蛋白質提取與制備的原理和方法

1、白蛋白 和球蛋白 :被 50%飽和度硫酸銨析出。 真球蛋白 : 入少量的鹽、酸、堿那么可溶解。 擬球蛋白 :析出 醇溶蛋白 : 及無水乙醇 殼蛋白 : 稀鹽酸，易溶于稀酸、稀堿溶液 精蛋白 :沉淀 組蛋白 : 沉淀 硬蛋白質 :蛋白質提取與制備的原理和方法蛋白質提取與制備蛋白質種類很多，性質上的差異很大，既或是同類蛋 白質，因選用材料不同，使用方法差異也很大，且又處于不同的體系中，因此不 可能有一個固定的程序適用各類蛋白質的別離。 但多數(shù)別離工作中的關鍵局部基 本手段還是共同的，大局部蛋白質均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數(shù) 與脂類結合的蛋白質溶于乙醇、 丙酮及丁醇等有機溶劑中。 因此可

2、采用不同溶劑 提取、別離及純化蛋白質和酶。 蛋白質與酶在不同溶劑中溶解度的差異，主要取決于蛋白分子中非極性疏 水基團與極性親水基團的比例， 其次取決于這些基團的排列和偶極矩。 故分子結 構性質是不同蛋白質溶解差異的內因。 溫度、pH離子強度等是影響蛋白質溶解 度的外界條件。 提取蛋白質時常根據(jù)這些內外因素綜合加以利用。 將細胞內蛋白 質提取出來。 并與其它不需要的物質分開。 但動物材料中的蛋白質有些可溶性的 形式存在于體液如血漿、消化硫等中，可以不必經過提取直接進行別離。蛋 白質中的角蛋白、 膠原及絲蛋白等不溶性蛋白質， 只需要適當?shù)娜軇┫慈タ扇苄?的伴隨物，如脂類、糖類以及其他可溶性蛋白質，

3、 最后剩下的就是不溶性蛋白質。 這些蛋白質經細胞破碎后， 用水、稀鹽酸及緩沖液等適當溶劑， 將蛋白質溶解出 來，再用離心法除去不溶物，即得粗提取液。水適用于白蛋白類蛋白質的抽提。 如果抽提物的pH用適當緩沖液控制時，共穩(wěn)定性及溶解度均能增加。如球蛋白 類能溶于稀鹽溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢劑溶液如十二烷基硫酸鈉、洋地黃皂苷 Digitonin 溶液或有機溶劑 來抽提。其它不溶于水的蛋白質通常用稀堿溶液抽提。蛋白質類別和溶解性質溶于水及稀鹽、稀酸、稀堿溶液，可 一般在等電點時不溶于水，但加 溶于水，可為 50%飽和度硫酸銨 溶于7080聽醇中，不溶于水 在等電點不溶于水，也不溶于 溶于水和稀酸

4、，易在稀氨水中 溶于水和稀酸，易在稀氨水中 不溶于水、鹽、稀酸及稀堿綴合蛋白 包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、金屬蛋 白、黃素蛋白和氮苯蛋白等 :此類蛋白質溶解性質隨蛋白質與非蛋白質結合局部的不同而異，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀堿及鹽溶液中，脂蛋白如 脂肪局部露于外， 那么脂溶性占優(yōu)勢， 如脂肪局部被包圍于分子之中， 那么水溶性占 優(yōu)勢。蛋白質的制備是一項十分細致的工作。涉及物理學、化學和生物學的知識很廣。 近年來雖然有了不改良，但其主要原理仍不外乎兩個方面： 一是利用混合物中幾個組分分配率的差異， 把它們分配于可用機械方法別離的兩 個或幾個物相中，如鹽析、有機溶劑提

5、取、層析和結晶等； 二是將混合物置于單一物相中， 通過物理力場的作用使各組分分配于不同區(qū)域而 到達別離的目的， 如電泳、 超離心、超濾等。由于蛋白質不能溶化， 也不能蒸發(fā)， 所能分配的物相只限于固相和液相，并在這兩相間互相交替進行別離純化。 制備方法可按照分子大小、 形狀、 帶電性質及溶解度等主要因素進行分類。 按分 子大小和形態(tài)分為差速離心、超濾、分子篩及透析等方法；按溶解度分為鹽析、 溶劑抽提、分配層析、逆流分配及結晶等方法；按電荷差異分為電泳、電滲析、 等電點沉淀、離子交換層析及吸附層析等；按生物功能專一性有親合層析法等。由于不同生物大分子結構及理化性質不同， 別離方法也不一樣。 即同一

6、 類生物大分子由于選用材料不同， 使用方法差異也很大。 因此很難有一個統(tǒng)一標 準的方法對任何蛋白質均可循用。 因此實驗前應進行充分調查研究， 查閱有關文 獻資料， 對欲別離提純物質的物理、 化學及生物學性質先有一定了解， 然后再著 手進行實驗工作。 對于一個未知結構及性質的試樣進行創(chuàng)造性的別離提純時， 更 需要經過各種方法比擬和摸索， 才能找到一些工作規(guī)律和獲得預期結果。 其次在 別離提純工作前， 常須建立相應的分析鑒定方法， 以正確指導整個別離純化工作 的順利進行。 高度提純某一生物大分子， 一般要經過多種方法、 步驟及不斷變換 各種外界條件才能到達目的。 因此， 整個實驗過程方法的優(yōu)劣，

