_水中總大腸菌群的測定―多管發(fā)酵法精選

1、水中總大腸菌群的測定多管發(fā)酵法一原理總大腸菌群可用多管發(fā)酵法或濾膜法檢驗。多管發(fā)酵法的原理是根據(jù)大腸菌群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，以及具備革蘭氏染色陰性，無芽孢，呈桿狀等有關(guān)特性，通過三個步驟進(jìn)行檢驗求得水樣中的總大腸菌群數(shù)。試驗結(jié)果以最可能數(shù)(mostprobablenumbe)r，簡稱MPN表示。三儀器(1)高壓蒸氣滅菌器。(2)恒溫培養(yǎng)箱、冰箱。(3)生物顯微鏡、載玻片。(4)酒精燈、3mm接種環(huán)。(5)培養(yǎng)皿(直徑100mm)、試管(5M50mm),吸管(1、5、10mL)、燒杯(200、500、2000mL)、錐形瓶(500、1000mL)、采樣瓶、移液槍。四培養(yǎng)基及染色劑的制備1乳糖

2、蛋白胨培養(yǎng)液：將10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸儲水中，調(diào)節(jié)溶液pH為7.27.4,再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混勻，分裝于試管中，于121高壓滅菌器中滅菌15min,貯存于冷暗處備用。2三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：按上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的制備方法配制。除蒸餾水外，各組份用量增加至三倍。3伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基： 貯備培養(yǎng)基的制備：于2000mL燒杯中，先將20g瓊脂加到900mL蒸儲水中，加熱溶解。再加2.0g鄰酸二氫鉀及10g蛋白月東，混合使之溶解，用蒸儲水補(bǔ)充至1000mL，調(diào)節(jié)溶液pH值為7.27.4。趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加入10g乳糖，

3、混勻后定量分裝于250mL或500mL錐形瓶內(nèi)，于121高壓滅菌15min，貯于冷暗處備用。 平皿培養(yǎng)基的制備：將上述制備的貯備培養(yǎng)基融化。根據(jù)錐形瓶內(nèi)培養(yǎng)基的容量，用滅菌吸管按比例分別吸取一定量已滅菌的2%伊紅水溶液（0.4g伊紅溶于20mL水中）和一定量已滅菌的0.5%美藍(lán)水溶液（0.065g美藍(lán)溶于13mL水中），加入已融化的貯備培養(yǎng)基內(nèi)，并充分混勻（防止產(chǎn)生氣泡），立即將此培養(yǎng)基適量傾入已滅菌的空平皿內(nèi)，待冷卻凝固后，置于冰箱內(nèi)備用。4革蘭氏染色劑：結(jié)晶紫染色液：將20mL結(jié)晶紫乙醇飽和溶液（稱取48g結(jié)晶紫溶于100mL95%乙醇中）和80mL1%草酸鏤溶液混合、過濾。該溶液放置過久

4、會產(chǎn)生沉淀，不能再用。 助染劑：將1g碘與2g碘化鉀混合后，加入少許蒸餾水，充分振蕩，待完全溶解后，用蒸儲水補(bǔ)充至300mL。此溶液兩周內(nèi)有效。當(dāng)溶液由棕黃色變?yōu)榈S色時應(yīng)棄去。為易于貯備，可將上述碘與碘化鉀溶于30mL蒸餾水中，臨用前再加水稀釋。 脫色劑：95%乙醇。復(fù)染劑：將0.25g沙黃加到10mL95%乙醇中，待完全溶解后，加90mL蒸餾水。五測定步驟水源水 于各裝有5mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個試管中（內(nèi)有倒管），分別加入10mL水樣；于各裝有10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個試管中（內(nèi)有倒管），分別加入1mL水樣；再于各裝有10mL乳糖蛋白月東培養(yǎng)液的5個試管中（內(nèi)有倒管）分別加

