TNF介紹講解學習

1、1、 TNF的發(fā)現及發(fā)展歷史目前普遍認為，TNF最早是1975年由Carswell發(fā)現的。Carswell在研究中觀察到，經卡介苗致敏的小鼠被注射大腸桿菌內毒素后，血清中出現一種物質，該物質在體內可以使移植腫瘤發(fā)生出血、壞死，遂將該物質命名為腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor,TNF）1。其實早在十九世紀后期，Coley等就觀察到，當腫瘤患者伴有感染時，其腫瘤偶爾可以消退甚至痊愈?；谶@些發(fā)現，Coley等開始用一些滅活的G+和G-細菌混合物作為疫苗，來治療惡性月中瘤，稱為“Coley毒素”療法2。Coley毒素的應用，大大提高了軟組織腫瘤患者的生存率，這在當時獲得了較高的評

2、價。1936年，隨著Coley的去世，人們對Coley菌苗的興趣被廣泛應用的化療和放療所取代。100多年后的今天，當人們再次關注“Coley毒素”療法的時候，發(fā)現該療法的主要原理之一就是通過誘導體內產生大量的TNF來實現抗腫瘤作用的3。自Carswell發(fā)現TNF后，許多學者進行的其他研究均觀察到TNF在體外和體內對多種月中瘤細胞有明顯的細胞毒作用。1984年Pennica等首次克隆了人TNF-a的cDNA,并在大腸桿菌中表達成功4o隨后，即有許多學者致力于將TNF應用于臨床的研究5。自1987年起，在歐洲（德國、英國、法國、波蘭、埃及等）、美國、日本等地陸續(xù)有進行TNFI期和II期臨床試驗的

3、報道6。但臨床試驗的結果給對TNF滿懷希望的人們帶來的是失望。TNF類似嚴重感染所致的不良反應令患者難以耐受，而患者可以耐受的劑量似乎達不到抗腫瘤的濃度7。一時間TNF的臨床研究陷入了低谷，進一步的臨床研究幾乎停滯。由于TNF明確的抗腫瘤活性，使得不少學者不愿輕易放棄對其的研究。90年代中期以來，陸續(xù)有臨床研究者報道了TNF局部用藥的臨床結果8。證明TNF局部用藥（大劑量局部灌流、腫瘤內注射、腔內注射等）既可達到良好的抗腫瘤效果，又可避免全身用藥的嚴重副作用，這一發(fā)現重新燃起了人們對TNF的熱情。隨著對TNF結構和作用機制的深入研究，一些高效、低毒的TNF變構體不斷涌現，TNF的臨床研究又有了

4、新的進展。2、 TNF的生物學活性TNF是一種真正的多效因子，具有多種生物學效應。它可直接作用于T細胞、B細胞、Md、NK細胞等效應細胞，在細胞水平上發(fā)揮作用。1. 與受體結合，引起細胞破壞、死亡TNF與相應的受體結合后可向細胞內轉移，被靶細胞溶酶體攝取導致溶酶體穩(wěn)定性降低，各種酶外泄，引起細胞溶解9。也有認為TNF通過激活磷脂酶A2,釋放超氧化物而引起DNA斷裂10。TNF尚可改變靶細胞糖代謝，使細胞內pH降低，導致細胞死亡11。2. 損傷內皮細胞，激活凝血系統(tǒng)TNF可作用于血管內皮細胞，使內皮細胞損傷或導致血管功能紊亂12；通過激活凝血系統(tǒng)的活性，導致血管內血栓形成，引起組織供血障礙13。

5、3. 引起機體發(fā)熱TNF作為內源性致熱原，引起發(fā)熱的機制可能是通過直接刺激下丘腦體溫調節(jié)中樞和刺激巨噬細胞釋放IL-1而引起，還可通過IL-1、TNF-a刺激其它細胞產生IL-614。4. 促進細胞的增殖和分化，調節(jié)機體免疫功能TNF促進T細胞MHCI類抗原表達，增強IL-2依賴的胸月M細胞、T細胞增殖能力，促進IL-2、CSF和IFN-丫等淋巴因子產生，增強有絲分裂原或外來抗原刺激B細胞的增殖和Ig分泌15；它能促進T細胞及其它殺傷細胞對腫瘤細胞的殺傷，并增強CTL對病毒感染細胞的殺傷作用16。5. 抑制新骨生成、刺激骨吸收TNF在體外可刺激骨質破壞和再吸收，抑制新骨形成17。將重組TNF加

