試比較原核和真核細胞的mRNA的異同

1、第一章緒論分子生物學：從分子水平研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能從而說明生命現(xiàn)象本質(zhì)的科學，主要指遺傳信息的傳遞復制、保持損傷和修復、基因的表達轉(zhuǎn)錄和翻譯與調(diào)控。分子生物學研究內(nèi)容 DNA重組技術基因工程1、可被用于大量生產(chǎn)某些在正常細胞代謝中產(chǎn)量很低的多肽；2、可用于定向改造某些生物的基因組結(jié)構(gòu);3、可被用來進行根底研究基因的表達調(diào)控1信號轉(zhuǎn)導研究；2轉(zhuǎn)錄因子;3研究RAN剪接生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能研究結(jié)構(gòu)分子生物學基因組、功能基因組與生物信息學研究第二章染色體和 DNADNA復制時其中一條子鏈的合成是連續(xù)的，而另一條子鏈的合成是不連續(xù)的，故稱半不連續(xù)復制在DNA復制時，合成方向與復制叉移動的方向

2、一致并連續(xù)合成的鏈為前導鏈；合成方向與復制叉移動的方向從復制原點到終點，組成一個復制單位，叫復制子相反，形成許多不連續(xù)的片段，最后再連成一條完整的DNA鏈為滯后鏈。DNA的復制過程大腸桿菌為例雙鏈的解開；DNA的復制有特定的起始位點，叫做復制原點。ori或0、富含A、T的區(qū)段RNA引物的合成：DnaB蛋白活化引物合成酶，引發(fā)RNA引物的合成。引物長度約為幾個至 10個核苷酸，DNA鏈的延伸切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片段復制時，解鏈酶等先將 DNA的一段雙鏈解開，形成復制點，這個復制點的形狀象一個叉子，故稱為復制叉在DNA復制過程中，前導鏈能連續(xù)合成，而滯后鏈只能是斷續(xù)的合成的多

3、個短片段，這些不連續(xù)的小片段稱為岡崎片段。復制的幾種主要方式P421、雙鏈環(huán)狀、B型復制、雙向等速2、滾環(huán)型：單向復制的特殊方式如：X 174的雙鏈環(huán)狀 DNA復制型RF1模板鏈和新合成的鏈分開 ；2不需RNA引物，在正鏈 3 - OH上延伸3只有一個復制叉；3、 D環(huán)復制單向復制的特殊方式如：動物線粒體DNA真核生物中DNA的復制特點1、真核生物每條染色體上有多個復制起點，多復制子約150bp左右；2、 復制叉移動的速度較慢約 50bp/秒，僅為原核生物的1 /10。3、 真核生物染色體在全部復制完之前，各個起始點不再重新開始 DNA復制；真核生物快速生長時，往往采用更多的復 制起點4、真核

4、生物有多種 DNA聚合酶。5、 真核生物DNA復制過程中的引物及岡崎片段的長度均小于原核生物。真核岡崎片段長約 100-200bp ,原核岡崎片 段長約 1000-2000bp。原核和真核生物 DNA的復制特點比擬復制起點ori：原核一個，真核多個；復制子：原核一個，真核多個；復制子長度：原核長；真核短；復制叉：原核多個；真核多個；復制移動速度：原核較快；真核較慢；真核生物染色體在全部完成復制前，各起始點的DNA復制不能再開始。而在 快速生長的原核生物中，復制起點上可以連續(xù)開始新的 DNA復制。原核生物染色體的復制與細胞分裂同步，可以屢次復制；真核生物染色體的復制發(fā)生在S期，是細胞分類的特定時

5、期，而且僅此一次。DNA修復系統(tǒng) 錯配修復 堿基切除修復 核甘酸切除修復功能恢復錯配切除突變的堿基修復被破壞的 DNADNA直接修復SOS系統(tǒng)修復嘧啶二體或甲基化 DNA，DNA的修復，導致變異第三章生物信息的傳遞上一一轉(zhuǎn)錄 錄:生物體以DNA為模板合成RNA的過程 參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)原料 ：NTP ATP, UTP, GTP, CTP 模板:DNA;酶:RNA聚合酶；其他蛋白質(zhì)因子RNA合成方向：5'3'與mRNA序列相同的那條 DNA鏈稱為編碼鏈；將另一條根據(jù)堿基互補原那么指導mRNA合成的DNA鏈稱為模板鏈。結(jié)構(gòu)基因：DNA分子上轉(zhuǎn)錄出 RNA的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因。轉(zhuǎn)錄單元t

6、ranscription unit 段從啟動子開始至終止子結(jié)束DNA序列。RNA聚合酶原核生物 RNA聚合酶大腸桿菌為例全酶=核心酶+ b因子大腸桿菌RNA聚合酶的組成分析看書真核細胞的三種RNA聚合酶特征比擬看書RNA聚合酶與DNA聚合酶的區(qū)別RNA聚合酶DNA聚合酶大小M大，4.8 X 105dol小,1.09 X 105dol引物無有產(chǎn)物較短，游離較長，與模板以氫鍵相連作用方式一條鏈的某一段兩條鏈同時進行外切酶活性無5'33'5'校對合成能力無有修復能力無有啟動子定義：指能被 RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。TATA區(qū)：酶的緊密結(jié)合位點富含