7、選擇條件效果的 好壞，均須通過分析鑒定來判明。另一方面，蛋白質常以與其他生物體物質結合形式存在， 因此也易與這 些物質結合， 這給別離精制帶來了困難。 如極微量的金屬和糖對巨大蛋白質的穩(wěn) 定性起決定作用， 假設被除去那么不穩(wěn)定的蛋白質結晶化的難度也隨之增加。 如頂峰 淀粉酶A的Ca2+,胰島素Zn2+等。此外，高分子蛋白質具有一定的立體構象， 相當不穩(wěn)定，如前所述極易變性、變構，因此限制了別離精制的方法。通常是根 據(jù)具體對象聯(lián)用各種方法。 為得到天然狀態(tài)的蛋白質, 盡量采用溫和的手段, 如 中性、低溫、防止起泡等,并還要注意防腐。注意共存成分的影響。 如蝮蛇粗毒的蛋白質水解酶活性很高, 在別離

8、純 化中需引起重視。純化蝮蛇神經毒素時，當室溫超過20C時，幾乎得不到神經毒素。蝮蛇毒中的蛋白水解酶能被 0.1mol/L EDTA完全抑制，因此在進行柱層析 前先將粗毒素0.1mol/LEDTA溶液處理，即使在室溫高于20C，仍能很好的得到 神經毒素。整個制備過程一般可分為 5 個階段： 材料的選擇和預處理 細胞的破碎有時需進行細胞器的別離 提取 純化包括鹽析，有機溶劑沉淀，有機溶劑提取、吸附、層析、超離心及結晶等 濃縮、枯燥及保存。以上5個階段不是要求每個方案都完整地具備，也不是每一階段截然分開。不管是哪一階段使用哪一種方法，均必須在操作中保存生物大分子結構的完整 性。保存活性防止變性及降

9、解現(xiàn)象的發(fā)生。 因空間結構主要依靠氫鍵、 鹽鍵和范 德華力的存在，遇酸、遇堿、高溫、劇烈的機械作用及強烈的輻射等均可導致活 性喪失。因此選擇的條件應為十分溫和。 同時應注意防止系統(tǒng)中重金屬離子、 細 胞自身酶系及其他有毒物質的污染。蛋白質提取與制備的注意事宜 :一、原料的選擇早年為了研究的方便， 盡量尋找含某種蛋白質豐富的器官從中提取蛋白 質。但至目前經常遇到的多是含量低的器官或組織且量也很小， 如下丘腦、 松果 體、細胞膜或內膜等原材料，因而對提取要求更復雜一些。原料的選擇主要依據(jù)實驗目的定。 從工業(yè)生產角度考慮， 注意選含量高、 來源豐富及本錢低的原料。 盡量要新鮮原料。 但有時這幾方面不

10、同時具備。 含量 豐富但來源困難， 或含量來源均理想， 但別離純化操作繁瑣， 反而不如含量略低 些易于獲得純品者。一般要注意種屬的關系，如鰹的心肌細胞色素C較馬的易結 晶，馬的血紅蛋白較牛的易結晶。 要事前調查制備的難易情況。 假設利用蛋白質的 活性，對原料的種屬應幾乎無影響。 如利用胰蛋白酶水解蛋白質的活性， 用豬或 牛胰臟均可。但假設研究蛋白質自身的性質及結構時，原料的來源種屬必須一定。 研究由于病態(tài)引起的特殊蛋白質本斯 . 瓊斯氏蛋白、貧血血紅蛋白時，不但 使用種屬一定的原料， 而且要取自同一個體的原料。 可能時盡量用全年均可采到 的原料。對動物生理狀態(tài)間的差異如饑餓時脂肪和糖類相對減少

11、，采收期及 產地等因素也要注意。二、前處理1、細胞的破碎材料選定通常要進行處理。 要剔除結締組織及脂肪組織。 如不能立即進 行實驗， 那么應冷凍保存。 除了提取及胞細外成分， 對細胞內及多細胞生物組織中 的蛋白質的別離提取均須先將細胞破碎， 使其充分釋放到溶液中。 不同生物體或 同一生物體不同的組織， 其細胞破壞難易不一， 使用方法也不完全相同。 如動物 胰、肝、腦組織一般較柔軟，作普通勻漿器磨研即可，肌肉及心組織較韌，需預 先絞碎再制成勻槳。機械方法主要通過機械切力的作用使組織細胞破壞。 常用器械有： 高速組織搗 碎機轉速可達lOOOOrpm,具高速轉動的鋒利的刀片，宜用于動物內臟組織 的破

12、碎；玻璃勻漿器用兩個磨砂面相互摩擦，將細胞磨碎，適用于少量材 料，也可用不銹鋼或硬質塑料等， 兩面間隔只有十分之幾毫米， 對細胞破碎程度 較高速搗碎機高， 機械切力對分子破壞較小。 小量的也可用乳缽與適當?shù)木彌_劑 磨碎提取， 也可加氧化鋁、 石英砂及玻璃粉磨細。 但在磨細時局部往往生熱導致 變性或pH顯著變化，尤其用玻璃粉和氧化鋁時。磨細劑的吸附也可導致?lián)p失。 物理方法主要通過各種物理因素的作用，使組織細胞破碎的方法。I反復凍融法于冷藏庫或干冰反復于零下1520 C使之凍固，然后緩慢地融解，如 此反復操作， 使大局部細胞及細胞內顆粒破壞。 由于滲透壓的變化， 使結合水凍 結產生組織的變性，冰片

