液相色譜法在環(huán)境樣品檢測中的應(yīng)用

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上液相色譜法在環(huán)境樣品檢測中的應(yīng)用1、 液相色譜法的原理與分類液相色譜法的分離機(jī)理是基于混合物中各組分對(duì)兩相親和力的差別。根據(jù)固定相的不同，液相色譜分為液固色譜、液液色譜和鍵合相色譜。應(yīng)用最廣的是以硅膠為填料的液固色譜和以微硅膠為基質(zhì)的鍵合相色譜。根據(jù)固定相的形式，液相色譜法可以分為柱色譜法、紙色譜法及薄層色譜法。按吸附力可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠滲透色譜。近年來，在液相柱色譜系統(tǒng)中加上高壓液流系統(tǒng)，使流動(dòng)相在高壓下快速流動(dòng)，以提高分離效果，因此出現(xiàn)了高效（又稱高壓）液相色譜法。   液固吸附色譜。高效液相色譜中的一種，是

2、基于物質(zhì)吸附作用的不同而實(shí)現(xiàn)分離。其固定相是一些具有吸附活性的物質(zhì)如硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。   液液分配色譜法?；诒粶y物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的相對(duì)溶解度的差異，通過溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行分配以實(shí)現(xiàn)分離。根據(jù)固定相與流動(dòng)相的極性不同，分為正相色譜和反相色譜。前者是用硅膠或極性鍵合相為固定相，非極性溶劑為流動(dòng)相；后者是硅膠為基質(zhì)的烷基鍵合相為固定相，極性溶劑為流動(dòng)相，適用于非極性化合物的分離。   離子交換色譜法?；陔x子交換樹脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離子對(duì)離子交換基具有不同的親和力

3、而實(shí)現(xiàn)分離。薄殼型離子交換樹脂柱效高，主要用來分離簡單的混合物；多孔性樹脂進(jìn)樣容量大，主要用來分離復(fù)雜混合物。   凝膠滲透色譜法。又稱為尺寸排阻色譜法  。1959年首先用于生物化學(xué)領(lǐng)域。以溶劑為流動(dòng)相，多孔填料（如多孔硅膠、多孔玻璃）或多孔交聯(lián)高分子凝膠為分離介質(zhì)的液相色譜法。當(dāng)混合物溶液入凝膠色譜柱后，流經(jīng)多孔凝膠時(shí)，體積比多孔凝膠孔隙大的分子不能滲透到凝膠孔隙里去而從凝膠顆粒間隙中流過，較早地被沖洗出柱外，而小分子可滲透到凝膠孔隙里面去，較晚地被沖洗出來，混合物經(jīng)過凝膠色譜柱后就按其分子大小順序先后由柱中流出達(dá)到分離的目的。用凝膠滲透色

4、譜的優(yōu)點(diǎn)是：分離不需要梯度沖洗裝置；同樣大小的柱能接受比通常液相色譜大得多的試樣量；試樣在柱中稀釋少，因而容易檢測；組分的保留時(shí)間可提供分子尺寸信息；色譜柱壽命長。它的缺點(diǎn)是：不能分離分子尺寸相同的混合物，色譜柱的分離度低；峰容量??；可能有其他保留機(jī)理起作用時(shí)引起干擾。凝膠滲透色譜法為測定高聚物分子量和分子量分布提供了一個(gè)有效的方法，此外還可用來分離齊聚物、單體和聚合物添加劑等。   離子色譜法。采用柱色譜技術(shù)的一種高效液相色譜法，樣品展開方式采用洗脫法。根據(jù)不同的分離方式，離子色譜可以分為高效離子色譜、離子排斥色譜和流動(dòng)相離子色譜3類。高效離子色譜法使用低容量的