7、AT堿基，利于雙鏈翻開TTGACA區(qū)：提供了 RNA聚合酶全酶識別的信號轉(zhuǎn)錄起點：與新生 RNA鏈第一個核甘酸相對應 DNA鏈上的堿基真核有三種不同的啟動子和有關的元件啟動子H最為復雜，它和原核的啟動子有很多不同真核生物啟動子的結(jié)構(gòu)：核心啟動子core promoter和上游啟動子元件 upstream promoter element, UPE 核心啟動子：指保證 RNA聚合酶n轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點及轉(zhuǎn)錄起始位點上游TATA區(qū)作用：選擇正確的轉(zhuǎn)錄起始位點，保證精確起始上游啟動子元件包括 CAAT盒CCAAT 和GC盒GGGCGG 等CAAT : -70 -

8、 -80bpGGGCGG : -80 - -110bp作用：控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。轉(zhuǎn)錄的根本過程：1、起始位點的識別：RNA聚合酶與啟動子 DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過程。RNA聚合酶全酶a 2 3 3 ' b 與模板結(jié)合2、轉(zhuǎn)錄起始 RNA鏈上第一個核甘酸鍵的產(chǎn)生RNA聚合酶全酶2與模板結(jié)合DNA雙鏈解開在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反響，形成轉(zhuǎn)錄起始復合物3、RNA鏈的延伸亞基脫落，RNA - pol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。9個以上的核苷酸并離開啟動子區(qū)，轉(zhuǎn)錄正式進入眼神階注意：9個核苷酸以前還在

9、啟動子區(qū)，容易脫落，一旦形成段。4、轉(zhuǎn)錄終止終止子terminator :位于基因的末端，在轉(zhuǎn)錄終止點之前有一段回文序列反向重復序列約6-20bp。真核生物終止：由一段特定序列 5' AATAAA 3'和回文序列反向重復序列組成。分為兩類：強終止子內(nèi)部終止子：不依賴Rho p 因子的終止。弱終止子 需要p因子rho factor,又稱為p依賴性終止子 Rho-dependent terminator 1當RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點時，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物別離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA恢復成雙鏈狀態(tài)，而 RNA聚合酶和RNA鏈都被從模板上釋放出來，這

10、就是轉(zhuǎn)錄的終止。終止位點上游一般存在一個富含GC堿基的二重對稱區(qū)，RNA形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；在終止位點前面有一段由4-8個A組成的序列，RNA的3 '端為寡聚U終止效率與二重對稱序列和寡聚U的長短有關，長度越長效率越高2依賴p閔了的終上p因子：六聚體蛋白、水解各種核甘三磷酸促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄增強子P78:概念：在啟動區(qū)存在的能增強或促進轉(zhuǎn)錄的起始的DNA序列。但不是啟動子的一局部。特點：1.遠距離效應；2.無方向性；3.順式調(diào)節(jié)；4.無物種和基因的特異性；5.具有組織特異性；6.有相位性；7.有的增 強子可以對外部信號產(chǎn)生反響。真核生物的轉(zhuǎn)錄過程看書1.

11、 轉(zhuǎn)錄起始 真核生物的轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化，轉(zhuǎn)錄起始時，RNA-pol不直接結(jié)合模板，其起始過程比原核生物復雜。2. 轉(zhuǎn)錄延伸 真核生物轉(zhuǎn)錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。3. 轉(zhuǎn)錄后加工5'端加帽；3'端加尾 ；RNA的剪接;RNA的編輯帽子結(jié)構(gòu)功能：能被核糖體小亞基識別，促使mRNA和核糖體的結(jié)合； m7Gppp結(jié)構(gòu)能有效地封閉 mRNA 5'末端，以保護 mRNA免受5'核酸外切酶的降解，增強 mRNA的穩(wěn)定。多聚腺苷酸尾巴功能：提高了 mRNA在細胞 質(zhì)中的穩(wěn)定性。2. 試比擬原核和真核細胞的 mRNA勺

12、異同.原核生物 原核生物mRNA的半衰期短。 許多原核生物 mRNAA多順反子形式存在。單順反子 mRNA只編碼一個蛋白質(zhì)的mRNA 多順反子 mRNA編碼多個蛋白質(zhì)的 mRNA 其5 '端無帽子結(jié)構(gòu)，3 '端沒有或只有較短的 polyA。 SD序列：原核生物起始密碼子 AUG上游7-12個核苷酸處有一被稱為 SD序列的保守區(qū)。mRNA中用于結(jié)合原核生物 核糖體的序列 P85 原核細胞mRNA包括病毒有時可以編碼幾個多肽。本條供參考 原核生物常以 AUG有時GUG甚至UUG作為起始密碼子本條供參考真核生物： 其5 '端存在帽子結(jié)構(gòu)。 絕大多數(shù)真核生物 mRNA有poly