13、將細胞膜破碎，使蛋白質可溶化，成為粘稠的濃溶液， 但脂蛋白凍結變性。U冷熱變替法將材料投入沸水中，于90C左右維持數(shù)分鐘，立即置于冰浴中使之迅 速冷卻，絕大局部細胞被破壞。川超聲波法暴露于910千周聲波或10500千周超聲波所產生的機械振動，只要 有設備該法方便且效果也好， 但一次處理量較小。 應用超聲波處理時應注意防止 溶液中氣泡的存在。處理一些超聲波敏感的蛋白質酶時宜慎重。W加壓破碎法加一定氣壓或水壓也可使細胞破碎?；瘜W及生物化學方法I有機溶媒法粉碎后的新鮮材料在0°C以下參加510倍量的丙酮，迅速攪拌均勻， 可破碎細胞膜， 破壞蛋白質與脂質的結合。 蛋白質一般不變性， 被脫脂和

14、脫水成 為枯燥粉末。用少量乙醚洗，經濾紙枯燥，如脫氫酶等可保存數(shù)月不失去活性。 U自溶法將待破碎的鮮材料在一定pH和適當?shù)臏囟认?，利用自身的蛋白酶將?胞破壞，使細胞內含物釋放出來。比擬穩(wěn)定，變性較難，蛋白質不被分解而可溶 化。利用該法可從胰臟制取羧肽酶。自體融解時需要時間，需加少量甲苯、氯仿 等。應防止細菌污染。于溫室30C左右較早溶化。自體融解過程中PH顯著變化， 隨時要調節(jié)pHo自溶溫度選在04C,因自溶時間較長，不易控制，所以制備 活性蛋白質時較少用。川酶法與前述的自體融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去變性蛋白質。 但值得 提出的是溶菌酶處理時，它能水解構成枯草菌等菌體膜的多糖類。 能溶

15、解菌的酶 分布很廣。尤其卵白中含量高，而多易結晶化。1g菌體加110mg溶菌酶，pH6.27.01h內完全溶菌。于生理食鹽水或 0.2mol蔗糖溶液中溶菌，雖失去細 胞膜，但原形質沒有脫出。 除溶菌酶外， 蝸牛酶及纖維素酶也常被選為破壞細菌 及植物細胞用。外表活性劑處理較常用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基吡淀及去氧膽酸鈉等。 此外一些細胞膜較脆弱的細胞， 可把它們置于水或低滲緩沖劑中透析將 細胞脹破。2、細胞器的別離制備某一種生物大分子需要采用細胞中某一局部的材料， 或者為了純化 某一特定細胞器上的生物大分子， 防止其他細胞組分的干擾， 細胞破碎后常將細 胞內各組分先行別離， 對于制備一些難

16、度較大需求純度較高的生物大分子是有利 的。尤其近年來分子生物學、分子遺傳學、遺傳工程等學科和技術的開展，對分 布在各種細胞器上的核酸和蛋白質的研究工作日益增多， 別離各種細胞器上的各 類核酸和特異性蛋白質已成為生物大分子制備工作重要內容之一。 各類生物大分 子在細胞內的分布是不同的。DNA幾乎全部集中在細胞核內。RNA那么大局部分布 于細胞質。 各種酶在細胞內分布也有一定位置。 因此制備細胞器上的生物大分子 時，預先須對整個細胞結構和各類生物大分子在細胞內分布匹有所了解。 以肝細胞為例 , 蛋白質、酶及核酸在肝細胞內分布情況為 : 細胞核：精蛋白、組蛋白、核酸合成酶系RNA占總量10流右DNA

17、 幾乎全部粒線體 : 電子傳遞、氯化磷酸化、三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化、氨基酸氧化、 脲合成等酶系 RNA占總量5流右DNA微量內質網微粒體：蛋白質合成酶系、羥化酶系RNA占總量50%左右溶酶體 :水解酶系 包括核酸酶、 磷酸脂酶、 組織蛋白酶及糖苷及糖苷酶等高爾基氏體 ： 糖苷轉移酶、粘多糖及類固醇合成酶系細胞膜：載體與受體蛋白、特異抗蛋、ATP酶、環(huán)化腺苷酶、5'-核苷酸酶、琥珀酸脫氫酶、葡萄糖-6- 磷酸酶等 , 細胞液 嘧啶和嘌呤代謝、 氨基酸合成酶系、 可溶 性蛋白類 RNA主要為tRNA占總量30%.細胞器的別離一般采用差速離心法。 細胞經過破碎后， 在適當介質中進行差速離 心

18、。利用細胞各組分質量大小不同， 沉降于離心管內不同區(qū)域， 別離后即得所需 組分。細胞器的別離制備、介質的選擇十分重要。最早使用的介質是生理鹽水。 因它容易使亞細胞顆粒發(fā)生聚集作用結成塊狀， 沉淀別離效果不理想， 現(xiàn)一般改 用蔗糖、 Ficoll 一種蔗糖多聚物或葡萄糖 -聚乙二醇等高分子溶液。1. 水溶液提取大局部蛋白質均溶于水、 稀鹽、 稀堿或稀酸溶液中。 因此蛋白質的提取 一般以水為主。 稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質穩(wěn)定性好、 溶度大，也是提取蛋白 質的最常用溶劑。以鹽溶液及緩沖液提取蛋白質經常注意下面幾個因素。 鹽濃度等滲鹽溶液尤以0.020.05mol/L磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用。

