細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)

1、第二節(jié)細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)節(jié)概述細(xì)菌的培養(yǎng)技術(shù)是微生物實(shí)驗(yàn)中基本技術(shù)之一。大多數(shù)細(xì)菌均可用人工方法培養(yǎng)，只有將細(xì)菌培養(yǎng)出來(lái)才能對(duì)它進(jìn)行研究和鑒定知識(shí)點(diǎn)導(dǎo)航一.培養(yǎng)基的種類(lèi)培養(yǎng)基（culturemedium）是細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的人工制品。適宜的培養(yǎng)基能使細(xì)菌在體外迅速生長(zhǎng)繁殖，便于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離和鑒別?？煞譃榛A(chǔ)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、厭氧菌用培養(yǎng)基和特殊培養(yǎng)基。只含有細(xì)菌生長(zhǎng)所需的最基本營(yíng)養(yǎng)成分，應(yīng)用最廣泛，為制備多種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)，常見(jiàn)的有肉湯培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基。（二）營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入葡萄糖、血液、血清、腹水或酵母浸膏等有機(jī)物，可供營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌

2、生長(zhǎng)需要或增菌用。如結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基中添加雞蛋、馬鈴薯、甘油等。（三）選擇培養(yǎng)基利用不同種類(lèi)細(xì)菌對(duì)化學(xué)物質(zhì)的敏感性不同而制成，使分離菌大量繁殖而抑制其它細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中含有的抑制劑能抑制非目的菌生長(zhǎng)或使其生長(zhǎng)不佳，有利于目的菌的檢出和識(shí)別O選擇培養(yǎng)基多為固體平板，用于從標(biāo)本中分離某些特定的細(xì)菌。（四）鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加有某些特定成分，如糖、醇類(lèi)和指示劑等，用于檢查細(xì)菌的各種生化反應(yīng)，以資鑒別和鑒定細(xì)菌。（五）厭氧菌用培養(yǎng)基專(zhuān)性厭氧菌須在無(wú)氧條件下才能生長(zhǎng)，故需在培養(yǎng)基中加入半胱氨酸、硫乙醇酸鈉等還原劑，降低培養(yǎng)基中氧化還原電勢(shì)，并應(yīng)與外界空氣隔絕，使培養(yǎng)基本身為無(wú)氧的環(huán)境。（六）

3、特殊培養(yǎng)基為某些需要在特殊條件下才能生長(zhǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)之用。如高滲鹽增菌培養(yǎng)基、高滲糖增菌培養(yǎng)基、改良Kagan氏培養(yǎng)基等。2 .培養(yǎng)基的制備制備一般培養(yǎng)基的主要過(guò)程基本相似，包括調(diào)配、溶化、調(diào)整pH、過(guò)濾、分裝、滅菌及檢定和保存。3 .細(xì)菌檢驗(yàn)室的注意事項(xiàng)及無(wú)菌技術(shù)細(xì)菌培養(yǎng)必須隨時(shí)為防止污染和病原菌的擴(kuò)散而進(jìn)行操作，即無(wú)菌操作。細(xì)菌檢驗(yàn)室的注意事項(xiàng)如下：1 .細(xì)菌的培養(yǎng)應(yīng)在接種罩或無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行。有條件的實(shí)驗(yàn)室可在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。2 .用接種環(huán)分離和移種細(xì)菌時(shí)，用前用后均需滅菌處理。一般采用火焰滅菌法。3 .從培養(yǎng)瓶或試管培養(yǎng)物中取標(biāo)本或移種時(shí)，在打開(kāi)瓶口、管口或關(guān)閉前，均要在火焰上通過(guò)23次。