13、A尾巴。組蛋白除外 以單順反子的形式存在 其RNA最多只能編碼一個多肽。本條供參考 真核生物幾乎永遠以 AUG為起始密碼子。本條供參考RNA合成與DNA合成異同點相同點：1、都以DNA鏈作為模板2、合成的方向均為 5'宀3'3、 聚合反響均是通過核苷酸之間形成的3' ,5'-磷酸二酯鍵，使核苷酸鏈延長。不同點：復制轉(zhuǎn)錄模板兩條鏈均復制模板鏈轉(zhuǎn)錄不對稱轉(zhuǎn)錄原料酶產(chǎn)物 配對 引物dNTPDNA聚合酶子代雙鏈DNA (半保存復制)A-T ； G-CRNA引物NTPRNA聚合酶mRNA， tRNA， rRNAA-U ； T-A ； G-C無mRNA3類內(nèi)含子剪接核酶的定

14、義及發(fā)現(xiàn)第四章按每三個核甘酸代表一個氨基酸的原那么,依次合成一條翻譯：指將mRNA鏈上的核甘酸從一個特定的起始位點開始, 多肽鏈的過程。蛋白質(zhì)合成的場所是核糖體蛋白質(zhì)合成的模板是mRNA模板與氨基酸之間的接合體是tRNA蛋白質(zhì)合成的原料是20種氨基酸三聯(lián)子密碼定義：mRNA鏈上每三個核甘酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個氨基酸，這三個核甘酸就稱為密碼子或三聯(lián)子密碼(triplet coden)遺傳密碼的性質(zhì)：1、連續(xù)性：編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的各個三聯(lián)體密碼連續(xù)閱讀，密碼間既無間斷也無交叉。 基因損傷引起 mRNA閱讀框架內(nèi)的堿基發(fā)生插入或缺失，可能導致框移突變(frameshift mutation

15、)。從 mRNA 5AUG 到 3多肽鏈，稱為開放閱讀框架 (open reading frame, ORF)。degeneracy)，對應于同一氨基酸的密碼子稱為同Arg例外2、簡并性：由一種以上密碼子編碼同一個氨基酸的現(xiàn)象稱為簡并( 義密碼子(synonymous codor)。編碼某一氨基酸的密碼子越多，該氨基酸在蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的頻率就越高。3、通用性與特殊性蛋白質(zhì)生物合成的整套密碼，從原核生物到人類都通用。已發(fā)現(xiàn)少數(shù)例外，如動物細胞的線粒體、植物細胞的葉綠體。4、擺動性：轉(zhuǎn)運氨基酸的 tRNA上的反密碼子需要通過堿基互補與mRNA上的遺傳密碼子反向配對結(jié)合，在密碼子與反密碼子的配對中，前

16、兩對嚴格遵守堿基配對原那么，第三對堿基有一定的自由度，可以“擺動，這種現(xiàn)象稱為密碼子的擺動性tRNA的結(jié)構(gòu) 1、二級結(jié)構(gòu)：三葉草形2、三級結(jié)構(gòu)：“ L形氫鍵tRNA的功能1、解讀 mRNA的遺傳信息2、運輸?shù)墓ぞ?，運載氨基酸t(yī)RNA有兩個關鍵部位：3 '端CCA :接受氨基酸，形成氨酰 -tRNA。與mRNA結(jié)合部位一反密碼子部位tRNA憑借自身的反密碼子與mRNA鏈上的密碼子相識別，把所帶氨基酸放到肽鏈的一定位置。tRNA的種類1、起始tRNA和延伸tRNA :能特異地識別 mRNA模板上起始密碼子的 tRNA稱起始tRNA，其他tRNA統(tǒng)稱為延伸tRNA。真核生物：起始密碼子 AU

17、G 所編碼的氨基酸是 Met，起始 AA-tRNA為Met-tRNAMet。原核生物：起始密碼子AUG所編碼的氨基酸并不是甲硫氨酸本身，而是甲酰甲硫氨酸，起始AA-tRNA 為fMet-tRNAfMet2、同工tRNA代表同一種氨基酸的 tRNA稱為同工tRNA。同工tRNA既要有不同的反密碼子以識別該氨基酸的各種同義密碼，又要有某種結(jié)構(gòu)上的共同性，能被相同的氨基酰-tRNA合成酶識別(P119)。3、校正tRNA無義突變校正tRNA :可以通過改變反密碼子區(qū)校正無義突變錯義突變校正tRNA :通過反密碼子區(qū)的改變把正確的氨基酸加到肽鏈上，合成正常的蛋白質(zhì)。(UAG、UGA、無義突變：在蛋白質(zhì)