19、 0.15mol/L 氯化鈉溶液應用也較多。如 6-磷酸葡萄糖脫氫酶用 0.1mol/L 碳酸氫 鈉液提取等。有時為了螯合某些金屬離子和解離酶分子與其他雜質的靜電結合， 也常使用枸櫞酸鈉緩沖液和焦磷酸鈉緩沖液。有些蛋白質在低鹽濃度下濃度低， 如脫氧核糖核蛋白質需用 1mol/L 以上氯化鈉液提取?？傊灰苋芙庠谒?液中而與細胞顆粒結合不太緊密的蛋白質和酶， 細胞破碎后選擇適當?shù)柠}濃度及 PH 一般是不難提取的。只有某些與細胞顆粒上的脂類物質結合較緊的，需采用 有機溶劑或參加外表活性劑處理等方法提取。PH值蛋白質提取液的PH值首先應保證在蛋白質穩(wěn)定的范圍內，即選擇在偏 離等電點兩側。 如堿

20、性蛋白質那么選在偏酸一側， 酸性蛋白質選擇偏堿一側， 以增 大蛋白質的溶解度，提高提取效果。如細胞色素C屬堿性蛋白質，常用稀酸提取， 肌肉甘油醛 -3- 磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質，用稀堿提取。某些蛋白質或酶與其分 物質結合常以離子鍵形式存在，選擇 PH3-6范圍對于別離提取是有利的。 溫度多數(shù)酶的提取溫度在5C以下。少數(shù)對溫度耐受性較高的蛋白質和酶， 可適當提高溫度， 使雜蛋白變性別離且也有利于提取和進一步純化。 如胃蛋白酶 等及許多多肽激素類，選擇3750C條件下提取，效果比低溫提取更好。此外提取酶時參加底物或輔酶， 改變酶分子外表電荷分布， 也能促進提 取效果。2. 有機溶劑提取有機溶劑提取

21、用于提取蛋白質的實例至今是不多的。 但一些和脂結合較牢或分子中非極性側鏈較多的蛋白質， 不溶于水、 稀鹽或稀堿液中， 可用不同比例的 有機溶劑提取。從一些粒線體Mitochondria 及微粒體Microsome等含多 量脂質物質中提取蛋白質時，采用 Morton 的丁醇法效果較好。因丁醇使蛋白質 的變性較少，親脂性強，易透入細胞內部，與水也能溶解10%，因此具有脂質與水之間的外表活性作用， 可占據(jù)蛋白質與脂質的結合點， 也阻礙蛋白質與脂質的 再結合，使蛋白質在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣pHA 10，溫度-2C至40C。國內用該法曾成功地提取了琥珀酸脫氫酶。 丁醇

22、法對提取堿性磷酸脂酶效果也是十分顯著的。 胰島素既能溶于稀酸、 稀堿又 能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以 6070%的酸性乙醇提取效果最好，一方面可 抑制蛋白質水解酶對胰島素的破壞，同時也到達大量除去雜蛋白的目的。3. 外表活性劑的利用對于某些與脂質結合的蛋白質和酶， 也有采用外表活性劑如膽酸鹽及十 二烷基磺酸鈉等處理。外表活性劑有陰離子型如脂肪酸鹽、烷基苯磺酸鹽及膽酸鹽等，陽 離子型如氧化芐烷基二甲基銨等及非離子型 Triton X-100 、 TirtonX-1 14、吐溫60及吐溫 80等。非離子型外表活性劑比離子型溫和，不易引起酶失活， 使用較多。 對于膜結構上的脂蛋白和結構， 己廣泛采

23、用膽酸鹽 處理，兩者形成復合物，并帶上凈電荷，由于電荷再排斥作用使膜破裂。近年來 研究膜蛋白使用外表活性劑的稀溶液提取時，較喜歡用非離子型外表活性劑。4. 對提取物的保護在各種細胞中普遍存在著蛋白水解酶， 提取時要注意防止由它引起的水 解。前面所講的降低提取溫度其目的之一也是防止蛋白水解酶的水解。 多數(shù)蛋白 水解酶的最適PH在35或更高些，因在較低PH條件下可降低蛋白質水解酶引 起的破壞程度。低pH可使許多酶的酶原在提取過程中不致激活而保存在酶原狀 態(tài)，不表現(xiàn)水解活力。 加蛋白質水解酶的抑制劑也同樣起保護作用， 如以絲氨酸 為活性中心的酶加二異丙基氟磷酸， 以巰基為中心的酶加對氯汞苯甲酸等。

24、提取 溶液中加有機溶劑時也能產生相類似的作用。 蛋白水解酶的性質變化很大， 上述 條件均視具體對象而變化。有一些蛋白含巰基， 這些巰基可能是活性所必需。 在提取這種蛋白不要 帶入金屬離子和氧化劑。前者可往提取液中加金屬螯合劑如 EDTA后者可參加 復原劑如抗壞血酸。 有某些蛋白質帶一些非共價鍵結合的配基。 提取時要注意保 護，不要使酸基喪失。蛋白質提取與制備的方法 :1. 別離純化的原那么從破碎材料或細胞器提出的蛋白質是不純的， 需進一步純化。 純化包括 將蛋白質與非蛋白質分開， 將各種不同的蛋白質分開。 選擇提取條件時， 就要考 慮盡量除去非蛋白質。 一般總是有其它物質伴隨混入提取液中。 但

