注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量研究資料及文獻(xiàn)資料

1、藥品名稱注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞資料工程名稱.質(zhì)量研究的試驗(yàn)資料及文獻(xiàn)資料縮略詞對(duì)照表錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽.1細(xì)胞形態(tài)62細(xì)胞計(jì)數(shù)62.1 供試品,儀器設(shè)備62.2 測(cè)試方法62.3 測(cè)定結(jié)果62.4 活率73.1 供試品,儀器設(shè)備73.2 測(cè)試方法73.3 檢測(cè)結(jié)果84細(xì)胞外表抗原分析84.1 供試品,儀器設(shè)備及試劑84.2 測(cè)定方法94.3 測(cè)定結(jié)果95無(wú)菌需氧菌、厭氧菌和真菌105.1 供試品,儀器設(shè)備105.2 測(cè)定方法105.3 測(cè)定結(jié)果106支原體檢測(cè)116.1 供試品及儀器設(shè)備116.2 測(cè)定方法116.3 測(cè)定結(jié)果117細(xì)菌內(nèi)毒素127.1 供試品及儀器設(shè)備127.2 測(cè)定方法12

2、7.3 測(cè)定結(jié)果128染色體檢查128.1 測(cè)定方法138.2 儀器設(shè)備和試劑138.3 實(shí)驗(yàn)操作138.4 細(xì)胞連續(xù)傳代后的染色體檢查138.4.1 實(shí)驗(yàn)方案138.4.2 測(cè)定結(jié)果148.5 種子細(xì)胞和成品細(xì)胞的染色體檢查148.6 結(jié)果分析159成骨成脂誘導(dǎo)分化潛能159.1 細(xì)胞連續(xù)傳代后的成骨成脂誘導(dǎo)分化潛能159.1.1 實(shí)驗(yàn)方案159.1.2 染色法159.1.3 PCR方法169.1.4 傳代細(xì)胞誘導(dǎo)分化潛能實(shí)驗(yàn)結(jié)果179.2 種子細(xì)胞和成品細(xì)胞的成骨成脂誘導(dǎo)分化潛能189.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：1910端粒酶活性分析1910.1 實(shí)驗(yàn)方案2010.2 儀器設(shè)備和試劑2010.3 實(shí)驗(yàn)

3、方法2010.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2110.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)論2211原癌基因與抑癌基因檢測(cè)2211.1 實(shí)驗(yàn)方案2211.2 儀器設(shè)備和試劑2311.3 實(shí)驗(yàn)方法:2311.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:2511.5 結(jié)論2512二甲基亞根(DMSO)殘留檢測(cè)2512.1 檢測(cè)方法2612.2 檢測(cè)結(jié)果2613擬定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(草案)2713.1 種子細(xì)胞P2質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案2713.2 成品細(xì)胞P4的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案2813.3 成品發(fā)放細(xì)胞P4質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案29附圖錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽.注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量研究工作試驗(yàn)資料及文獻(xiàn)資料本品系由存在于新生兒臍帶中的間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)過(guò)別離、接種、培養(yǎng)、傳代、凍存、復(fù)蘇等步驟制得的細(xì)

4、胞懸液,含適宜保存液.本項(xiàng)研究擬選取三批注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞P2代種子細(xì)胞和六批注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞P4代成品細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量研究和分析,所采用的樣品按本套申報(bào)資料9號(hào),10號(hào)制備.供試品制備：供試品名稱：注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞本研究各實(shí)驗(yàn)工程所用供試品來(lái)源,代次和批次信息如下表11-1：表11-1質(zhì)量研究用樣品來(lái)源,代次及批次信息細(xì)胞代次細(xì)胞來(lái)源規(guī)格批次P2代種子細(xì)胞2xl07個(gè)/,管12802000431202100J2802000011202100J2802000171202100P4代成品細(xì)胞5xlO7個(gè)/管12802000011403000,12802000011404000,

5、1280200001140500012802000011409000,12802000011410000J2802000011413000另取三根臍帶編號(hào)：UMSC5029,UMSC5024,UMSC5039,參考本申報(bào)資料9,資料10的生產(chǎn)工藝,進(jìn)行別離,接種,傳代,擴(kuò)增,細(xì)胞傳至P10代,其中在P2代,P4代分別凍存,檢測(cè)P0,P2,P2,凍存后復(fù)蘇,P4,P4,凍存后復(fù)蘇,P6,P10各代次細(xì)胞染色體核型,成骨成脂誘導(dǎo)分化潛能,端粒酶活性分析,原癌基因、抑癌基因分析,考察傳代10代內(nèi)和兩次凍存對(duì)上述細(xì)胞生物學(xué)活性的影響.1細(xì)胞形態(tài)儀器設(shè)備：奧林巴斯1X71倒置顯微鏡顯微鏡下觀察三批P2代

6、注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞種子細(xì)胞(批號(hào)12802000431202100,12802000011202100,12802000171202100),六批P4代注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成品細(xì)胞(批號(hào)12802000011403000,12802000011404000,12802000011405000,12802000011409000,12802000011410000,12802000011413000),細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí),呈梭形,為成纖維樣細(xì)胞.2細(xì)胞計(jì)數(shù)2.1供試品,儀器設(shè)備供試品：注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞P2代種子細(xì)胞,P4代成品細(xì)胞P2代種子細(xì)胞批號(hào)：1280200043120210