6、入體外骨培養(yǎng)物可使多核的破骨細胞數增加，礦化的骨質質量下降，骨膠原(骨質的主要成分)合成抑制。TNF刺激骨吸收是通過誘導成骨細胞產生一種可溶性因子完成的18。6. 激活嗜中性粒細胞和巨噬細胞嗜中性粒細胞是一種特殊的白細胞，它可提供第一道防線，吞噬或殺傷入侵的微生物。在急性炎癥反應階段，它抗擊入侵微生物的同時，也可使宿主組織發(fā)生損傷。TNF-a刺激嗜中性粒細胞可引起噬菌作用、脫顆粒作用和呼吸爆發(fā)活動的增加19。TNF可提高中性粒細胞的吞噬能力，增加過氧化物陰離子產生。同時TNF-a可提高中性粒細胞合成PAF的作用并可促進中性粒細胞粘附到內皮細胞上20。TNF-a也可促進單核巨噬細胞的活化，加速I

7、L-2受體的表達2103、 TNF抗腫瘤作用的機制TNF最明顯的活性特征是可以在體內或體外特異性殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞無明顯的毒性作用，且抗腫瘤作用沒有明顯的種族特異性22。目前認為TNF的抗腫瘤機制主要有以下幾個方面：1. 通過TNF受體介導的對腫瘤細胞的直接殺傷作用對TNF敏感的腫瘤細胞表面存在TNF受體(TNFR)，TNF通過與該受體結合，引發(fā)細胞的一系列變化，最終導致腫瘤細胞的死亡。研究發(fā)現，TNF經過TNFR的識別、結合、內吞，導致一系列的變化，膜蛋白特異性磷酸化，產生大量熱能，溶酶體酶類高度活化，膜通透性增加，蛋白酶類溢出，導致細胞溶解；也有證據表明，TNF與受體結合后可使細胞

8、的線粒體產生的自由基增加，使質膜過氧化，引起細胞損傷23。2. 抑制細胞生長和誘導凋亡。TNF與受體結合后，可通過細胞內的一系列級聯反應，誘導腫瘤細胞凋亡。TNF直接抑制細胞生長的作用也通過腫瘤細胞表面的特異性受體介導24。主要通過影響其蛋白質的代謝，導致腫瘤蛋白質合成減少，分解增加，從而抑制腫瘤生長25。3. 通過損傷腫瘤的血供系統(tǒng)而導致腫瘤的壞死月中瘤的血液供應豐富，對血液供應所減少較為敏感。TNF-a除了對月中瘤細胞具有細胞毒性作用之外，更重要是它能摧毀實體瘤周圍的血管上皮組織，并且通過血栓的形成，阻斷腫瘤的血液營養(yǎng)供應，最終導致腫瘤的出血性壞死、消退和消失26。另外，一般腫瘤周圍血管組

9、織是沒有規(guī)則和不完善的，它們表現為血管的多曲折性和多結性等。而且有些實體瘤本身發(fā)生就是缺氧下選擇性克隆產生的，遠離血管，因此化療藥物很難預期達到這些腫瘤周圍并發(fā)揮作用27，而TNF-a能明顯降低實體瘤周圍間隙組織的壓力，擴大月中瘤周圍上皮組織的間隙，并改變腫瘤周圍血管的通透性，使聯用的化療藥物到達這些靶組織周圍,而且TNF-a能延長藥物在月中瘤周圍的持續(xù)時間，發(fā)揮抗月中瘤作用28oTNF還可有促凝作用，可引起腫瘤部位血管內的血栓形成，從而阻斷腫瘤的血液供應。超過一定濃度的TNF-a具有明顯的抗新生血管形成作用。有報道顯示TNF-a對形成不超過9天的新生血管組織抑制作用更強烈29。有新的實驗證據

10、顯示30,TNF-a聯合其他藥物能在分子水平上明顯抑制整合素（integrin）av03的活性（這種整合素在腫瘤的新血管形成中起重要作用），進而在動物模型中引發(fā)腫瘤血管上皮細胞的解體和凋亡，而這種作用不傷害周圍正常血管上皮組織。這個實驗為TNF-a有選擇性的抑制月中瘤血管上皮組織的作用提供了分子基礎。4. 通過引起腫瘤局部的炎癥反應和機體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用TNF-a是一種細胞因子，它對人體免疫系統(tǒng)具有很重要的調節(jié)作用31o例如，TNF-a對免疫細胞樹突狀細胞具有催熟作用，具有激活和刺激T細胞作用32 oTNF-a可導致月中瘤局部的炎癥反應，增強單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞的殺傷作用，增