25、有些雜質如 脂肪以事先除去為宜。先除去便于以后操作。常用有機溶劑提取除去。對于異類物質， 提純蛋白質和酶時?；煊泻怂峄蚨嗵?， 一般可用專一性 酶水解，有機溶劑抽取及選擇性局部沉淀等方法處理。 小分子物質常在整個制備 過程中通過屢次液相與固相轉化中被別離或最后用透析法除去。 而對同類物質如 酶與雜蛋白、RNA DNA以及不同結構的蛋白質、酶、核酸之間產別離，情況那么 復雜得多。 主要采用的方法有鹽析法、 有機溶劑沉淀法， 等電點沉淀法、 吸附法、 結晶法、電泳法、超離心法及柱層析法等。其中鹽析法、等電點法及結晶法用于 蛋白質和酶的提純較多， 有機溶劑抽提和沉淀用于核提純較多， 柱層析法、 梯度

26、離心法對蛋白質和核酸的提純應用十分廣泛。 如前所述，蛋白質的別離純化較難， 而且其本身的性質又限制了某些方法的使用， 因此要研究目的物的微細特征， 巧 妙的聯(lián)用各種方法并進行嚴密的操作， 同時有必要了解精制各過程的精制程度和 回收率。具有活性的蛋白質可利用吸收光譜等物理性質或以相當于單位氮活性增 加為尺度進行追蹤。其他蛋白質可用電泳、超離心、層析、擴散及溶解等測定純 度。如結晶核糖核酸酶經層析分為兩個成分。 可見對確定蛋白質結晶純度尚無最 終的尺度。 根據(jù)經驗即或純潔的標準品， 有極微量的不純物時， 也會給實驗帶來 較大的影響。不穩(wěn)定的蛋白質，如別離 SH-B時使用試劑及緩沖液等，要確認不 含

27、重金屬離子特級試劑也需檢定。蛋白質純化的操作如脫鹽、濃縮枯燥等均 與低分子化合物不同，必須經過獨特的繁瑣操作。蛋白質和蛋白質相互別離主要利用它們之間的各種性質的微小差異。 諸 如分子形狀、分子量大小、電離性質、溶解度、生物功能專一性等。蛋白質提取 液中，除包含所需要的蛋白質或酶外，還含有其它蛋白質、多糖、脂類、核 酸及肽類等雜質。雜質除去的方法有：A. 核酸沉淀法該法可用核酸沉淀劑和氯化錳、 硫酸魚精蛋白或鏈霉素等。 必要時也可 用脫氧核糖核酸酶除去核酸。即在粗勻漿中參加少量DNase,于4C保溫3060min,可使DNA降解為足夠小的碎片，以致不影響以后的純化。B. 醋酸鉛沉淀法利用醋酸鉛沉

28、淀劑除去雜蛋白。因這些沉淀劑也常常使需要的酶或蛋白 質緩緩變性而失去活性， 所以用這類試劑時應迅速進行鹽析， 使樣品與這類試 劑脫離接觸。C. 調pH值或加熱沉淀法利用蛋白質酸堿變性性質的差異除去雜蛋白。 利用蛋白質的熱變性的溫 度系數(shù)差異，可在一定的PH下將蛋白提取液加熱到一定的溫度，使對熱不穩(wěn)定 的雜蛋白性沉淀而除去。D .選擇性變性法利用各種蛋白質穩(wěn)定性的不同， 可用選擇性變性法來除去雜蛋白。 例如 胰蛋白酶及細胞色素C等少數(shù)特別穩(wěn)定的酶，甚至可用 2.5%三氯醋酸處理，此 時其它雜蛋白均變性而沉淀，而胰蛋白酶和細胞色素C那么仍留在溶液中。E. 透析法小分子物質常在整個制備過程中屢次液相

29、與固相互轉化中被別離， 或最 后用透析法除去。F. 利用溶解度不同的純化方法2. 鹽析法鹽析法對于許多非電解質的別離純化均適合。 對蛋白質和酶的提純應用 也最早。至今還廣泛使用， 一般粗抽提物經常利用鹽析法進行粗分。 也有反復用 鹽析法得到純的蛋白質的例子。 其原理是蛋白質在低鹽濃度下的溶解度隨鹽液濃 度升高而增加鹽溶，與離子強度 10 1 間成比例增加。球蛋白當鹽濃度不斷 上升時，蛋白質的溶解度又以不同程度下降并先后析出 鹽析離子強度 I2 10。這是由于蛋白質分子內和分子間的電荷的極性基團有靜電引力。當水中加入少量鹽時， 鹽離子與水分子對蛋白質分子一的極性基團的影響， 使蛋白質在水 中溶解

30、度增大。 但鹽濃度增加一定程度時， 水的活度降低， 蛋白質外表的電荷大 量被中和，水化膜被破壞， 于是蛋白質相互聚集而沉淀析出。 鹽析法是根據(jù)不同 蛋白質在一定濃度鹽溶液中溶解度降低程度不同到達彼此別離的方法。鹽的選擇 如上所述，蛋白質在水中溶解度取決于蛋白質分子上離子基團周圍的水 分子數(shù)目，即取決于蛋白質的水合程度。因此，控制水合程度，也就是控制蛋白 質的溶解度?？刂品椒ㄗ畛Ｓ玫氖菂⒓又行喳}。主要有硫酸銨、硫酸鎂 、硫酸 鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應用最廣的是硫酸銨，它的優(yōu)點是溫度系數(shù)小而溶 解度大(25C時飽滿和溶解度為4.1mol,即767g/l;0 C時飽滿和溶解度為3.9mol, 即

