樣，5支裝入1ml水樣，5支裝入0.1ml水樣，通過培養(yǎng)后，看各個種類的培養(yǎng)液中顯示為陽性黃色的有幾支，通過這些數(shù)據(jù)和報告中的表格，可算出每100ml水樣中細菌的可能數(shù)。如果連0.1ml水樣的5支均為黃色時，可取水樣稀釋100倍后，再求出大腸桿菌的可能數(shù)。

5、5.微生物的代謝能量代謝是微生物新陳代謝的核心。絕大多數(shù)的微生物是異養(yǎng)生物，它們利用有機物作能源，通過生物氧化以及與此相連的氧化磷酸酸化或底物水平磷酸化反響形成ATP。生物氧化必須經(jīng)歷脫氧，遞氫和受氫三個階段，并按其最終氫受體的性質而分為呼吸，無氧呼吸或發(fā)酵三種。呼吸的產能效率最高，無氧呼吸次之，發(fā)酵那么最低?；茏责B(yǎng)微生物因利用無機物的氧化取得ATP，故不但產生的能量少，而且還須通過能耗大的逆呼吸鏈反響產生固定C02所必須的復原力，因此它們的生長緩慢，生長得效率低。光能自養(yǎng)微生物可以通過循環(huán)光合磷酸化(如厭氧菌的光合細菌)，非循環(huán)光合磷酸化如產氧的藍細菌或紫膜光合磷酸化取得ATP。微生物所特

6、有的合成代謝途徑種類繁多，最重要且有代表性的是C02的自養(yǎng)固定，生物固氮，細胞壁肽聚糖和微生物次生代謝物的生物合成。微生物的代謝調節(jié)具有可塑性強，靈敏度高和反響準確等特點，主要有調節(jié)酶合成量的酶誘導，阻遏機制和調節(jié)現(xiàn)成酶催化活力的激活和抑制尤其是反響抑制機制兩類。6.多管發(fā)酵法多管發(fā)酵法包括初發(fā)酵試驗、平板別離和復發(fā)酵試驗三個局部。發(fā)酵管內裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并倒置一德漢氏小套管。乳糖能起選擇作用，因為很多細菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產酸產氣。 初發(fā)酵試驗水樣接種于發(fā)酵管內，37下培養(yǎng)，24小時內小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基混濁，顏色改變，說明水中存在大腸菌群，為陽性結果。

7、48小時后仍不產氣的為陰性結果。 平板別離初發(fā)酵管24至48小時內產酸產氣的均需在復紅亞硫酸鈉瓊脂遠藤氏培養(yǎng)基或伊紅美藍瓊脂，平板上劃線別離菌落。 復發(fā)酵試驗以上大腸菌群陽性菌落，經(jīng)涂片染色為革蘭氏陰性無芽孢桿菌者，通過此試驗再進一步證實。原理與初發(fā)酵試驗一樣，經(jīng)24小時培養(yǎng)產酸產氣的，最后確定為大腸菌群陽性結果。三、實驗器材1. 水樣自來水，中心湖水稀釋20倍，行政樓旁邊水塘的水稀釋50倍2試劑乳糖蛋白胨發(fā)酵管內有倒置小套管，三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管瓶內有倒置小套管，伊紅美藍或復紅亞硫酸鈉瓊脂平板。3 儀器及其它用品4 滅菌帶玻璃塞空瓶，滅菌移液槍，帶塞滅菌試管。四、實驗方法1 水樣的采取水

8、源水大學城中心湖的水，廣工行政樓旁邊水塘的水。21初發(fā)酵試驗。取16支發(fā)酵管，其中10支用移液管參加10mL一倍的乳酸蛋白胨培養(yǎng)液，5支參加5mL三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，1支參加9mL自然水。完成后包裝好，于121高壓滅菌鍋中滅菌30min左右。冷卻后，在無菌操作條件下，向裝有三倍的乳酸蛋白胨培養(yǎng)液的5支試管參加10mL水樣，向裝有一倍的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5支試管中參加1mL水樣，向裝有一倍的乳酸蛋白胨培養(yǎng)液的另5支試管中參加1mL10-1水樣。 將各試管充分混均，置于37恒溫箱中培養(yǎng)24h。注：本次實驗沒有經(jīng)過平板別離和復發(fā)酵試驗。水樣總量：55.5ml(5管10ml水樣，5管0.1ml水樣，

9、5管0.1 1:10稀釋水樣時，不同陽性和陰性情況下100ml水樣中細菌的最可能數(shù)和95%可信限度值)五、實驗結果1本次實驗的所有試管都變成黃色，并且都產酸產氣。查表得每升水源水樣中大腸菌群數(shù)大于2400。本次試驗用來稀釋的水是自來水，雖然說自來水中的大腸菌群數(shù)量很少，但是水樣中大腸菌群并不是均勻分布的，沒有滅菌會帶來誤差。實驗并沒有在超凈實驗臺上進展，空氣中的微生物干擾很大。沒有經(jīng)過平板別離和復發(fā)酵操作，實驗結果可信性降低了。但本次試驗操作大體來說還是正確的，而且水樣經(jīng)過稀釋之后試管的顏色變化很大，證明培養(yǎng)基里的大腸菌群存在比擬多，所以中心湖的水污染比擬嚴重，需要適宜的治理。六、思考題1為什么要選擇大腸菌群作為水源被腸道病原菌污染的指示菌？答：原因主要有：1、大腸菌群的來源比擬單一，主要來自于人體和動物的糞便當中，而且在自然界中容易死亡。與人體內致病細菌來源有很大相關性。2、大腸菌群與致病菌的抗逆性一直，在自然界中致病菌與大腸菌群的存活機率是一致的。3、大腸菌群檢測簡易，所得結果可靠。4、致病菌相比照擬難測量。5、樣品檢測大腸菌群常有，致病不常有。內容總結1實驗三 水中大腸菌群的檢測