4、切不可將含菌材料污染臺(tái)面和其他物體。4 .如不慎將試管等打破造成菌液污染時(shí)，不要驚慌，應(yīng)立即報(bào)告負(fù)責(zé)人，然后用3%來(lái)蘇或5%石炭酸處理污染臺(tái)面或地面，至少浸泡30分種。5 .工作完畢后，用紫外光燈照射30分鐘，或用3%來(lái)蘇擦拭臺(tái)面，并清洗雙手。四、接種環(huán)和接種針使用接種環(huán)和接種針由三部分組成，即環(huán)（針）部分、金屬柄部分和絕熱柄部分。接種環(huán)和接種針通常選用電熱（銀）絲，環(huán)的直徑隨使用目的而不同，一般多為24mm,環(huán)和針的長(zhǎng)度為4050mm。接種環(huán)（針）使用前后均應(yīng)進(jìn)行滅菌處理，將接種環(huán)（針）末端直立火焰中，燒紅銀絲部分，再使接種環(huán)（針）金屬柄旋轉(zhuǎn)通過(guò)火焰3次滅菌，冷卻后用以取菌或待試標(biāo)本。使用接

5、種環(huán)（針）完畢后立即將染菌的銀絲部分于還原焰（內(nèi)焰）中加熱，烤干環(huán)（針）端附著的細(xì)菌或標(biāo)本，以免環(huán)（針）上殘余的細(xì)菌或標(biāo)本因突受高熱，爆烈四濺，而污染環(huán)境和導(dǎo)致傳染危險(xiǎn)。然后再移于氧化焰（外焰）中燒紅滅菌，最后將金屬柄部分往復(fù)在火焰中通過(guò)3次。用完后的接種環(huán)（針），應(yīng)立即擱置于架上，切勿隨手棄置，以免灼焦臺(tái)面或其他物件。五、接種操作區(qū)為避免在接種過(guò)程中污染環(huán)境以及空氣中的細(xì)菌污染培養(yǎng)物，接種均應(yīng)在接種罩或無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行，此外細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室所必需的設(shè)備還包括無(wú)菌工作臺(tái)、生物安全柜和生物安全實(shí)驗(yàn)室。（一）接種罩接種罩的式樣很多，可用木框和玻璃制成，亦有用有機(jī)玻璃制成。接種罩在用前先以3%石炭酸或來(lái)蘇輕

6、拭，內(nèi)需裝有紫外線(xiàn)殺菌燈，用前可先行照射，以保證罩內(nèi)無(wú)塵埃和細(xì)菌。操作結(jié)束后，應(yīng)立即清理內(nèi)部，并作罩內(nèi)消毒處理。（二）無(wú)菌工作臺(tái)又稱(chēng)超凈工作臺(tái)（supercleanbench）,目前多采用垂直層流的氣流形式。通過(guò)變速離心風(fēng)機(jī)將負(fù)壓箱內(nèi)經(jīng)過(guò)預(yù)濾器過(guò)濾的空氣壓入靜壓箱，再經(jīng)高效過(guò)濾器進(jìn)行二級(jí)過(guò)濾，從出風(fēng)面吹出的潔凈氣流，以一定的和均勻的斷面風(fēng)速通過(guò)工作區(qū)時(shí)，將塵埃顆粒和微生物顆粒帶走，從而形成無(wú)塵無(wú)菌的工作環(huán)境。使用時(shí)應(yīng)提前50分鐘打開(kāi)紫外線(xiàn)殺菌燈，30分鐘后關(guān)閉并啟動(dòng)送風(fēng)機(jī)。凈化區(qū)內(nèi)嚴(yán)禁存放不必要的物件，以保持潔凈氣流型不受干擾。（三）無(wú)菌室無(wú)菌室又稱(chēng)潔凈室（cleanroom）,是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部