31、 676g/l )。在這一溶解度范圍內，許多蛋白質均可鹽析出來，且硫酸銨價廉 易得，分段效果較其它鹽好， 不易引起蛋白質變性。 應用硫酸銨時對蛋白氮的測 定有干擾，另外緩沖能力較差，故有時也應用硫酸鈉，如鹽析免疫球蛋白，用硫 酸鈉的效果也不錯，硫酸鈉的缺點是 30 E以下溶解度太低。其它的中性鹽如磷 酸鈉的鹽析作用比硫酸銨好， 但也由于溶解度太低， 受溫度影響大， 故應用不廣。 氯化鈉的溶解度不如硫酸銨， 但在不同溫度下它的溶解度變化不大， 這是方便之 處。它也是廉價不易純化的試劑。硫酸銨濃溶液的PH常在4.55.5之間,市售的硫酸銨還常含有少量游 離硫酸,PH值往往降至4.5以下，當用其他P

32、H值進行鹽析時,需用硫酸或氨水調 節(jié).確定沉淀蛋白質所需硫酸銨濃度的方法將少量樣品冷卻到05C,然后攪拌參加固體硫酸銨粉末，見蛋白質產生 沉淀時， 離心除去沉淀， 分析上清液確定所要蛋白質的濃度， 如它仍在溶液中那么 棄去沉淀， 再加更多的硫酸銨于上清液中， 直到產生蛋白質沉淀時止。 以所要提 取的蛋白質在溶液中的濃度對硫酸銨濃度作圖， 得沉淀曲線， 找出蛋白質開始沉 淀的濃度。如不考慮收率，飽和度區(qū)間可取得窄一些，使純度高一些。 鹽析時注意的幾個問題 :(1) 鹽的飽和度:不同蛋白質鹽析時要求鹽的飽和度不同。別離幾個混合組成的蛋白質時， 鹽的飽和度常由稀到濃漸次增加。 每出現(xiàn)一種蛋白質沉淀進

33、行離 心或過濾別離后， 再繼續(xù)增加鹽的飽和度， 使第 2種蛋白質沉淀。 例如用硫酸銨 鹽析別離血漿中的蛋白質飽和度達 20%時，纖維蛋白原首先析出； 飽和增至 28 33%時，優(yōu)球蛋白析出；飽和度再增至 3350%時，擬球蛋白析出；飽和度大于 50%以上時清蛋白析出。用硫酸銨不同飽和度分段鹽析法，可從牛胰酸性提取液 中別離得到 9 種以上蛋白質及酶。(2) PH 值:pH 值在等電點時蛋白質溶解度最小易沉淀析出。 因此鹽析時除個別特殊情況外，pH值常選擇在被別離的蛋白質等電點附近。由于硫酸銨有弱酸性，它的飽和溶液的pH值低于7,如所要蛋白質遇酸易變性那么應在適當緩沖液 中進行。(3) 蛋白質濃

34、度:在相同鹽析條件下蛋白質濃度愈高愈易沉淀。使用鹽的飽和度的極限也愈低。 如血清球蛋白的濃度從 0.5%增至 3.0%時,需用中性鹽的飽和 度的最低極限從 29%遞減至 24%.某一蛋白質欲進行兩次鹽析時 ,第1 次由于濃度 較稀,鹽析分段范圍較寬 ,第2次那么逐漸變窄 .例如膽堿酯酶用硫酸銨鹽析進時， 第1 次硫酸銨飽和度為 35%至60%,第2次為 40%至60%.蛋白質濃度高些雖然對沉 淀有利,但濃度過高也易引起雜蛋白的共沉作用 .因此,必須選擇適當濃度盡可能 防止共沉作用的干擾。(4) 溫度 :由于濃鹽液對蛋白質有一定保護作用，鹽析操作一般可在室溫下進行。至于某些對熱特別敏感的酶， 那

35、么宜維持低溫條件。 通常蛋白質鹽析時對溫 度要求不太嚴格。但在中性鹽中結晶純化時，溫度影響那么比擬明顯。(5) 脫鹽 :蛋白質用鹽析法別離沉淀后，常需脫鹽才能獲得純品。脫鹽方法最常用的是透析法。 透析法所需時間較長， 常在低溫下進行并參加防腐劑防止微 生物污染。透析使用前必須處理，方法是將透析袋置于 0.5mol/LEDTA 溶液中煮 0.5h, 棄去溶液 , 用蒸鎦水洗凈 , 置 50%甘油中保存?zhèn)溆?。也可用分子篩層析，常用SephadexG-25柱層析法，上樣不要超過床體 積的 20%。此外，有些金屬離子能和蛋白質形成較為專一的結合而使蛋白質沉淀。 這雖不是典型的鹽析，但在制備蛋白質中有許

36、多成功的例子。鋅離子在特定 pH 下與胰島素結合形成沉淀就是這種例子。 蛋白質從懸浮液中沉淀出來的速度極慢，必須用強力離心來促進這個過程。3. 有機溶劑別離純化法 有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)， 從而增加蛋白質分子上不同電荷的引 力，導致溶解度降低。 有機溶劑與水作用能破壞蛋白質的水化膜， 使蛋白質在一 定濃度的有機溶劑中沉淀析出。 常用的有機溶劑是乙醇和丙酮， 由于有機溶劑的 參加易引起變性失活，尤其乙醇和水混合釋放熱量，操作一般宜在低溫下進行， 且在參加有機溶劑時注意攪拌均勻以免局部濃度過大。 用此法所析出的沉淀一般 比鹽析法易過濾或離心沉降。 別離后的蛋白質沉淀應立即用水或緩沖液溶解，