11、強T細胞的增殖和殺傷作用，還可誘導產生其他細胞因子如IL-2、IFN等，通過“級聯作用”發(fā)揮更強的殺月中瘤活性。另外，TNF-a通過對核內基因的調控，促進腫瘤抑制基因P53的表達33，從而加強機體自身的抗腫瘤作用34。5. 逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥，增加對化療藥物的敏感性TNF可以逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥，增加對化療藥物的敏感性，因而與化療藥物有較好的協同作用。用對阿霉素耐藥的K562細胞株進行研究的結果顯示，TNF-a可使K562細胞的耐藥性有明顯的逆轉34。局部灌流治療時觀察到，TNF可使美法倫在腫瘤局部的濃度提高，從而提高美法倫的抗腫瘤活性35。總之，TNF在整體的抗腫瘤機制較為復雜，目前仍

12、有未完全清楚的地方。但普遍的觀點認為，除了直接的對腫瘤細胞的殺傷作用外，機體的免疫狀況、腫瘤的特性等均在其中起著較為重要的作用。四、TNF-a誘導的針對腫瘤細胞的細胞毒性作用的途徑和機制TNF-a對月中瘤細胞直接的細胞毒作用主要是通過TNF特異性的受體完成的360細胞膜上的TNF-a受體是跨膜蛋白，其N端位于胞外，C端位于胞內。受體有兩種亞型37，即TNFR1和TNFR2。這兩類受體蛋白質的相對分子質量分別為55kDa和75kDa,故又將其稱為P55R（即TNFRi）和P75R（即TNFR2）。兩種受體在細胞類型的分布上沒有特異性38。這兩種受體的胞外部分有部分的同源性，但是在胞內部分幾乎沒有

13、同源性39。TNFR1介導了TNF的主要生物活性反應，在細胞損傷、誘導SOD及抗病毒活性、成纖維細胞增殖、誘導細胞凋亡、激活NK-kB等多種生物活性的信號傳遞方面起重要的作用；而TNFR2主要傳遞胸腺細胞和NK細胞等的淋巴細胞的增殖信號40圖1.顯示了TNFRi與受體結合后所引發(fā)的一系列細胞內信號傳導及反應0005DOSTNFRi的C端含有一段由90個氨基酸組成的死亡結構域(deathdomain,DD)。TNF-a信號的起始是TNF-a三聚體與TNFRi的胞外部分結合。TNFRi的胞內部分在非活性狀態(tài)下它的死亡結構域上結合了一種被稱SODD(silencerofdeathdomai。的蛋白質

14、，起到抑制TNFRi三聚體化的作用。當TNF-a與TNFRi結合后，SODD就從TNFRi的死亡結構域上釋放出來，通過細胞中的一系列接頭蛋白(adaptorprotein)來實現TNFRi的活性。第一個連接上去的接頭蛋白是TNF-a受體相關死亡結構域蛋白(TNFreceptor-associateddeathdomain,TRADD)。它通過自身的死亡結構域與TNF-aRi的死亡結構域結合4i。TRADD隨后又活化另外三個接頭蛋白：FADD(Fas-associateddeathdomain),TRAF2(TNF-Rassociatedfactor2及RIP(receptor-interact

15、ingprotein)結合，后者又各自匯集起始不同信號途徑的蛋白，產生不同的效應42。TNFRi與TNF結合后的信號傳導主要有以下幾個途徑。1.FADDcaspase-腌徑FADD43的C端含有死亡結構域，N端含有一段起調節(jié)作用的功能區(qū)，是介導凋亡信號傳導所必需的，稱為死亡效應結構域(deatheffectordomain，DED)44。當TRADD結合到TNFR1后，FADD通過自身的死亡結構域與TNFR1-TRADD結合，激活了FADD。細胞內caspase-M體中的死亡效應結構域與FADD的死亡效應結構域結合，從而使caspase-81F體寡聚化，caspasesl一種存在于細胞質中的和

16、細胞凋亡有關的蛋白酶45o寡聚化的caspase-M體發(fā)生自剪接作用產生有活性的caspase-8后者又激活caspase-3fficaspase-7接下去caspase-雙激活caspase-6如此啟動caspase勺級聯反應，最后導致細胞凋亡。2 .TRAF2JNK途徑第二個接頭蛋白是TRAF2。TRAF2又激活MAPKKK(mitogen-activatedproteinkinasekinasekinase)，即MEKK(1extracellularsignal-regulatedkinasekinasekinasei)或ASKi(apoptosis-stimulatedkinasei)

17、。MEKK1或ASKi又激活MKK7或JNKK246，后者又激活JNK。一旦JNK被激活，JNK蛋白就進入到細胞核內，磷酸化激活c-Jun,增進基因的表達，從而促進細胞凋亡的發(fā)生。3 .TRAF2NF-kB途徑TRAF2還激活NIK(NF-kBinducingkinase),NIK又去激活IKKs47。IKK復合體包含兩個催化亞單位IKKa、IKKB和一個調控亞單位IKK丫/NEMO(NF-kBessentialmodulator')48,還包含一個由Cdc37和Hsp90組成的激酶特異性分子伴侶。它們負責在細胞質和細胞膜之間運輸這個復合體49。沒有活性的核內調控因子NF-kB是存在在