5、離子交換樹脂，分離機(jī)理主要是離子交換。離子排斥色譜法用高容量的樹脂，分離機(jī)理主要是利用離子排斥原理。流動(dòng)相離子色譜用不含離子交換基團(tuán)的多孔樹脂，分離機(jī)理主要是基于吸附和離子對(duì)的形成。   離子色譜儀由淋洗液貯存器、泵、進(jìn)樣閥、分離柱、抑制柱、電導(dǎo)檢導(dǎo)器和數(shù)據(jù)處理單元等組成。離子色譜儀最重要的部件是分離柱，裝有離子交換樹脂。抑制柱是抑制型離子色譜儀的關(guān)鍵部件，其作用是將淋洗液轉(zhuǎn)變成低電導(dǎo)部分，以降低來自淋洗液的背景電導(dǎo)，同時(shí)將樣品離子轉(zhuǎn)變成其相應(yīng)的酸或堿，以增加其電導(dǎo)。分離陰離子，抑制柱填充強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂；分離陽離子，抑制柱填充強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂。檢測器分通

6、用型檢測器與專用型檢測器。前者如電導(dǎo)檢測器，對(duì)檢測池中所有離子都有響應(yīng)；后者如紫外-可見分光光度計(jì)，對(duì)離子具有選擇性響應(yīng)。   離子色譜法具有快速、靈敏、選擇性好和同時(shí)測定多組分的優(yōu)點(diǎn)。尤其對(duì)于陰離子的測定，離子色譜的出現(xiàn)是分析化學(xué)中的一項(xiàng)突破性的新進(jìn)展。離子色譜法主要用于測定各種離子含量，廣泛應(yīng)用于水、紙漿和漂白液、食品分析、生物體液、鋼鐵和環(huán)境分析等各個(gè)領(lǐng)域。高效液相色譜·高效液相色譜（high performance liquid chromatography, HPLC）是指流動(dòng)相為液體的技術(shù)。早期的液相色譜（經(jīng)典液相色譜）是將小體積的試液注入色

7、譜柱上部，然后用洗脫液（流動(dòng)相）洗脫。這種經(jīng)典色譜法，流動(dòng)相依靠自身的重力穿過色譜柱，柱效差(固定相顆粒不能太小)，分離時(shí)間很長。實(shí)驗(yàn)室最常用的P230高效液相色譜儀色譜分析法是分析化學(xué)中獲得廣泛應(yīng)用的一個(gè)重要分支，是一個(gè)具有強(qiáng)大生命力的分離分析技術(shù)。與經(jīng)典液相色譜法與氣相色譜法比較,高效液相色譜法具有以下優(yōu)點(diǎn)：1高2 選擇性高3 檢測靈敏度高4 分析速度快高效液相色譜 - 簡介 高效液相色譜（high performance liquid chromatography, HPLC）是指流動(dòng)相為液體的技術(shù)。早期的液相色譜（經(jīng)典液相色譜）是將小體積的試液注入色譜柱上部，然后用洗脫液（流動(dòng)相）洗脫

8、。這種經(jīng)典色譜法，流動(dòng)相依靠自身的重力穿過色譜柱，差(固定相顆粒不能太小)，分離時(shí)間很長。70年代初期發(fā)展起來的高效液相色譜法，克服了經(jīng)典液相色譜法柱效低，分離時(shí)間很長的缺點(diǎn)。成為一種高效、快速的分離技術(shù)。高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動(dòng)相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達(dá)4.9´107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測。高壓泵將貯液罐的流動(dòng)相經(jīng)進(jìn)樣器送入色譜柱中，然后從檢測器的出口流出，這時(shí)整個(gè)系統(tǒng)就被流動(dòng)相充滿。當(dāng)欲分離

9、樣品從進(jìn)樣器進(jìn)入時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器的流動(dòng)相將其帶入色譜柱中進(jìn)行分離，分離后不同組分依先后順序進(jìn)入檢測器，記錄儀將進(jìn)入檢測器的信號(hào)記錄下來，得到液相色譜圖。 HPLC流程示意高效液相色譜 - 發(fā)展歷史 1960年代，由于氣相色譜對(duì)高有機(jī)物分析的局限性，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺(tái)高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時(shí)代。高效液相色譜使用粒徑更細(xì)的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數(shù)，以高壓驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)