18、的結(jié)構(gòu)基因中， 一個核苷酸的改變可能使代表某個氨基酸的密碼子變成終止密碼子 UAA)，使蛋白質(zhì)合成提前終止，合成無功能的或無意義的多肽，這種突變就稱為無義突變。錯義突變：由于結(jié)構(gòu)基因中某個核甘酸的變化使一種氨基酸的密碼子變?yōu)榱硪环N氨基酸的密碼子，這種基因突變叫 錯義突變。GGA (甘氨酸) 核糖體的結(jié)構(gòu)與功能AGA (精氨酸)1. 核糖體是由rRNA (ribosomal ribonucleic acid)和多種蛋白質(zhì)結(jié)合而成的一種大的 核糖核蛋白顆粒，蛋白質(zhì)肽鍵的合成就是在這種核糖體上進行的。2. 核糖體的功能：合成蛋白質(zhì)在單個核糖體上，可化分多個功能活性中心，在蛋白質(zhì)合成過程中各有專一的識

19、別作用和功能。 mRNA結(jié)合部位小亞基結(jié)合或接受 AA-tRNA 部位(A位)大亞基 結(jié)合或接受肽基 tRNA的部位一一大亞基 肽基轉(zhuǎn)移部位(P位)一一大亞基形成肽鍵的部位(轉(zhuǎn)肽酶中心) 大亞基 蛋白質(zhì)合成的過程(生物學機制) 氨基酸的活化 翻譯的起始 肽鏈的延伸 肽鏈的終止蛋白質(zhì)前體的加工肽鏈怎樣進行進行終止的？RF1識別終止密碼子終止因子RF2識別終止密碼子RF3具GTP酶活性,真核生物只有一個終止因子(eRF)核糖體循環(huán)步驟？蛋白質(zhì)的運轉(zhuǎn)機制1、翻譯-運轉(zhuǎn)同步機制2、翻譯后運轉(zhuǎn)機制(1) 線粒體蛋白質(zhì)跨膜運轉(zhuǎn)(2) 葉綠體蛋白質(zhì)的跨膜運轉(zhuǎn)3、核定位蛋白的運轉(zhuǎn)機制UAA 和 UAGUAA

20、和 UGA刺激 RF1和 RF2活性，協(xié)助肽鏈的釋放4、蛋白質(zhì)的降解蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)的兩種方式(蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)模式？ ？怎樣進行？ ？)一.翻譯-運轉(zhuǎn)同步(co-translational translocation ):是即將進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)的易位方式；蛋白質(zhì)正合成的時候就可與運轉(zhuǎn)裝置結(jié)合；蛋白質(zhì)合成時，核糖體定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外表，稱膜結(jié)合核糖體(membrane-bound ribosome )。分泌蛋白質(zhì)大多是以同步機制運輸?shù)亩?翻譯后運轉(zhuǎn)(post-translational translocation):蛋白質(zhì)翻譯完成后從核糖體上釋放，然合擴散至適宜的靶膜并與運 轉(zhuǎn)裝置結(jié)合。蛋白質(zhì)合成時，其核糖

21、體不與任何細胞器相連，稱游離核糖體(free ribosome)在細胞器發(fā)育過程中，由細胞質(zhì)進入細胞器的蛋白質(zhì)大多是以翻譯后運轉(zhuǎn)機制運輸?shù)摹?參與生物膜形成的蛋白質(zhì)，依賴于上述兩種不同的運轉(zhuǎn)機制鑲?cè)肽?nèi)。信號肽假說內(nèi)容：(1) 蛋白質(zhì)合成起始首先合成信號肽(2) SRP (信號識別蛋白)與信號肽結(jié)合，翻譯暫停(3) SRP與SRP受體結(jié)合，核糖體與膜結(jié)合，翻譯重新開始(4) 信號肽進入膜結(jié)構(gòu)(5) 蛋白質(zhì)過膜，信號肽被切除，翻譯繼續(xù)進行(6) 蛋白質(zhì)完全過膜，核糖體解離第五章分子生物學研究法基因操作：主要包括 DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因的人工

22、 合成、定點突變和 PCR擴增等。基因工程：指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進入新的宿主細胞內(nèi) 并獲得持續(xù)穩(wěn)定增值能力和表達。基因工程 所需元件：限制性內(nèi)切酶；連接酶；載體；受體細胞常用的工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶I 反轉(zhuǎn)錄酶 多聚核苷酸激酶 末端轉(zhuǎn)移酶 堿性磷酸酶切割DNA生成3' - 5'磷酸二酯鍵 探針標記、補平 3 '末端cDNA合成5 '磷酸化、探針標記3 '末端多聚尾切除末端磷酸基限制性內(nèi)切核酸酶(restrictive endonucleases，又稱限制酶。是特異性地切斷DN

23、A鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶("分子手術刀)。限制酶的命名命名原那么：限制酶由三局部構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、別離順序限制性內(nèi)切酶的特點：(1) .限制性內(nèi)切酶一般識別完全的回文結(jié)構(gòu)，它具有兩個根本特點： 能夠在中間劃一個對稱軸，兩側(cè)的序列兩兩對稱互補配對； 兩條互補鏈的5' 3'的序列組成相同，即將一條鏈旋轉(zhuǎn)180度，那么兩條鏈重疊。(2) .識別4 -8個相連的核苷酸組成的特定核甘酸序列。(3) 切割方式有兩種 錯位切割，產(chǎn)生互補性的粘性末端。錯位切割所產(chǎn)生的 DNA末端，兩條鏈不平齊，一條鏈凸出，一條鏈凹進，這種末端稱為黏性末端。帶有相同黏性末 端的DNA分子很容易