18、細胞質中的50。TNF-a處理幾分鐘后，IKK被激活，IKK丫使NF-kB上的抑制因子IkB基團磷酸化51。磷酸化的IrB又發(fā)生多泛素化(polyubiquitinated)并迅速被蛋白酶體(proteasomR降解，因此活化的NF-kB分子量變小，進而能穿過核膜進入核內調控各種基因52o其結果是抑制細胞凋亡和促進炎癥反應以及各種免疫反應53。4 .TRAF2cIAPs途徑TRAF2可以匯集抑制細胞凋亡的蛋白cIAP-i和cIAP-2(cellularinhibitorofapoptosisprotein-1/-2）54。cIAP-1和cIAP-2是存在在細胞質中的抗凋亡蛋白，有泛素蛋白連接酶

19、活性，可抑制細胞的凋亡。5 .RIPNF-kB途徑結合在TRADD上的第三種接頭蛋白是RIP（receptor-interactingprotein）。它主要通過IKK復合體來誘導NF-kB途徑?；蛱蕹龑嶒炞C明：TNF-a受體1是主導的受體反應55;而TNF-a受體2則活化一種接頭蛋白TRAF2的反應56。近期的研究還發(fā)現，一條途徑的減弱會增強另一條途徑的效應叼。例如：缺少NF-kB活性時，細胞對TNF-a誘導的凋亡敏感性增加58,同樣nf-kB活性增強，細胞就不容易發(fā)生凋亡59。另外，缺少NF-kB時，細胞由TNF-a誘導的JNK活性會增強60,而由NF-kB激活的幾個基因產物（gadd4

20、5B和XIAP）則會抑制JNK活性61。而且，NF-kB的激活促進屋B和其它抑制細胞凋亡的因子（cIAPs）的重新合成62,從而增加了對TNF-a信號調控的持續(xù)性63。五、野生型TNF-a和TNF-a變構體的結構體內有多種細胞可釋放具有TNF活性的細胞因子，人們把由活化的巨噬細胞釋放的TNF,命名為TNF-a,而將源于淋巴細胞，具有TNF樣抗月中瘤作用的淋巴毒素稱為TNF-B64,新近又將自然殺傷細胞NK產生的NK細胞因子稱為TNF-T65。成熟的人TNF-a蛋白由157個氨基酸殘基組成，3個相同的TNF-a單體亞單位以邊對面的形式形成三聚體結構。圖2.為TNF-a的結構示意圖。由于野生型的T

21、NF-a在臨床試用后出現了較為嚴重的毒性作用，曾使TNF全身用藥的臨床試驗陷入停頓。但TNF-a明確的殺傷月中瘤細胞的活性使得科研人員不愿輕易放棄對其的研究。除了不斷探索其不同的給藥途徑外，人們試圖通過對其結構進行改造，以期獲得高效低毒的TNF變構體。八十年代中期，研究人員用“隨機突變法”和“定位突變法”把TNF-a的157個氨基酸上的每一段，甚至每一個氨基酸通過缺失和更換的手段來檢測它對TNF-a功能的影響66。TNF-a是由17KD的多肽，它的活性狀態(tài)是三聚體52KD的形式，三聚體間溝是由近N端和C端的極性基團及中部的疏水基團所組成的，而這些亞單位之間的溝是TNF-a與其受體結合的部位67

22、。總的來講，完整的C端對保持TNF的生物學活性是必需的，缺失任何一個氨基酸都會對TNF-a的抗腫瘤活性造成損害68。但是，C末端的的最后一個氨基酸Leu157改變成Phamet或者Glu,都能使其活性有較大的提高，有證據顯示這種改變使疏水性的TNF-a亞基之間的結構變得更緊湊，從而提高了TNF-a同受體結合的效率69。與此相反，N端的氨基酸的丟失對TNF-a活性的影響不大，而且丟失1-7個N端的氨基酸，增加了其堿性度，提高了TNF-a和受體的親和度，使TNF-a的活性增加70。不僅如此，N端的8、9、10和17個氨基酸變成堿性氨基酸，使某些對野生型TNF-a不敏感的月中瘤細胞變得敏感了，擴大了

23、TNF-a的療效范圍，而且還增強了其抗月中瘤的活性°。這些結果給研究和開發(fā)更高效、低毒的TNF變構體提供了空問。自90年代初，不斷有學者對野生型TNF進行結構改造的報道，他們利用減少N-端的氨基酸數、將一些氨基酸殘基進行置換等方法，陸續(xù)獲得了一些較野生型TNF與受體結合能力更強、抗月中瘤活性更高、且毒副作用更小的新型TNF變構體72（如突變體471、M3、F4616、TNF-B等），使得TNF的臨床應用價值重新引起重視。六、新型重組人TNF-民的藥理活性特點目前我們公司生產的新型人TNF-a突變體與天然人TNF-a比較，N末端缺失了7個氨基酸的編碼序列，天然人TNF基因中編碼為Pro