5、入1mL1：10稀釋的水樣。共計15管，三個稀釋度。將各管充分混勻，置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。 平板分離：上述各發(fā)酵管經(jīng)培養(yǎng)24h后，將產(chǎn)酸、產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸的發(fā)酵管分別接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基培養(yǎng)基上，置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h,挑選符合下列特征的菌落：a伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上：深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紫紅色，中心色較深的菌落。 取上述特征的群落進(jìn)行革蘭氏染色：a.用以培養(yǎng)1824h的培養(yǎng)物涂片，涂層要??；b.將涂片在火焰上加溫固定，待冷卻后滴加結(jié)晶紫溶液，1min后用水洗去；c.滴加助色劑，1min后用水洗去；d.滴加脫色劑，搖動玻片，直止無紫色脫落為止（約2

6、030s）,用水洗去；e.滴加復(fù)染劑，1min后用水洗去，晾干、鏡檢，呈紫色者為革蘭氏陽性菌，呈紅色者為陰性菌。 復(fù)發(fā)酵試驗：上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌，則挑選該菌落的另一部分接種于裝有普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒管），每管可接種分離自同一初發(fā)酵管（瓶）的最典型菌落13個，然后置于37c恒溫箱中培養(yǎng)24h,有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣者（不論倒管內(nèi)氣體多少皆作為產(chǎn)氣論），即證實有大腸菌群存在。根據(jù)證實有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數(shù)查附表1“大腸菌群檢數(shù)表”，報告每升水樣中的大腸菌群數(shù)。結(jié)果與分析：初發(fā)酵實驗10ml原水+5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：5管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象1ml原水

7、+10ml普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：2管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象，1管有產(chǎn)酸現(xiàn)象1ml1：10稀釋水樣+10ml普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：1管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象復(fù)發(fā)酵實驗：10ml原水+5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：5管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象1ml原水+10ml普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：2管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象1ml1：10稀釋水樣+10ml普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：1管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象結(jié)論：從最可能數(shù)（MPN）表中查檢驗結(jié)果521,得知100mL水樣中的總大腸菌群數(shù)為70個，故1L水樣中的總大腸菌群數(shù)為70M0=700個。對污染嚴(yán)重的地表水和廢水，初發(fā)酵試驗的接種水樣應(yīng)做1：10、1：100、1：1000或更高倍數(shù)的稀

8、釋，檢驗步驟同水源水”檢驗方法。如果接種的水樣量不是10mL、1mL和0.1mL,而是較低或較高的三個濃度的水樣量，也可查表求得MPN指數(shù)，再經(jīng)下面公式換算成每100mL的MPN值：MPN值MPN指數(shù)10(mL)接種量最大的一管(mL)附表1大腸菌群檢數(shù)表接種水樣總量300mL(100mL2份，10mL10份)100mL水量的陽性瓶數(shù)10mL水量的陽性管數(shù)0121L水樣中大腸新數(shù)1L水樣中大腸菌群數(shù)1L水樣中大腸新數(shù)0<3411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069>230附表2最可

9、能數(shù)（MPN）表（接種5份10mL水樣、5份1mL水樣、5份0.1mL水樣時，不同陽性及陰性情況下100mL水樣中細(xì)菌數(shù)的最可能數(shù)和95%可信限值）出現(xiàn)陽性份數(shù)每100m95%可信限值出現(xiàn)陽性份數(shù)每100m95%可信限值10m10.1L水下上10m10.1L水下上L管mm樣中限限L管mm樣中限限LL細(xì)菌LL細(xì)菌管管數(shù)的最可能數(shù)管管數(shù)的最可能數(shù)000<220171170012<0.7210711701025721192210204<0.112209221100257230123281014<0.1130081191104515301112251116<0.15310112251206515311144342005<0.133201443432117546520491713033017<0.46521702317040013531522942822040117<0.465307925190410175465311103125041121<0.6353214037310412265785331804450042022<0.67540130353004212657854117043190430275805422205770043133593543280908504403