10、月完成的分離工作得以在幾個(gè)小時(shí)甚至幾十分鐘內(nèi)完成。 工科學(xué)生最常使用的液相色譜的參考書籍1971年等人出版了一書，標(biāo)志著高效液相色譜法 (HPLC)正式建立。在此后的時(shí)間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段，在、醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)與檢測、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜同時(shí)還極大的刺激了固定相材料、檢測技術(shù)、數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及色譜理論的發(fā)展。 1960年代前，使用的大于100m，提高柱效面臨著困境，后來的研究人員便采用微粒固定相來突破著一瓶頸。、制備成功薄殼型，這種在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄殼，實(shí)現(xiàn)了高速傳質(zhì)，為高效液相色譜技術(shù)的發(fā)展奠定了穩(wěn)固的基

11、礎(chǔ)。隨著填料粒徑的降低，更高的柱效也得以實(shí)現(xiàn)。1960年代研制出氣動(dòng)放大泵、注射泵及低流量往復(fù)式柱塞泵，但后者的脈沖信號(hào)很大，難以滿足高效液相色譜的要求。1970年代，往復(fù)式雙柱塞恒流泵，解決了這一問題。1970年代后科克蘭制備出全多孔球形硅膠，平均粒徑只有7m，具有極好的柱效，并逐漸取代了無定形微粒硅膠。之后又制造出的鍵合固定相使柱的穩(wěn)定性大為提高，多次使用成為可能。1970年后，適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點(diǎn)。1980年后，改善分離的選擇性成為工作者的主要問題，人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到改變流動(dòng)相的組成事提高選擇性的關(guān)鍵。 高效液相色譜 - 特點(diǎn) 1高壓：液相色譜法以液體為（稱為載液），液

12、體流經(jīng)色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對(duì)載液施加高壓。一般可達(dá)150350×105Pa。2. 高速：流動(dòng)相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典快得多，一般可達(dá)110ml/min。高效液相色譜法所需的分析時(shí)間較之經(jīng)典液相色譜法少得多，一般少于 1h 。3. 高效：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。4.高靈敏度：高效液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測器，進(jìn)一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達(dá)10-11g。另外，用樣量小，一般幾個(gè)微升。5.適應(yīng)范圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但是受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn)太高

13、的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要?dú)饣?，因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對(duì)于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子量大（大于 400 以上）的有機(jī)物（這些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總數(shù)的 75% 80% ）原則上都可應(yīng)用高效液相色譜法來進(jìn)行分離、分析。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占7080%。高效液相色譜 - 主要類型 1、（Adsorption Chromatography）2、（Partition Chromatography） 3、（Ion Chromatography） 4、（Size Excl

14、usion Chromatography） 5、（Affinity Chromatography）特點(diǎn)比較吸附色譜分配色譜離子色譜體積排阻色譜親和色譜固定相全多孔固體吸附劑固定液載帶在固相基體上 高效微粒離子交換劑 具有不同孔徑的多孔性凝膠多種不同性能的配位體鍵聯(lián)在固相基體上流動(dòng)相不同極性有機(jī)溶劑不同極性有機(jī)溶劑和水不同pH值的緩沖溶液有機(jī)溶劑或一定pH值的緩沖溶液不同pH值的緩沖溶液，可加入改性劑分離原理吸附與解吸溶解與揮發(fā) 可逆性的離子交換多孔凝膠的滲透或過濾具有鎖匙結(jié)構(gòu)絡(luò)合物的可逆性離解高效液相色譜 - 分離原理 根據(jù)分離機(jī)制的不同，高效液相色譜法可分為下述幾種主要類型：1 液 液分配色

15、譜法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學(xué)鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography)流動(dòng)相和固定相都是液體。流動(dòng)相與固定相之間應(yīng)互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個(gè)明顯的分界面。當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。達(dá)到平衡時(shí)，服從于下式：高效液相色譜計(jì)算公式式中，cs溶質(zhì)在固定相中濃度；cm-溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度； Vs固定相的體積；Vm流動(dòng)相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動(dòng)相對(duì)K影響不大，LLPC流動(dòng)相對(duì)K影響

16、較大。a. 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動(dòng)相的極性小于固定液的極性。b. 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動(dòng)相的極性大于固定液的極性。c. 的缺點(diǎn)：盡管流動(dòng)相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動(dòng)相中仍有微量溶解；流動(dòng)相通過色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，會(huì)造成固定液流失。上世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相（見后），可克服上述缺點(diǎn)?，F(xiàn)在應(yīng)用很廣泛（7080%）。2 液 固色譜法流動(dòng)相為液體，固定相為吸附劑（如、等）。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來進(jìn)行分離的。其作用機(jī)制是：當(dāng)試樣進(jìn)