7、安裝的用于無(wú)菌操作的小室。室內(nèi)應(yīng)有空氣過(guò)濾裝置、紫外線(xiàn)殺菌燈等。（四）生物安全柜（biologicalsafetycabinet,BSC）目前微生物試驗(yàn)中多采用生物安全柜，是為操作原代培養(yǎng)物、菌（毒）株以及診斷性標(biāo)本等具有感染性的實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，用來(lái)保護(hù)操作者本人、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境以及實(shí)驗(yàn)材料，使其避免暴露于上述操作過(guò)程中可能產(chǎn)生的感染性氣溶膠和濺出物而設(shè)計(jì)的負(fù)壓過(guò)濾排風(fēng)柜。（五）生物安全實(shí)驗(yàn)室（BiosafetyLaboratory）,簡(jiǎn)稱(chēng)“BS改驗(yàn)室”，是指通過(guò)規(guī)范的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)設(shè)備的配置、個(gè)人防護(hù)裝備的使用等建造的實(shí)驗(yàn)室。在結(jié)構(gòu)上由一級(jí)防護(hù)屏障（安全設(shè)備）和二級(jí)防護(hù)屏障（設(shè)施）構(gòu)成，實(shí)驗(yàn)室生物安

8、全防護(hù)的安全設(shè)備和設(shè)施的不同組合，構(gòu)成了四級(jí)生物安全防護(hù)水平，一級(jí)為最低。六、接種法根據(jù)待檢標(biāo)本的性質(zhì)，培養(yǎng)目的及所用培養(yǎng)基的種類(lèi)，采用不同的接種方法。常用的有平板劃線(xiàn)分離培養(yǎng)法、斜面接種法、液體接種法和穿刺接種法。（一）平板劃線(xiàn)分離培養(yǎng)法分離培養(yǎng)法就是通過(guò)劃線(xiàn)使標(biāo)本或培養(yǎng)物中混雜的多種細(xì)菌在培養(yǎng)基表面逐一分散生長(zhǎng)，各自形成菌落，以便根據(jù)菌落形態(tài)及特征，挑選單個(gè)菌落，經(jīng)過(guò)移種而獲得純種細(xì)菌（純培養(yǎng)）。分離細(xì)菌最常用的為平板劃線(xiàn)分離法。1 .將接種環(huán)火焰滅菌，待冷卻后取標(biāo)本或混合菌液。2 .用左手持起平板，使平皿蓋向上放于臺(tái)面上或打開(kāi)平皿蓋。3 .左手斜持（45c角）平板，右手持已取材的接種環(huán)，

9、在酒精燈上方56cm處作連續(xù)劃線(xiàn)法分離細(xì)菌。劃線(xiàn)時(shí)，接種環(huán)與平板呈3040。角，輕輕接觸平板，以腕力平行滑動(dòng)接種環(huán)。應(yīng)避免將瓊脂劃破。先在平板上l/5處輕輕涂布，然后即可左右來(lái)回以作連續(xù)劃線(xiàn)接種，線(xiàn)與線(xiàn)間留有適當(dāng)距離，做到線(xiàn)密而不重復(fù)，將整個(gè)平板表面布滿(mǎn)劃線(xiàn)。如果菌量較大可采用分區(qū)劃線(xiàn)法?？蓪⑵矫蠓譃槿舾蓚€(gè)區(qū)（一般為5個(gè)區(qū)）。先在平板上l區(qū)輕輕涂布，再在2,3區(qū)劃線(xiàn)。每劃完一個(gè)區(qū)域，均將接種環(huán)滅菌一次，冷后再化下一個(gè)區(qū)域。每一區(qū)域的劃線(xiàn)均接觸上一區(qū)域的接種線(xiàn)l2次，使菌量逐漸減少，以獲得單個(gè)菌落（見(jiàn)圖20-1）。圖20-1細(xì)菌分離接種法4 .劃線(xiàn)完畢，蓋好皿蓋，做好標(biāo)記將平皿倒置，置37c培養(yǎng)