24、8Sei9Asp10的編碼序列由ArgLysArg的編碼取代，157位的Leu被Phe取代。實驗證明，這樣經過改造后的TNF-a變構體，較野生型的TNF-a與受體的親和力更強，因而明顯提高了其抗月中瘤的療效，擴大了應用范圍；同時新型TNF的毒副作用較野生型明顯減輕，提高了月中瘤患者全身用藥的耐受性。圖2.為TNF-a的示意圖，黃色部分為突變部分。圖2.1 .細胞水平上的抗腫瘤活性用L-M細胞作為試驗對象，比較471突變體和野生型TNF-a的抗月中瘤活性73。結果顯示，471突變體比野生型TNF-a能更有效的殺死L-M細胞，其有效活性分別為2.00X07U/mg和3.03106U/mg。2 .受

25、體結合活性表1.總結了471突變體和野生型TNF-a的受體結合活性74。每個L-M細胞表面471突變體和野生型TNF-a的受體數量都為5000個左右，沒有明顯的差異，這說明471突變體和野生型TNF-a結合于同一受體上。兩者的Kd值分別為4.08109M和1.65109M。因而，突變體與受體的結合活性比野生型TNF-a要表1.野生型和突變體471對L-M細胞的作用TNF受體數量Kd值（M）野生型TNF_35.04X103一_-91.65X10突變體4715.06X103-94.08X1093 .體內抗腫瘤活性將MethA-HM細胞移植BALB/c小鼠體內（5X105i.d.注入側腹壁）進行47

26、1突變體和野生型TNF-a的抗癌月中瘤活性檢驗75。當月中瘤長到直徑為68mm時（0天）i.v.給藥（用PBS溶解50仙g的471突變體或野生型TNF-a）。隨后，在2、6、8、10天繼續(xù)給同樣劑量的TNF-a,實驗中對照小鼠只給PBS。結果顯示，同樣劑量的471突變體比野生型TNF-a有更好月中瘤抑制效果。由471突變體引發(fā)的平均壞死反應是+,而野生型的是+。采用471突變體處理的小鼠與對照小鼠相比生存時間明顯延長，但用野生型TNF-a處理的小鼠生存時間則沒有明顯延長。471突變體處理組的5只小鼠中有2只在15天月中瘤完全消退76o4 .急性毒性采用B-D-半乳糖胺-激活的C3H/Hej鼠來

27、檢測471突變體和野生型TNF-a的急性致死毒性"。表2.顯示了兩類TNF-a不同劑量的作用結果。野生型TNF-a以濃度為16pg/k給藥后，小鼠出現100%致死率。但同樣劑量的471突變體只有20%致死率。471突變體和野生型TNF-a的LD50值分別為35仙g/kg和2仙g/kg由此可見，471突變體的致死毒性比野生型的要低很多表2.TNF的急性毒性試驗死亡率（死亡數/總數）TNFg/kg141664128356TNF0/55/55/55/55/55/5突變體4710/50/51/54/54/55/5總之，無論是采用體外殺傷細胞實驗還是采用動物體內生長抑制及壞死反應來比較471突

28、變體和野生型TNF-a的抗月中瘤活性，均顯示471突變體的抗月中瘤活性比野生型TNF-a要高。受體結合實驗結果也表明，471突變體較高的對月中瘤細胞的殺傷毒性可能由于它是有高的受體結合活性。整體動物研究中，還觀察到了一些小鼠月中瘤的完全消退。另一方面，471突變體比野生型TNF-a有較低的LD50,因此471突變體比野生型TNF-a更有效且毒性更低。七、TNF抗腫瘤作用的臨床研究概況自TNF發(fā)現以來，其抗月中瘤效果一直是得到公認的。自從1984年TNF的cDNA克隆成功，很多研究者就將其基因工程產品試用于臨床。但I期和R期臨床研究的結果頗為令人失望，全身用藥帶來的嚴重的毒性反應讓臨床研究一度陷

29、入停滯。八十年代末，著名的Eggerment78和Lejeune為首的兩個臨床研究小組分別對不能手術切除的HIV級軟組織肉瘤病人和轉移性黑色瘤病人，用TNF-a聯合抗月中瘤藥物美法倫或者丫-干擾素，進行隔離性肢體灌流法治療。治療效果達到了（CR+PR）90%和70%。如此滿意的效果在月中瘤生物治療史上是前罕見的82。于是，人們重新開始審視原先對TNF的認識。在1999年第35屆美國臨床月中瘤年會上專家們達成共識80:（1）TNF-a被重新確認，肯定它對月中瘤治療具有明顯的療效。（2）TNF-a是具有潛力的抗月中瘤藥物，今后對TNF-a的研究和治療應給予更多支持。同時，歐洲藥物審評委員會（EME