37、以 降低有機溶劑的濃度。操作時的 pH 值大多數(shù)控制在待沉淀蛋白質等電點附近。 有機溶劑在中性鹽存在時能增加蛋白質的溶解度，減少變性和提高別離的效果。 一般在有機溶劑沉淀時添加中性鹽的濃度在 0.05mol 左右, 過多不僅消耗有機溶 劑,而且可能導致沉淀不好 . 沉淀的條件一經確定 ,就必須嚴格控制 ,才能得到重 復性結果 .有機溶劑濃度通常以有機溶劑和水容積比或用百分濃度素示 . 故操作 條件比鹽析法嚴格。許多有機溶劑，如碳鏈較長的醇，它溶于水，但有限度。其量大到一定 程度后那么分成兩相， 一相以水為主， 一相以有機溶劑為主。 某些第 3 組分的存在 可以改變兩相的比例和組成。 有許多蛋白

38、質在兩相中均能溶解， 形成分配。 在同 一個兩相的溶劑系統(tǒng)中， 不同的蛋白質有不同的分配系數(shù)。 根據(jù)這一原理， 操作 全部機械化的有逆流分溶。 因要求實驗室溫度恒定且操作也繁雜， 雖一直有人在 用但很不普遍。 分配層析也是應用這一原理， 但在別離純化蛋白質工作中用得不 多，主要是因為多數(shù)蛋白質在有機溶劑中， 特別是在易與水分相的溶劑中溶解度 小且易變性。4. 疏水層析 : 是近年開展的新方法。它利用蛋白質外表有一局部疏水 性，與帶有疏水性的載體在高鹽濃度時結合。 洗脫時將鹽濃度逐漸降低， 蛋白質 因疏水性不同而逐個地先后被洗脫而純化。 此法能別離其它一些方法不易純化的 蛋白質。利用分子形狀和大

39、小不同的別離方法 蛋白質形狀有細長的如纖維， 有密實的如圓球， 形狀很不相同。 蛋白質 的分子量從 6000 左右開始， 有各種大小， 大的可以大到幾百萬。 利用這些差異， 有幾種方法可用來別離蛋白質。5. 凝膠層析屬最常用的蛋白質別離方法。 系混合物隨流動相流經裝有凝膠作為固定 相的層析柱時， 混合物中各物質因分子大小不同而被別離的技術。 所指凝膠從廣 義上說是一類具有三維空間多孔網狀結構的物質， 如天然物質中的馬鈴薯淀粉及 瓊脂糖凝膠， 人工合成品的葡聚糖凝膠及帶離子交換基團的葡聚糖凝膠等。 把適 當?shù)哪z顆粒裝填到玻璃管中制成層析柱， 于柱內參加欲別離的混合物， 然后用 大量蒸鎦水或其它

40、稀溶液洗柱， 由于混合物中各物質的分子大小和形狀不同， 在 洗柱過程中，分子量最大的物質不能進入凝膠網孔而沿凝膠顆 粒間的空隙最先 流出柱外。 分子量最小的物質因能進入凝膠網孔而受阻滯， 流速緩慢， 致使最后 流出柱外。整個過程和過濾相似，故又名凝膠過濾、凝膠滲透過濾、分子篩過濾 等。由于物質在別離過程中的阻滯減速現(xiàn)象， 有人也稱之為阻滯擴散層析、 排阻 層析等。凝膠過濾是分子篩的一種， 在介紹凝膠過濾法之前， 首先介紹分子篩的 由來。McBain(1928)提出了分子篩的概念。后來發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象在許多地方都存在。 Synge與Tiselins ( 1950)在解釋凝膠層中的電泳和電滲現(xiàn)象時引用

41、了分子篩的 概念。此后發(fā)現(xiàn)在柱層析中也有這種現(xiàn)象， 于是許多工作者嘗試了一系列適用于 生物高分子別離純化用的分子篩。至 1959年Porath與Flodim找到局部水解的 葡聚糖凝膠將其交聯(lián)，得到了商品名為交聯(lián)葡聚糖(SephadeM的分子篩。該分 子篩具有許多良好的性能，在蛋白質的別離分析中已被廣泛采用。Lathe與Ruthven(1956)曾利用分子篩效應測定過分子大小與分子量。Flodin與Granath( 1961)發(fā)現(xiàn)不同分子量的葡聚糖級分， 其凝膠過濾行為與分 子量大小有關。Andrew( 1962)發(fā)現(xiàn)蛋白質中也有類似的性質此后經過不少人 的實際應用，完善了這一方法，形成一個可靠

42、的測定高分子分子量的方法。凝膠層析是 60 年代初開展起來的一種快速而又簡便的別離技術。由于 設備簡單、操作方便和不需要有機溶劑，以及對高分子物質有很高的別離效果， 所以目前它已被生物化學、 分子生物學、 生物工程學及醫(yī)藥學等有關領域廣泛應 用。A. PH 值與沉淀蛋白質或酶原理相同，結晶的溶液 PH值一般選擇在被結晶的蛋 白質或酶的等電點附近，以利于晶體的析出。B. 溫度除少數(shù)情況外， 通常選擇低溫條件進行。 低溫條件對蛋白質和酶不僅溶 解度低且不易變性。在中性鹽溶液中結晶時，溫度可在 0C至室溫范圍內選擇， 在有機溶劑中結晶一般要求溫度較低。C. 晶種不易結晶蛋白質和酶如糜蛋白酶， 往往參