24、在末端互補配對，連接成新的重組分子。 沿對稱軸切割，產(chǎn)生平齊末端(4具有同裂酶：來源不同的限制性內(nèi)切酶識別同樣的核甘酸靶序列。女口： BamH I和Bst I具有相同的識別序列 GGATCC。(5)具有同尾酶：來源各異，識別的靶序列也不同，但卻產(chǎn)生相同的黏性末端，故同尾酶產(chǎn)生的黏性末端可以連接起來，但一般不能再被原來的任何一種酶所切割。女口： Taq I、Cla I和Acc I為一組同尾酶，其中任何一種酶切割DNA分子都產(chǎn)生5'端CG凸出的粘性末端。目的基因的獲得1)化學合成法：較短的基因(60-80bp)用途：PCR引物；測序引物；定點突變；核酸雜交探針重組DNA技術(Recombi

25、nant DNA Technique)是人類根據(jù)需要選擇目的基因(DNA片段)在體外與基因運載體重組，轉(zhuǎn)移至另一細胞或生物體內(nèi)，以到達改進和創(chuàng)造新的物種和治療人類疾病的目的?；蚪M文庫和cDNA文庫基因庫，也叫基因組文庫，DNA 文庫(DNA library)是指用克隆的方法將一種生物的全部基因組長期以重組體方式保持在適當?shù)乃拗髦?。將生物細胞基因組 DNA通過限制性內(nèi)切酶局部酶解后所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機地同相應的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列。這樣保存的基因組是多拷貝、多片段，當需要某一片段時，可以在這樣的“圖書館中查找(沒有目錄) 。cDNA文庫(P175

26、):首先獲得 mRNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，經(jīng)克隆后形成文庫。cDAN文庫和基因組文庫的不同之處在于，cDNA文庫除卻了 mRNA拼接過程中除去的內(nèi)含子等成分，便于DNA重 組的使用。其復雜性比基因文庫低得多。主要用于研究蛋白質(zhì)的氨基酸順序，可根據(jù)克隆的CDNA分子的核酸序列直接推導出來。組建一個cDNA文庫的步驟：1別離表達目的基因的組織或細胞2從組織或細胞中制備總體 RNA和mRNA3 第一條cDNA鏈的合成，需要RNA模板，cDNA合成引物，逆轉(zhuǎn)錄酶，4種脫氧核苷三磷酸以及相應的緩沖液Mg2+ 等。4第二條-CDNA鏈的合成5cDNA的甲基化和接頭的參加6雙鏈cDNA與載體的連接據(jù)研究目的

27、，選擇克隆策略cDNA library =控制基因表達的調(diào)控序列；mRNA中不存在的特定序列cDNA library =蛋白質(zhì)的氨基酸序列載體Vector:將外源目的DNA導入受體細胞，并能自我復制和增殖的工具。載體的條件分子小10 Kb ；;帶篩選的標志用于原核生物宿主的載體：有限制酶酶切位點；可自主復制；有足夠的copy數(shù)質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體用于真核生物宿主的載體：細菌人工染色體載體 酵母人工染色體載體 噬菌體PI載體和PACPlasmid :質(zhì)粒是細胞染色體或核區(qū)DNA外能夠自主復制的 很小的環(huán)狀 DNA分子質(zhì)粒載體特點1、至少有一個復制起點，因而至少可在一種生物體中自主復制。

28、2、 至少應有一個克隆位點，以供外源DNA插入。3、 至少應有一個遺傳標記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞。4、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。標記基因的種類1抗性標記基因可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子2生化標記基因常用的遺傳標記基因及其作用機制1四環(huán)素抗性基因Tetr，TcrTetracycline可結(jié)合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種399 AAs蛋白質(zhì)，與細菌細胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進入細菌細胞。2氨芐青霉素抗性基因 Ampr ，AprAmpicillin可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的活性。Apr抗性基因編碼一種分泌到細

29、菌細胞周間質(zhì)的酶，可特異地切割氨芐青霉素的3 內(nèi)酰胺環(huán)，使氨芐青霉素失活。氯霉素抗性基因Cmlr , CmrChlorophenicol可結(jié)合在核糖體 50 S亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素乙?；?，導致乙?；穆让顾夭荒芙Y(jié)合在核糖體上。4卡那霉素Kanr,新霉素Neor和G418抗性G418r基因Kanamycin , Neomycin和G418均可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。Kanr等抗性基因均可使這類抗生素磷酸化，使之不能進入細胞內(nèi)。53 半乳糖苷酶基因lacZ和lacZ a 3 半乳糖苷酶基因有1021 AAs a和3鏈lacZ lacZ a 中含有