30、A）亦重新登記和接納了TNF-a作為抗月中瘤藥物81。另外，美國的FDA批準了美國國立月中瘤研究院（NCI）牽頭的TNF-a治療轉移性黑色素瘤的田期臨床研究方案83oTNF作為抗月中瘤藥的臨床研究進入了柳暗花明的新階段。1. 局部用藥的臨床研究大量的臨床研究結果表明，TNF單獨或配合其他抗腫瘤藥，用于腫瘤的局部給藥，可在腫瘤局部獲得較高的TNF濃度，達到較好的治療效果，而不出現全身大劑量用藥所引起的嚴重不良反應。（1）直接瘤內注射有報道對各種類型癌癥病人，將TNF直接注入腫瘤局部緩解率可達4084。國內解放軍第88醫(yī)院完成了B超引導下局部注射TNF治療肝癌30例臨床研究85，取得了良好的效果。

31、（2）腔內注射胸、腹腔內注射對于惡性胸腹水的治療有較好的療效86;膀胱內灌注，治療膀胱癌也可見明顯療效87；心包腔內注射治療惡性心包積液88，可獲得CR40.0%（8/20）,PR40.0%（8/20）的療效。（3）隔離肢體灌流LejuneF89和Eggermont90率先將TNF用于肢體灌流，治療肢體軟組織肉瘤和骨腫瘤，其療效高達到90和70，替代了截肢，提高了病人的生活質量91。另有報道，TNF與美法侖聯合應用隔離肢體灌注治療肢體黑色素瘤和軟組織肉瘤，有效率高達70-10092。在高溫隔離灌注化療的同時加用腫瘤壞死因子，可提高對肢體腫瘤局部控制作用93明顯改善患者的生活質量94。（4）隔離

32、肝臟灌注（isolatedhepaticperfusio，nIHP）有研究顯示，將肝臟血液循環(huán)與體循環(huán)系統(tǒng)隔離，利用心肺機進行體外循環(huán)，將TNF-a聯合美法倫或阿霉素肝臟灌注，可取得較好的治療效果95o目前以TNF-a為主聯合用藥隔離肝臟灌注法（IHP）已進入II期臨床研究。日本的NakamototT等應用此法治療肝癌有效率已超過75%;應用于轉移性肝臟月中瘤60例，有效率亦高達60%96。除了隔離灌流外，亦有應用介入療法經肝動脈插管，注入TNF治療肝臟腫瘤的研究報道97。除肝臟之外，隔離灌注法還可以用于肺98、腎99等器官，也取得了較為滿意的結果?？傊?，TNF的局部用藥，解決了全身用藥難以達

33、到有效濃度，或用藥量過大病人難以耐受的問題，使得腫瘤局部的TNF濃度和維持時間能達到有效抗腫瘤的效果，為腫瘤的治療提供了一條有效的途徑。2. TNF全身用藥的抗腫瘤效果由于TNF早期的臨床研究應用的是野生型的TNF,因毒副作用較大而難以給予較大的劑量，故臨床效果并不如體外實驗和動物實驗的結果那么令人鼓舞。隨著基因工程技術的應用，出現了多種高效低毒的突變體，這些突變體進行臨床試驗的結果也不斷有所報道。（ 1） TNF單用于腫瘤的治療日本學者1001998年前將其研制出的TNF突變體TNF-SAM2用于治療結直腸癌肺轉移，得出結論：TNF-SAM2毒副作用輕，抗腫瘤治療效果明顯優(yōu)于TNF-a101

34、。我國于20世紀90年代下半葉起，即有不少關于TNF治療腫瘤的報道。文獻顯示，單用TNF治療晚期肺癌，可獲得42.6的有效率（PR+CR），若與化療藥物合用，則有效率可達77.2（PR+CR）102。單用TNF治療晚期腫瘤患者的惡性胸腹水，也有明顯的療效103。由于惡性腫瘤的治療多采用綜合療法，除少數晚期患者，經各種治療方法無效時方采用TNF單獨治療，因此，全身性單用TNF治療腫瘤的報道不多，多數為與其他療法合用的報道。（ 2） TNF與其他抗腫瘤藥物合用大量國內外臨床研究資料表明，TNF-a與許多化療藥物或細胞因子聯合使用，抗腫瘤作用增強。在局部用藥治療肢體軟組織肉瘤、黑色素瘤、骨腫瘤和肝癌