17、入色譜柱時(shí)，溶質(zhì)分子 (X) 和溶劑分子(S)對(duì)吸附劑表面活性中心發(fā)生競爭吸附（未進(jìn)樣時(shí)，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：Xm nSa = Xa nSm式中：Xm-流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子；Sa-固定相中的溶劑分子；Xa-固定相中的溶質(zhì)分子；Sm-流動(dòng)相中的溶劑分子。當(dāng)吸附競爭反應(yīng)達(dá)時(shí)：K=XaSm/XmSa式中：K為吸附平衡常數(shù)。討論：K越大，保留值越大。3 離子交換色譜法(Ion-exchange Chromatography)IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離子以交換劑具有不同的親和力而將

18、它們分離。以交換劑為例，其交換過程可表示如下：X-(溶劑中) (-R4N Cl-)= (樹脂-R4N X-) Cl- (溶劑中)當(dāng)交換達(dá)平衡時(shí)：KX=-R4N X- Cl-/-R4N Cl- X-為：DX=-R4N X-/X-= KX -R4N Cl-/Cl-討論：DX與保留值的關(guān)系凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來進(jìn)行分離。4 (Ion Pair Chromatography)離子對(duì)色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質(zhì)分子電荷相反的離子 ( 稱為對(duì)離子或反離子 ) 加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對(duì)化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。其原理可用下式

19、表示：X Y-水相 = X Y-式中：X 水相-流動(dòng)相中待分離的有機(jī)離子（也可是陽離子）；Y-水相-流動(dòng)相中帶相反電荷的離子對(duì)（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X Y-形成的離子對(duì)化合物。當(dāng)達(dá)平衡時(shí)：KXY = X Y-有機(jī)相/ X 水相Y-水相 離子交換色譜柱根據(jù)定義，分配系數(shù)為：DX= X Y-有機(jī)相/ X 水相= KXY Y-水相討論：DX與保留值的關(guān)系離子對(duì)色譜法(特別是反相)發(fā)解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。 5 色譜法(Ion Chromatography)用離子交換樹

20、脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相。以電導(dǎo)檢測器為通用檢測器，為消除流動(dòng)相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對(duì)電導(dǎo)檢測器的干擾，設(shè)置了抑制柱。試樣組分在離子色譜儀流程示意分離柱和抑制柱上的反應(yīng)原理與離子交換色譜法相同。 以交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當(dāng)待測陰離子Br-隨流動(dòng)相（NaOH）進(jìn)入色譜柱時(shí)，發(fā)生如下交換反應(yīng)（洗脫反應(yīng)為交換反應(yīng)的逆過程）：抑制柱上發(fā)生的反應(yīng)：R-H Na OH- = R-Na H2OR-H Na Br- = R-Na H Br- 可見，通過抑制柱將洗脫液轉(zhuǎn)變成了電導(dǎo)值很小的水，消除了本底電導(dǎo)的影響；試樣陰離子Br-則被轉(zhuǎn)化成了相應(yīng)的酸H Br-，可用電導(dǎo)法靈

21、敏的檢測。離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用于陽離子分析。 6 空間色譜法(Steric Exclusion Chromatography)空間排阻色譜法以 (gel) 為固定相。它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進(jìn)行分離，而是按分子大小進(jìn)行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動(dòng)力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進(jìn)入色譜柱后，隨流動(dòng)相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現(xiàn)，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這

22、些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現(xiàn)。 高效液相色譜 - 固定相 一、液液色譜法及離子對(duì)色譜法固定相與GLC類似，LLC的固定相也是在擔(dān)體上涂漬一層固定液構(gòu)成，或使用化學(xué)鍵合相。1擔(dān)體所用的擔(dān)體可分為如下幾類：(1) 全多孔型擔(dān)體：a. HPLC早期使用的擔(dān)體與GC類似，是顆粒均勻的多孔球體，如有氧化鋁、氧化硅、硅藻土等制成的»100 m全多孔型擔(dān)體。其缺點(diǎn)是：填料的不規(guī)則性和較寬的粒度范圍會(huì)導(dǎo)致填充不易均勻，柱效低；填料孔徑分布不一，并存在“裂隙”在中形成滯留液體（液坑），溶質(zhì)分子在深孔中擴(kuò)散和傳質(zhì)慢，使色譜峰變寬，柱效下降。擔(dān)體圖示b. HPLC在20世紀(jì)70年代初開始使