30、多克隆位點，當無外源 DNA片段插入時，質(zhì)粒表達 3 半乳糖苷酶的a -肽，產(chǎn)生有活性 的3 半乳糖苷酶，在含有指示劑 X-gal和誘導劑IPTG的存在下，菌落呈現(xiàn)蘭色；外源基因的插入后，破壞了 lacZ a -肽基因的結(jié)構(gòu)，細菌內(nèi)不能產(chǎn)生 3 半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。3 半乳糖苷酶基因的優(yōu)點：a.酶催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀；b. lacZ a編碼5 '-端可容許很大的變化 如 參加多克隆位點而不影響酶活性；c. lacZ a和3鏈基因的分別表達可使載體小而容量大分子雜交：是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用標記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出

31、目的分子所處的位置的過程 .分子雜交包括：DNA-DNA 雜交原位雜交、點雜交、Southern雜交，DNA-RNA 雜交Northern雜交及蛋白雜交Western雜交大多數(shù)的核酸雜交反響都是在固體支持物濾膜上進行的。采用濾膜進行核酸雜交是因為它們易于操作及保藏。常用的濾膜有：醋酸纖維素濾膜、重氮芐氧甲基DBM-纖維素膜；氨基苯硫醚APT-纖維素膜，尼龍膜及濾紙等。Probe 雜交探針：探針，是由放射性同位素、生物素或熒光染料等進行標記后，能與目的基因片段特異性雜交的已 知序列的核酸片段根據(jù)探針的來源及核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，及寡核苷酸探針等幾類缺口平移法N

32、ick Translation 標記探針的原理及過程看書DNA雜交常用的方法1斑點雜交dot and slot hybridization用途：用于快捷地檢查出菌落中是否有某個基因，但不能檢出基因的大小或重復的程度。原理及步驟：提取DNA點樣品至膜、枯燥、固定探針、DNA變性、雜交洗膜、放射自顯影結(jié)果分析二. Southern DNA 印跡雜交將重組體DNA用限制酶切割，別離出目的DNA后進行電泳別離，再將其原位轉(zhuǎn)至薄膜上，固定后用探針雜交的方法叫Southern雜交。用途：用來檢查DNA樣品中是否存在有某個特定的基因，而且還可知道其大小及酶切位點的分布。Southern blot 的步驟提取

33、DNA限制酶消化DNA片段電泳別離變性轉(zhuǎn)移至尼龍膜溫育、探針雜交洗膜、放射自顯影、結(jié)果分析三.菌落印跡原位雜交 in situ hybridization讓含重組體的菌落或噬菌斑由平板轉(zhuǎn)移到膜上并釋放出DNA，變性并固定在膜上，再同DNA探針雜交的方法叫原位雜交。用途：用于在轉(zhuǎn)化菌落中篩選帶有目的基因的重組克隆RNA雜交常用方法Northern RNA 印跡雜交將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜或其它化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法，被檢對象為RNA,探針為 DNA或RNA.用途：用來檢查基因組中某個特定的基因是否得到轉(zhuǎn)錄。原理及步驟：提取總RNA提純別離mRNA瓊脂糖凝

34、膠電泳別離 RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜雜交檢測蛋白質(zhì)印跡法(Western bloting)Western blotting 分析(p189)是蛋白質(zhì)分析的技術在基因表達研究中，應用非常廣泛，因為蛋白質(zhì)是基因的產(chǎn)物，研究蛋白質(zhì)的變化來分析判斷基 因轉(zhuǎn)錄的高與低。步驟：細胞t提取總蛋白質(zhì)t聚丙烯酰胺凝膠電泳t轉(zhuǎn)膜(Western blotting，常用醋酸纖維膜固定宀用化學發(fā)光試劑標記(抗體抗原反響)t分析相對量以判斷表達量的多少。PCR(polymerase chain reaction)是模擬體內(nèi) DNA復制條件，應用 DNA聚合酶反響，特異性擴增某一DNA片段的技術。體外程序化的 DNA合成

35、技術。PCR相關技術(看書)群體中每個個體(體細胞)的兩套單倍體DNA是不完全相同的，一般每100500bp就有一個是不相同的，它們多位于內(nèi)含子序列中，表型并沒有改變，這種表現(xiàn)稱為DNA多態(tài)基因多態(tài)性的檢測方法1. PCR-RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)2. PCR-RFLP(Restrict Fragment Length Polymorphroism)3. PCR-SSCP(Single-Stranded Conformation Polymorphroism) rna 的轉(zhuǎn)錄后加工；4. 小衛(wèi)星標記(minisatellite DNA

36、)5. 微衛(wèi)星標記(microsatellite DNA )6. 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism ,SNP)4.基因芯片( Gene chip )分子遺傳標記的應用種質(zhì)資源的遺傳評估、監(jiān)測、保護和利用；遺傳圖譜的構(gòu)建與基因定位；標記輔助選擇第六章原核生物基因表達調(diào)控(定)圍繞基因表達過程中發(fā)生的各種各樣的調(diào)節(jié)方式都通稱為基因表達調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控；轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控；翻譯水平的調(diào)控基因表達的方式1、組成性基因表達指不大受環(huán)境變動而變化的一類基因的表達。如：DNA聚合酶、RNA聚合酶等代謝過程中十分必須的蛋白質(zhì)或酶的表達。某些基因在一個生物個體的幾乎所有細