35、時，多以TNF-a為主，聯合應用美法侖104及干擾素-丫105、阿霉素106等，可顯著提高療效。一般認為其作用機理為：TNF-a摧毀了月中瘤周圍的血管上皮組織，使瘤體暴露在藥物的攻擊之下，瘤體周圍藥物濃度可增加3-6倍107。因而，抗癌效果明顯增強。其他學者108的研究也證明TNF-a同TGF-B、1干擾素、美法倫、阿霉素和各種抗炎藥物的聯合使用，有協同抗月中瘤作用。Inagawa等研究發(fā)現，TNF與烷化劑如環(huán)磷酰胺合用時，療效可提高4-5倍，認為與改變了宿主的免疫狀態(tài)有關109。YamasaliK等對結直腸癌轉移患者使用內源性和外源性TNF聯合其它抗癌藥物，如5-氟尿嘧啶（5-Fu）、絲裂霉

36、素C（MMC），療效提高，患者耐受性增強110。波蘭學者ChcialowskiA等進行的I、II期臨床研究表明，TNF-a與其它細胞因子（如INF-丫、IL-2）及細胞增殖抑制藥物（如足葉乙花、環(huán)磷酰胺）有協同作用111。國內這方面的研究報道也較多。如以新型腫瘤壞死因子與順鉑聯合腹腔灌注治療惡性腹腔積液112，聯合組有效率93.94（31/33）明顯高于單藥（順鉑）組的66.67（20/30），且聯合用藥未增加順鉑的副作用，而TNF副作用輕微。TNF與IL-2聯合應用胸腔內注射治療惡性胸水的臨床研究也顯示了兩者的協同作用113。本公司與第四軍醫(yī)大學生物技術中心聯合研制的新型重組人腫瘤壞死因子（

37、rmhTNF）,經H、m期臨床試驗證實，rmhTNF聯合化療藥物在治療肺癌、消化道癌、頭頸部癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中，具有協同作用和化療增敏作用，能明顯提高臨床療效，改善患者的一般狀況和生活質量，提高患者的抗病能力，減少化療中感染的發(fā)生率和抗生素的使用率。rmhTNF單用對放化療失敗，而又無其他治療方法的晚期惡性腫瘤亦有一定的療效。rmhTNF的毒副作用少，患者均能耐受。H、m期臨床試驗結果表明，rmhTNF臨床應用安全、有效（資料待發(fā)表）。八、TNF的耐受性和藥代動力學研究1耐受性研究早期對野生型TNF的大量臨床研究顯示，人體對TNF的耐受性較差，其主要的毒副作用的表現與急性全身性感染的癥狀

38、很相似，其嚴重程度并非總是與用藥劑量相關，也未觀察到藥物積蓄作用114，且并不引起致死性器官功能障礙115。這主要是由于TNF本身的致炎作用的結果116。全身應用（包括兒童117）的毒副作用主要為118：（1）心血管系統(tǒng)：低血壓、心律失常；（2）血液系統(tǒng)：中性粒細胞、血小板、淋巴細胞、白細胞、血紅蛋白減少，停藥后恢復；（3）神經系統(tǒng)：頭痛、發(fā)熱、寒顫、疲倦、嗜睡、感覺異常、骨肌肉疼痛、定向障礙、癲癇樣發(fā)作、行為異常；（4）消化系統(tǒng)：肝損傷：膽紅素、轉氨酶、堿性磷酸酶升高，停藥后恢復；胃腸道：惡心、嘔吐、腹瀉、消化不良、胃出血；（5）泌尿系統(tǒng)：尿少、肌酐清除率下降；（6）呼吸系統(tǒng)：可出現致命的A

39、RDS癥狀、過敏樣支氣管痙攣；（7）皮膚系統(tǒng)：注射局部疼痛、紅腫、硬結、瘙癢、過敏反應、脫發(fā)；（8）代謝系統(tǒng)：體重下降、甘油三酯升高。經過結構改造后的TNF變構體的上述毒副作用較野生型明顯減輕，臨床研究顯示119,月中瘤患者可接受靜脈注射的TNF衍生物rmhTNFaDa4X106IU/dX5d的劑量，其主要的毒性反應為發(fā)熱、寒戰(zhàn)，其他的不良反應如頭痛、惡心、嘔吐、血壓改變等均輕，無需特殊處理。我公司的rmhTNF亦有較好的耐受性。由于是肌肉注射給藥，月中瘤患者可接受400萬u/m2/dX7的劑量，主要的不良反應為輕到中度的發(fā)熱、注射局部的疼痛、硬結，少數患者出現骨肌肉疼痛和感冒樣癥狀，這些不良