43、加微量的糜蛋白酶結晶可導致 大量結晶的形成。 有時用玻璃輕輕摩擦容器壁也可到達此目的。 需加晶種才能形 成結晶的蛋白質或酶，大多數(shù)結晶收率都不高。D. 金屬離子有些蛋白質和酶結晶時還需參加金屬離子， 如鐵蛋白在硫酸銨溶液中結 晶時，參加少量鎘離子才形成菱狀結晶，烯醇化酶也常參加汞鹽后形成結晶。E. 結晶時間在結晶條件比擬適合的情況下， 在幾小時甚至幾分名即可獲得結晶。 但 有些情況需數(shù)天甚至數(shù)月才能結晶完全，視各種蛋白質和酶的具體情況不同而 定。蛋白質和酶的結晶大多數(shù)是針狀、棒狀、片狀，有的為八面體或立方體的菱 狀結晶。結晶的大小與結晶時間及條件有關。6. 蛋白質的枯燥枯燥是將潮濕的固體、 半

44、固體或濃縮液中的水分 或溶劑 蒸發(fā)除去的 過程。根據(jù)水分在固體中分布情況可分為外表水分、 毛細管水分和被膜所包圍的 水分 3 種。外表水分附著于固體外表， 蒸發(fā)時完全暴露于外界空氣中， 枯燥最快、 最均勻。毛細管水分存在于固體極細孔隙的毛細管中， 水分子逸出比擬困難， 蒸 發(fā)時慢并需較高溫度。 膜包圍的水分如細胞中被細胞質膜所包圍的水分， 需經緩 慢擴散至膜外才能蒸發(fā)最難除去。 被枯燥的物質其濕度與周圍空氣的濕度是一個 動態(tài)平衡關系， 暴露于大氣中的物質是不會絕對枯燥的。 假設使被枯燥的物質所含 水分低于周圍空氣中水分， 那么必須放在嚴密封蓋的容器中進行枯燥。 用這種方法 可得到含水量極低的枯

45、燥樣品， 生物大分子制備得到所需的產品后， 為了防止變 質易于保存和運輸， 常需要枯燥處理， 最常用的方法是冷凍枯燥和真空枯燥， 某 些無活性核酸、 微生物酶制劑和酪蛋白等工業(yè)產品那么較多地應用噴霧枯燥、 氣流 枯燥等直接枯燥法。1真空枯燥 在相同溫度下，被枯燥物質所含水分或溶劑由于周圍空氣壓力的降低蒸 發(fā)速度增加。真空度愈高，溶劑沸點愈低，蒸發(fā)愈快。其原理與真空濃縮或稱 減壓濃縮相同。真空枯燥適用于不耐高溫、易氧化物質的枯燥和保存，整個裝 置包括枯燥器、 冷凝器、 及真空泵 3 局部。 枯燥器頂部連接一帶活塞的管道接通 冷凝器，氣化后的蒸氣由此管道通過冷凝管凝聚， 冷凝器另一端連接真空泵，

46、干 燥器內常放一些枯燥劑如五氧化二磷、無水氯化鈣等，以便枯燥保存樣品。2冷凍真空枯燥冷凍真空枯燥除利用真空枯燥原理外， 同時增加了溫度因素。 在相同的 壓力下，水蒸氣壓隨溫度的下降而下降。在低溫下低壓下冰很容易升華為氣體。 操作時通常將等枯燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體， 然后在低溫低壓下將 溶劑變成氣體而除去。 枯燥后的產品具有疏松、 溶解度好、保持天然結構等優(yōu)點， 適用于各類生物大分子的枯燥保存。 樣品枯燥時先在培養(yǎng)皿內鋪成薄層 厚度不 超過1cm的液體，置于低溫冰箱內凍固。另在真空枯燥器內用兩個培養(yǎng)皿分別 放置固體氫氧化鈉和五氧化二磷， 真空枯燥上端抽氣通過五氧化二磷枯燥管與真 空泵

47、相連。當放進等待枯燥的凍塊后，立即封閉枯燥器，開動真空泵，紅510h 后得冷凍枯燥品。也可將待枯燥物質置于圓底容器中，然后浸入干冰- 乙醇混合而成的冷卻劑中， 容器內液體迅速凍成固體， 抽真空后等枯燥凍塊的水分子升華 變成氣體，經過冷凝器凝結為霜。 冰凍的樣品逐漸失去水分變成疏松的枯燥粉末。 上述操作關鍵在于真空泵的高真空度及管道的口徑要適宜。3噴霧枯燥 噴霧枯燥是將液體通過噴灑裝置噴成霧滴后， 與枯燥介質 通常為熱空 氣直接接觸枯燥的方法。由于液體分散為霧滴時，直徑通常只有1200卩m大小，與熱空氣接觸面大，水分蒸發(fā)很快。在 100C的熱空氣中只需不到1秒的 時間即可枯燥。 因枯燥時間短和水分蒸發(fā)時吸收熱量， 使液滴及其附近的空氣溫 度較低，故工業(yè)上常用。7. 樣品貯藏保存保存方法和生物大分子穩(wěn)定性有很大關系， 生物大分子的貯藏保存可分 為干態(tài)和液態(tài)貯藏兩種。 但不管是干態(tài)或液態(tài)貯藏均應防止長期暴露于空氣中防 止微生物的污染。 溫度對生物大分子的穩(wěn)定性影響很大， 低溫保存在大多數(shù)情況 下是有利的。(1) 干態(tài)貯藏枯燥的制品一般比擬穩(wěn)定， 如制品含水量很低， 要低溫情況下物質大分 子