37、胞中持續(xù)表達，通常被稱為管家基因(house-keeping gene。如：微管蛋白基因、糖酵解酶系基因、核糖體蛋白基因等。2、適應性表達(誘導和阻遏表達)指環(huán)境的變化容易使其表達水平變動的一類基因表達。誘導表達(induction)指在特定環(huán)境因素刺激下，基因被激活，從而使基因的表達產(chǎn)物增加。這類基因稱為可誘導基 因。、阻遏表達(repression)指在特定環(huán)境因素刺激下，基因被抑制，從而使基因的表達產(chǎn)物減少。這類基因稱為可阻遏基 因。協(xié)調(diào)表達在一定機制控制下，功能上相關的一組基因，無論其為何種表達方式，均需協(xié)調(diào)一致、共同表達，即為協(xié)調(diào)表達(coordinate expression),

38、這種調(diào)節(jié)稱為協(xié)調(diào)調(diào)節(jié) (coordinate regulation)。DNA水平：基因喪失；基因擴增；基因重排；甲基化修飾；染色體的機構(gòu)狀態(tài)RNA水平：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控；RNA的轉(zhuǎn)錄后加工； mRNA從核內(nèi)向胞漿轉(zhuǎn)運；mRNA穩(wěn)定性蛋白質(zhì)水平：翻譯過程；翻譯后加工；蛋白質(zhì)穩(wěn)定性原核基因調(diào)控機制的類型1、負調(diào)控negative regulation在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時基因是表達的，參加某種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因活性就被關閉，這樣的控制系統(tǒng)就叫做負控系統(tǒng)。其調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)叫做阻遏蛋白兩種類型：負控誘導和負控阻遏2、正調(diào)控 positive regulation在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時基因是關閉的，參加某種調(diào)節(jié)蛋

39、白質(zhì)后基因活性就被開啟，這樣的控制系統(tǒng)就叫做正控系統(tǒng)。其調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)叫做無輔基誘導蛋白(激活蛋白)兩種類型：正控誘導和正控阻遏系統(tǒng)原核生物基因表達調(diào)控的特點：調(diào)節(jié)的主要環(huán)節(jié)在轉(zhuǎn)錄水平上進行；b因子決定 RNA聚合酶識別特異性；主要通過操縱子模式進行調(diào)節(jié)；阻遏蛋白對轉(zhuǎn)錄的抑制作用阻遏機制是普遍存在的負調(diào)控作用乳糖操縱子與負控誘導系統(tǒng)以及色氨酸與負控誘導系統(tǒng)重點看舉例說明原核生物基因表達調(diào)控的機理。參考在E.coli乳糖操縱子中，其結(jié)構(gòu)基因為lacZ,lacy,lacA,這三個基因別離編碼 3 -D半乳糖苷酶，3 -D半乳糖苷透性酶，3 -D半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。其調(diào)節(jié)基因為 lacI,編碼阻遏蛋白。啟

40、動子為 lacP,操縱基因為lacO。負調(diào)控：當細胞 內(nèi)無引誘物時，阻遏蛋白能夠與操縱基因聯(lián)合。因為操縱基因與啟動子有一定程度的重疊，是以阻礙了RNA聚合酶在-10序列上形成開放性的啟動子復合物。當細胞內(nèi)有引誘物存在時，弓I誘物以極高的濃度與阻遏蛋白快速聯(lián)合，從而 改變了阻遏蛋白的構(gòu)象，使之快速地從操縱基因上解離下來。這樣，RNA聚合酶就能與啟動子牢固聯(lián)合并形成開放性啟動子復合物，從而開始轉(zhuǎn)錄lacZYA結(jié)構(gòu)基因。正調(diào)控：cAMP-CAP復合物是乳糖操縱子的正調(diào)控因子。乳糖啟動子有兩個CAP聯(lián)合位點，一個是在-70到-50 位點I ,另一個是在-50-D-40 位點II 。位點I包含一個逆向反

41、復序列， 這彷佛是大多數(shù)強聯(lián)合位點的特征。位點II是一個很弱的聯(lián)合位點，但是當cAMP-CAPM合物聯(lián)合于位點I時，位點II聯(lián)合cAMP-CAP復合物的能力顯著提高。一旦位點II被占領，RNA聚合酶就很快與-35序列聯(lián)合，然后在于-10序列聯(lián)合。轉(zhuǎn)錄水平上其他的調(diào)控方式，以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控看書第八章真核基因表達與調(diào)控真核生物基因表達的調(diào)控的水平DNA水平的調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控；轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控；翻譯水平的調(diào)控；翻譯后水平的調(diào)控；真核基因組的結(jié)構(gòu)特點1、在真核細胞中，一條成熟的 mRNA鏈只能翻譯出一條多肽鏈，不存在原核生物中常見的多基因操縱子形式。2、 真核細胞DNA都與組蛋白和大量非組蛋白相結(jié)合，