40、反應均較輕，一般無需特殊處理，不影響繼續(xù)治療。（研究資料待發(fā)表）。2.藥代動力學研究（1）動物的藥代動力學研究小鼠靜脈給藥后，TNF在體內的消除半衰期（ti/2）為0.51h120,肌肉注射的達峰時間（Tmax）為0.5h,在體內的分布情況以腎臟最高，血液其次，其后為肺、肝，腦組織濃度最低121。小鼠注射TNF后主要經腎臟排泄，24h尿放射性總回收率為87%122。恒河猴肌注rmhTNF后Tmax為1.7h,t1/2為1.42.4h,血液中的消除符合一室模型123。（2）人體的藥代動力學研究靜脈注射rhTNFaDa后，藥時曲線符合二室模型，T1/2B為1.53±0.34h,表觀分布容

41、積（Vd）為0.623L124。人體肌肉注射的藥代動力學研究仍在進行中。九、TNF可用于臨床的給藥途徑1. 全身用藥一般認為TNF殺傷月中瘤細胞需要724小時，而人體實驗表明TNF半衰期最常不超過2小時，因此要維持TNF的血漿濃度，必須持續(xù)靜滴才行125。但持續(xù)靜脈輸入TNF可導致較嚴重的不良反應，病人難以耐受，且在治療過程中機體尚可產生抗TNF的抗體，從而影響了TNF的抗癌作用。目前已用于臨床試驗的全身給藥途徑有靜脈、肌肉和皮下給藥等。我們公司的TNF注射劑的給藥途徑為肌肉注射。由于從肌肉吸收入血有一個過程，血中TNF達到的峰值水平較靜脈給藥平緩，故可以一次注射較大劑量而避免出現靜脈給藥時的

42、嚴重不良反應。2. 局部用藥局部用藥可以減少全身不良反應，腫瘤細胞可以較長時間暴露于高濃度的TNF中，以增強TNF的作用。局部給藥方法有實體瘤內注射，胸膜腔、腹膜腔內注射，導管內（灌注）給藥等，前面已有介紹。十、臨床上與TNF聯合用藥的治療方案每個月中瘤細胞表面有10002000個TNF結合位點，此位點的數目與月中瘤細胞的種類有關，也隨細胞周期發(fā)生變化，一般認為在增值周期的G2-M期，受體的數目達峰值126。TNF治療腫瘤的療效與腫瘤細胞對其的敏感性(腫瘤細胞表面TNF受體的數量)以及TNF向腫瘤局部TNF的濃度有關。因此，設法增加腫瘤表面TNF受體的數量，以提高腫瘤的敏感性，和提高腫瘤局部T

43、NF濃度的方法，均可提高TNF的抗腫瘤療效。腫瘤局部給藥，如局部注射、局部血管內灌流等給藥方法，可大大提高腫瘤局部的濃度，發(fā)揮較好的抗腫瘤效果，同時可減輕全身給藥時的副作用。TNF與其他抗腫瘤藥物合用，抑制蛋白質合成，破壞腫瘤周圍的蛋白膜形成，可以有利于外源性TNF的滲入到月中瘤局部127;與其他細胞因子如yIFN、IL-1等合用，可以提高腫瘤細胞表面的TNF受體的含量，增加敏感性128。1. 與抗癌藥物聯合用藥體外實驗證實，rhTNF與順鉑或更生霉素聯合應用有一定的協同抗癌作用，以rhTNF和更生霉素聯合應用效果更好129。TNF與絲裂霉素聯合應用產生協同的細胞毒作用130，其機制可能是TN

44、F通過受體進入細胞，使細胞停留在G2期，繼而在M期溶解；絲裂霉素也是作用于M期的藥物，故兩者可產生較好的協同作用TNF與抗癌藥物的協同作用可解釋為共同破壞腫瘤細胞蛋白質代謝和細胞分裂，從而抑制或殺傷腫瘤細胞131。此外，TNF本身可以逆轉腫瘤對化療藥物的耐藥性，提高化療藥物的療效132。2. 與其他細胞因子合用(1) TNF與丫-干擾素(IFN-丫)協同抗月中瘤作用通過不同白環(huán)節(jié)，IFN-丫可增加月中瘤細胞表面的TNF受體，協同抑制月中瘤細胞蛋白質的合成；TNF作用于G2期或M期，IFN-丫作用于S期，兩種因子聯合應用能協同增強抗腫瘤作用133。(2) TNF與白細胞介素-(IL-2)協同作用在TNF治療時，腫瘤周圍注射IL-2能明顯增加一些腫瘤對TNF的敏感性。有研究表明，使用TNF之前，IL-2只能增加毒性反應而無抗腫瘤作用，但在TNF使用48小時后，IL-2與其產生協同作用，能明顯地抑制腫瘤生長134。有研究者發(fā)現無論體內或體外，I