23、用10 m全多孔型擔(dān)體，它是由nm級(jí)的硅膠微粒堆積而成為5 m或稍大的全多孔小球。其優(yōu)點(diǎn)是：顆粒小而均勻，傳質(zhì)快（距離短），柱效高。 (2) 表層多孔型（薄殼型微珠擔(dān)體）：它是直徑為 30 40 m 的實(shí)心核 ( 玻璃微珠 ) ，表層上附有一層厚度約為 1 2m 多孔表面 ( 多孔硅膠 ) 。 其優(yōu)點(diǎn)是：孔穴淺（固定相僅為表面的一薄層），傳質(zhì)速度快，易于填充均勻，柱效高。其缺點(diǎn)是：柱子容量低、需要配用高靈敏檢測器。這種擔(dān)體目前應(yīng)用較為普遍。2固定液液液色譜流動(dòng)相和固定相都是液體，因此要求兩相要互不相溶。在液-液色譜中常用的固定也只有極性不同的幾種，如，'-氧二丙腈、聚已二醇-400和角

24、鯊?fù)榈取?化學(xué)鍵合固定相：將固定液機(jī)械的涂在擔(dān)體表面上構(gòu)成的這種固定相，在實(shí)際使用時(shí)存在不少缺點(diǎn)，20世紀(jì)60年末發(fā)展起來了一種新型的固定相-化學(xué)鍵合固定相。即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵把有機(jī)分子結(jié)合到擔(dān)體表面。根據(jù)在硅膠表面 (具有SiOH基團(tuán)) 的化學(xué)反應(yīng)不同，鍵合固定相可分為： ( SiOC ) ； (SiOSiC ) （SiC）和硅氮鍵型（SiN）四種類型?；瘜W(xué)鍵合固定相反應(yīng) 化學(xué)鍵合固定相具有如下一些特點(diǎn)： . 表面沒有液坑，比一般液體固定相傳質(zhì)快得多； . 無固定液流失，增加了色譜柱的穩(wěn)定性和壽命； . 可以鍵合不同官能團(tuán)，能靈活地改變選擇性，應(yīng)用于多種色譜類型及樣品的分

25、析； . 有利于，也有利于配用靈敏的檢測器和餾分的收集?；瘜W(xué)鍵合固定相應(yīng)用二、液固吸附色譜法固定相采用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等，仍可分為全多孔性和薄殼型兩種，其特點(diǎn)如前所述。 硅膠三、離子交換色譜法固定相 1.薄膜型離子交換樹脂:即以薄殼玻璃珠為擔(dān)體，在它的表面涂約 1% 的離子交換樹脂而成。2. 離子交換鍵合固定相:用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合在惰性擔(dān)體（如微粒硅膠）表面。樹脂類別：（1） 陽離子交換樹脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）；（2） 陰離子交換樹脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）。四、排阻色譜法固定相1. 軟質(zhì)凝膠：如、凝膠等，適用于水為流動(dòng)相，在常壓下使用。2. 半硬質(zhì)凝膠：如苯

26、乙烯二乙烯基苯交聯(lián)共聚凝膠（），是應(yīng)用最多的有機(jī)凝膠，適用于非極性有機(jī)溶劑。3. 硬質(zhì)凝膠：如多孔硅膠、等，多孔硅膠是用得較多的無機(jī)凝膠?；瘜W(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。近年來發(fā)展起來的可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。用它固定相，色譜柱易填充均勻；柱壓、流動(dòng)相流速、pH值或離子強(qiáng)度對(duì)分離的影響小，適用于較高流速下操作。 高效液相色譜 - 流動(dòng)相 在氣相色譜中，載氣是的（與組分分子之間的作用力可忽略不計(jì)），常用的只有三四種，他們的性質(zhì)差異也不大，所以要提高柱子的選擇性，只要選擇合適的固定相即可。但在液相色譜中，當(dāng)固定相選定后，流動(dòng)相