42、只有一小局部DNA是裸露的。3、高等真核細胞 DNA中很大局部是不轉(zhuǎn)錄的，大局部真核細胞的基因中間還存在不被翻譯的內(nèi)含子。4、 真核生物能有序地根據(jù)生長發(fā)育階段的需要進行DNA片段重排，還能在需要時增加細胞內(nèi)某些基因的拷貝數(shù)。5、 在真核生物中，基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)相對較大，一般通過改變整個所控制基因5 '上游區(qū)DNA構(gòu)型來影響它與 RNA 聚合酶的結(jié)合能力。在原核生物中，轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)都很小，大都位于啟動子上游不遠處，調(diào)控蛋白結(jié)合到調(diào)節(jié)位點上可直接促進或抑 RNA聚合酶與它的結(jié)合。6、真核生物的RNA在細胞核中合成，只有經(jīng)轉(zhuǎn)運穿過核膜，到達細胞質(zhì)后，才能被翻譯成蛋白質(zhì)，原核生物中不存 在這

43、樣嚴格的空間間隔。7、許多真核生物的基因只有經(jīng)過復雜的成熟和剪接過程才能順利地翻譯成蛋白質(zhì)?；蚣易宥x：真核基因組中來源相同 ，結(jié)構(gòu)相似,功能相關的一組基因.可能由某一共同祖先基因經(jīng)重復和突變產(chǎn)生。外顯子與內(nèi)含子的可變調(diào)控組成型剪接：切除內(nèi)含子后，將外顯子標準地拼接成成熟的mRNA，稱為組成型拼接。這樣一個基因只產(chǎn)生一種成熟的mRNA，也只產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)產(chǎn)物。選擇性剪接：可調(diào)控的選擇性拼接，因而產(chǎn)生不同的成熟mRNA，翻擇產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。真核生物DNA水平上的基因表達調(diào)控“開放 型活性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對轉(zhuǎn)錄的影響；基因擴增；基因重排與轉(zhuǎn)換；基因喪失；基因擴增是指某些基因的拷貝數(shù)專一性大量增加的現(xiàn)

44、象，它使得細胞在短期內(nèi)產(chǎn)生大量的基因產(chǎn)物以滿足生長發(fā)育的需要，是基因活性調(diào)節(jié)的一種方式.一個基因可以從遠離其啟動子的地方移到距它很近的位點而被啟動轉(zhuǎn)錄，即在DNA水平上由無功能的基因片斷組合重排成為有功能的基因單位的過程，叫做基因重排基因喪失:有的生物個體發(fā)育早期在體細胞中要喪失局部染色體，而在生殖細胞中保持全部的基因組DNA甲基化與基因活性的調(diào)控DNA的甲基化：DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化那么誘導了基因的重新活化與表達；DNA的甲基化能提高該位點的突變頻率，因而可作為誘變劑或致癌因子調(diào)節(jié)基因表達。甲基化的類型：5甲基胞嘧啶；N6 甲基腺嘌呤；7甲基鳥嘌呤DNA的甲基化機制基因轉(zhuǎn)

45、錄的機理甲基化到達一定程度時會發(fā)生從常規(guī)的B-DNA向Z-DNA的過渡。又由于 Z-DNA結(jié)構(gòu)收縮，螺旋加深，使許多蛋白質(zhì)因子賴以結(jié)合的元件縮入大溝而不利于基因轉(zhuǎn)錄的起始。DNA甲基化導致某些區(qū)域 DNA構(gòu)象變化，影響蛋白質(zhì)與 DNA的相互作用；抑制轉(zhuǎn)錄因子與啟動區(qū) DNA的結(jié)合效 率。真核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控RNA聚合酶；順式作用元件；反式作用因子；轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控真核基因啟動子由核心啟動子和上游啟動子元件 UPE 兩個局部組成.在基因轉(zhuǎn)錄起始位點+1及其5 上游大約100200bp以內(nèi)的一組具有獨立功能的DNA序列.決定RNA聚合酶H轉(zhuǎn)錄起始點和轉(zhuǎn)錄頻率的關鍵元件核心啟動子core promo

46、ter保證RNA聚合酶n轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的、最少的DNA序列。包括轉(zhuǎn)錄起始位點及轉(zhuǎn)錄起始位點上游-25-30bp處的TATA盒。核心啟動子單獨起作用時，只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點并產(chǎn)生根底水平的轉(zhuǎn)錄上游啟動子元件upstream promoter element, UPE包括通常位于-7Obp附近的CAAT盒CCAAT和GC盒 GGGCGG等。能通過形成轉(zhuǎn)錄前復合物調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率，提高轉(zhuǎn)錄效率。增強子 enhancer：能使與它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增加的DNA序列.一般與轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合，通過作用于轉(zhuǎn)錄起始復合物增強RNA聚合酶的活性，從而促進轉(zhuǎn)錄增強子和啟動子常交錯覆蓋或連續(xù).增強子 的特性：增強效應十清楚