10、1824小時(shí)后觀(guān)察結(jié)果。（二）斜面接種法主要用于劃線(xiàn)分離培養(yǎng)所獲得的單個(gè)菌落的移種，以得到純種細(xì)菌和保存菌種，以及觀(guān)察細(xì)菌的某些培養(yǎng)特性。1 .取菌種管置左手食指、中指、無(wú)名指之間，拇指壓住管底部上側(cè)面。2 .火焰滅菌接種環(huán)。3 .以右手小指與手掌拔取棉塞（如同時(shí)持有兩管，可用小指與無(wú)名指拔取另一棉塞），將管口迅速通過(guò)火焰l2次。4 .將已滅菌的接種環(huán)伸入菌種管中，從斜面上取少許菌，迅速伸入待接種的培養(yǎng)基管中，在斜面底部向上劃一條直線(xiàn)，然后從底部起向上作曲折連續(xù)劃線(xiàn)，直至斜面上方頂端。37c孵箱中培養(yǎng)1824小時(shí)即可觀(guān)察結(jié)果。（三）液體接種法肉湯、陳水、發(fā)酵管等均系液體培養(yǎng)基。用于增菌，觀(guān)察細(xì)

11、菌生長(zhǎng)現(xiàn)象和檢測(cè)細(xì)菌的生化反應(yīng)等。1 .持好菌種管及培養(yǎng)基管。2 .滅菌接種環(huán)，由菌種管取菌，伸入培養(yǎng)基管中，在接近液面的管壁上方輕輕研磨，并沾取少許培養(yǎng)基液體調(diào)和，使接種物充分混合于培養(yǎng)基的液體中。3 .液體培養(yǎng)一般以1824小時(shí)觀(guān)察生長(zhǎng)特征為好。（四）穿刺接種法試管內(nèi)半固體培養(yǎng)基采用此法接種，多用于保存菌種、觀(guān)察動(dòng)力及做厭氧培養(yǎng)等。亦可用于觀(guān)察細(xì)菌的某些生化反應(yīng)。1 .持好菌種管和培養(yǎng)基管。2 .以滅菌接種針從菌種管取菌。3 .接種針直刺入培養(yǎng)基的中心（半固體或一般瓊脂高層）直達(dá)管底部（深入培養(yǎng)基3/4處）或沿管壁刺入（醋酸鉛高層），接種后接種針應(yīng)沿原路退出。4 .經(jīng)培養(yǎng)后即可觀(guān)察結(jié)果。沿

12、穿刺線(xiàn)生長(zhǎng)，線(xiàn)外的培養(yǎng)基清亮者表示細(xì)菌無(wú)動(dòng)力；穿刺線(xiàn)模糊不清，或沿穿刺線(xiàn)向外擴(kuò)散生長(zhǎng)，或整個(gè)培養(yǎng)基混濁者表示細(xì)菌有動(dòng)力。七、培養(yǎng)法根據(jù)培養(yǎng)目的和細(xì)菌的種類(lèi)選用最適宜的培養(yǎng)方法。常用的有一般培養(yǎng)法、二氧化碳培養(yǎng)法和厭氧培養(yǎng)法。（一）一般培養(yǎng)法一般培養(yǎng)法系指需氧菌或兼性厭氧菌等在需氧條件下的培養(yǎng)方法，故又稱(chēng)需氧培養(yǎng)法。將已接種好的置37c孵箱中培養(yǎng)1824小時(shí)。但標(biāo)本中菌量很少或難于生長(zhǎng)的細(xì)菌（如結(jié)核分技桿菌）需培養(yǎng)37天甚至l個(gè)月才能生長(zhǎng)。（二）二氧化碳培養(yǎng)法某些細(xì)菌的培養(yǎng)，需要510%二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)才能生長(zhǎng)良好。可采用二氧化碳孵箱，它能自動(dòng)調(diào)節(jié)二氧化碳的濃度和溫度，使用極為方便。傳統(tǒng)的方法則采用燭缸法，將培養(yǎng)基放入缸內(nèi)，點(diǎn)燃蠟燭放在缸中，加蓋（涂以凡士林）密閉。因燃燒而產(chǎn)生CO2大約占510%,基本可滿(mǎn)足細(xì)菌培養(yǎng)的要求