27、的種類、配比能顯著的影響分離效果，因此，流動(dòng)相的選擇也非常重要。選擇流動(dòng)相（又稱為：淋洗液，洗脫劑）時(shí)應(yīng)注意下列幾個(gè)因素。(1) 純度：防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。(2) 避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如在液-液色譜中，流動(dòng)相應(yīng)與固定液互不相溶，否則，會(huì)使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。(3) 對(duì)試樣要有適宜的溶解度：試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。(4) 溶劑的粘度小些為好：否則，會(huì)降低試樣組分的擴(kuò)散系數(shù)，造成傳質(zhì)速率緩慢，柱效下降。(5) 應(yīng)與檢測器相匹配：例如，當(dāng)使用紫外檢測器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。在選擇

28、溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。例如，采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。常用溶劑的極性順序：水(最大) > > > 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮>  二氧六環(huán)> 四氫呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 異丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)。除此之外，在選擇溶劑時(shí)，

29、溶劑的極性是最重要的依據(jù)，有時(shí)還需要采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相，以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。選擇時(shí)要參閱有關(guān)手冊(cè)，并通過實(shí)驗(yàn)確定。高效液相色譜 - 高效液相色譜儀 HPLC的出現(xiàn)不過三十多年的時(shí)間，但這種分離分析技術(shù)的發(fā)展十分迅猛，目前應(yīng)用也十分廣泛。其儀器結(jié)構(gòu)和流程也多種多樣。典型的高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)和流程可用下列方框圖表示（See Fig.3-4）。高效液相色譜儀一般都具備貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置（用雙泵）、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、恒溫器、記錄儀等主要部件。一起主要組成 1 、高壓泵HPLC使用的色譜柱是很細(xì)的（16 mm），所用固定相

30、的粒度也非常?。◣譵到幾十m），所以流動(dòng)相在柱中流動(dòng)受到的阻力很大，在常壓下，流動(dòng)相流速十分緩慢，柱效低且費(fèi)時(shí)。為了達(dá)到快速、高效分離，必須給流動(dòng)相施加很大的壓力，以加快其在柱中的流動(dòng)速度。為此，須用高壓泵進(jìn)行高壓輸液。高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。HPLC使用的高壓泵應(yīng)滿足下列條件：a. 流量恒定，無脈動(dòng)，并有較大的調(diào)節(jié)范圍（一般為110 mL/min）；b. 能抗溶劑腐蝕； 往復(fù)式柱塞泵c. 有較高的輸液壓力；對(duì)一般分離，60×105Pa的壓力就滿足了，對(duì)高效分離，要求達(dá)到150300×105Pa。(1). 當(dāng)柱塞推入缸體時(shí)，泵頭出口（上部）的單向閥打開，同時(shí)，流

31、動(dòng)相進(jìn)入的單向閥（下部）關(guān)閉，這時(shí)就輸出少量的流體。反之，當(dāng)柱塞向外拉時(shí)，流動(dòng)相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時(shí)關(guān)閉，一定量的流動(dòng)相就由其儲(chǔ)液器吸入缸體中。這種泵的特點(diǎn)是不受整個(gè)色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影響，連續(xù)供給恒定體積的流動(dòng)相。（2）氣動(dòng)放大泵其工作原理是：壓力為 p1 的低壓氣體推動(dòng)大面積（ SA ） A ，則在小面積（ SB ）活塞 B 輸出壓力增大至 p2 的液體。壓力增大的倍數(shù)取決于 A 和 B 兩活塞的面積比，如果 A 與 B 的面積之比為 50 : 1 ，則壓力為 5 × Pa 的氣體就可得到壓力為 250×Pa 的輸出液體。這是一種恒壓泵。2

32、、洗提類似于GC中的程序升溫。已成為現(xiàn)代高效液相色譜中部缺少的部分。梯度洗提，就是中含有兩種（或更多）不同極性的溶劑，在分離過程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性，通過載液中極性的變化來改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。梯度洗提可以分為兩種：a. 梯度（也叫外梯度）：在常壓下，預(yù)先按一定程序?qū)煞N或多種不同極性的溶劑混合后，再用一臺(tái)高壓泵輸入色譜柱。b.梯度 ( 或稱內(nèi)梯度系統(tǒng) ) ：利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按設(shè)定的比例送入梯度混合室，混合后，進(jìn)入色譜柱。3 、進(jìn)樣裝置(1).注射器進(jìn)樣裝置：進(jìn)樣所用微量注射器及進(jìn)樣方式與 GC法一樣。進(jìn)樣壓力150×

33、;105Pa時(shí)，必須采用停流進(jìn)樣。(2).高壓定量進(jìn)樣閥：與GC法用的流通法相似，能在高壓下進(jìn)樣。4 、色譜柱色譜柱是色譜儀最重要的部件（心臟）。通常用后壁玻璃管或內(nèi)壁拋光的不銹鋼管制作的，對(duì)于一些有腐蝕性的樣品且要求耐高壓時(shí)，可用銅管、鋁管或聚四氟乙烯管。柱子內(nèi)徑一般為16 mm。常用的標(biāo)準(zhǔn)柱型是內(nèi)徑為 4.6 或 3.9mm ，長度為 15 30cm 的直形不銹鋼柱。填料顆粒度 5 10m ，柱效以理論塔板數(shù)計(jì)大約 7000 10000 。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。5 、檢測器(1).它的作用原理是基于被分析試樣組分對(duì)特定波長紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關(guān)系遵守比爾

34、定律。最常用的檢測器，應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：a.靈敏度高：其最小檢測量10-9g·mL-1，故即使對(duì)紫外光吸收很弱的物質(zhì)，也可以檢測；b. 線性范圍寬；(比爾定律)c. 流通池可做的很?。?mm × 10mm ，容積 8L）；d. 對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感,可用于梯度洗脫；e. 波長可選，易于操作:如，使用裝有流通池的可見紫外分光光度計(jì)（可變波長檢測器）。缺點(diǎn)：對(duì)紫外光完全不吸收的試樣不能檢測；同時(shí)溶劑的選擇受到限制。(2). 紫外檢測器的重要進(jìn)展；陣列由1024個(gè)光電二極管陣列，每個(gè)光電二極管寬僅50m，各檢測一窄段波長。如圖所示，在檢測器中，光

35、源發(fā)出的紫外或可見光通過液相色譜流通池，在此流動(dòng)相中的各個(gè)組分進(jìn)行特征吸收，然后通過狹縫，進(jìn)入單色其進(jìn)行分光，最后由光電二極管陣列檢測，得到各個(gè)組分的吸收信號(hào)。經(jīng)計(jì)算機(jī)快速處理，得三維立體譜圖。(3).熒光檢測器是一種高靈敏度、高選擇性檢測器。對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。熒光檢測器的結(jié)構(gòu)及工作原理和熒光光度計(jì)相似。(4).除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器。差示折光檢測器是借連續(xù)測定流通池中溶液折射率的方法來測定試樣濃度的檢測器。溶液的折射率是純?nèi)軇鲃?dòng)相）和純?nèi)苜|(zhì)（試樣）折射率乘以各物質(zhì)的濃度之和。因此溶有試樣的流動(dòng)相和純流動(dòng)相之間折

36、射率之差表示試樣在流動(dòng)相中的濃度。(5).電導(dǎo)其作用原理是根據(jù)物質(zhì)在某些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生電導(dǎo)變化來測定電離物質(zhì)含量。高效液相色譜 - 設(shè)備選型 要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的 了解樣品的有關(guān)性質(zhì)，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點(diǎn)及其應(yīng)用范圍。選擇色譜分離方法的主要根據(jù)是樣品的相對(duì)分子質(zhì)量的大小，在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程度以及化學(xué)結(jié)構(gòu)等物理、化學(xué)性質(zhì)。選型常用參照表1、相對(duì)分子質(zhì)量 對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進(jìn)行分析。相對(duì)分子質(zhì)量在200 2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對(duì)分子質(zhì)量高于2000，則可用空間排阻色譜法。2、溶解度水溶性樣品最好用離子交換色譜法和液液分配色譜法；微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用；油溶性樣品或相對(duì)非極性的混合物