7、0,12802000011202100,12802000171202100P4代成品細(xì)胞批號(hào)：12802000011403000,12802000011404000,12802000011405000,12802000011409000,12802000011410000,12802000011413000儀器設(shè)備：CASY-TT快速細(xì)胞分析儀檢測(cè)2.2 測(cè)試方法快速細(xì)胞分析儀檢測(cè)法.取分裝完成的整管細(xì)胞,充分混勻后迅速吸取定量細(xì)胞重懸液,并以氯化鈉注射液或PBS稀釋10-20倍,制成終濃度為1.0x105個(gè)/ml3.0xl()6個(gè)卷的單細(xì)胞懸液,取一個(gè)CASY-CUP樣品杯,裝入10mlCA

8、SY-TON緩沖液.將定量的樣品參加緩沖液,蓋緊蓋子,倒轉(zhuǎn)CASY杯子3次混勻樣品,防止氣泡和泡沫的形成.將待測(cè)樣品放在毛細(xì)管的下面,使鉗金電極浸沒(méi)在樣品中,旋轉(zhuǎn)樣品臺(tái),豁口朝向一邊.CASY快速細(xì)胞計(jì)數(shù)儀開(kāi)機(jī)檢測(cè),5min內(nèi)完成樣品的計(jì)數(shù)檢測(cè).顯示器上讀取檢測(cè)數(shù)據(jù).細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果應(yīng)為“標(biāo)示量的90%120%.2.3 測(cè)定結(jié)果細(xì)胞計(jì)數(shù)檢查結(jié)果如下表11-2.檢測(cè)圖譜見(jiàn)附圖02-0102-09.表11-2各批次細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞代次細(xì)胞批次檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果(個(gè)/管)P2代種子細(xì)胞樣品12802000431202100快速細(xì)胞分析儀檢測(cè)法.2.3x107個(gè)/管128020000112021002.

9、0x107個(gè)/管128020001712021002.4x107個(gè)/管P4代成品細(xì)胞樣品128020000114030005.5x107個(gè)/管128020000114040005.6x107個(gè)/管128020000114050005.3x.個(gè)/管128020000114090005.8X107個(gè)/管128020000114100005.4x107個(gè)/管128020000114130005.8X107個(gè)/管3細(xì)胞活率3.1供試品,儀器設(shè)備供試品：注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞P2代種子細(xì)胞,P4代成品細(xì)胞P2代種子細(xì)胞批號(hào)：12802000431202100,12802000011202100,128

10、02000171202100P4代成品細(xì)胞批號(hào)：12802000011403000,12802000011404000,12802000011405000,12802000011409000,12802000011410000,12802000011413000儀器設(shè)備：CASY-TT快速細(xì)胞分析儀檢測(cè)3.2測(cè)試方法快速細(xì)胞分析儀檢測(cè)法.取細(xì)胞懸液,以氯化鈉注射液或PBS稀釋102.倍,制成終濃度為1.0x105個(gè)/ml3.0xl()6個(gè)/川的單細(xì)胞懸液,取一個(gè)CASY-CUP樣品杯,裝入10mlCASY-TON緩沖液.將定量的樣品參加緩沖液,蓋緊蓋子,倒轉(zhuǎn)CASY杯子3次混勻樣品,防止氣泡和

11、泡沫的形成.將待測(cè)樣品放在毛細(xì)管的下面,使鉗金電極浸沒(méi)在樣品中,旋轉(zhuǎn)樣品臺(tái),豁口朝向一邊.CASY快速細(xì)胞計(jì)數(shù)儀開(kāi)機(jī)檢測(cè),5min內(nèi)完成樣品的計(jì)數(shù)檢測(cè).顯示器上讀取檢測(cè)數(shù)據(jù).細(xì)胞活率“應(yīng)不低于85%.33檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞活率檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)下表11-3.檢測(cè)圖譜見(jiàn)附圖03-0103-09.表11-3各批次細(xì)胞活率檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞代次細(xì)胞批次檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果P2代種子細(xì)胞樣品12802000431202100快速細(xì)胞分析儀檢測(cè)法.93.6%1280200001120210092.8%1280200017120210094.1%P4代成品細(xì)胞樣品1280200001140300093.2%12802000011

12、40400093.2%1280200001140500092.9%1280200001140900093.2%1280200001141000093.5%1280200001141300092.4%4細(xì)胞外表抗原分析通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞外表抗原特征進(jìn)行檢測(cè),考察注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征.4.1供試品,儀器設(shè)備及試劑供試品：注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞P2代種子細(xì)胞,P4代成品細(xì)胞P2代種子細(xì)胞批號(hào)：12802000431202100,12802000011202100,12802000171202100P4代成品細(xì)胞批號(hào)：12802000011403000,128020

13、00011404000,12802000011405000,12802000011409000,12802000011410000,12802000011413000儀器設(shè)備：流式細(xì)胞儀(FACSCaliburorFACSArial)實(shí)驗(yàn)試劑：CD73-PE單克隆抗體、CD90-FITC單克隆抗體、CD105-APC單克隆抗體、CD29-PE單克隆抗體、CD45-FITC單克隆抗體、CD34-PE單克隆抗體、CD14-FITC單克隆抗儂CD79a-APC單克隆抗體或CD19-APC單克隆抗體、HLA-DR-PerCP單克隆抗體、以及相應(yīng)的同型對(duì)照抗體BD公司4.2 測(cè)定方法流式細(xì)胞術(shù).將樣品移

14、入相應(yīng)流式管內(nèi),參加ImlPBS充分混勻,500g離心5分鐘,棄上清,重復(fù)洗滌2次；參加適量PBS混懸細(xì)胞,過(guò)濾,計(jì)數(shù),將細(xì)胞濃度調(diào)整為2.06.0x106個(gè)/ml待用；取出假設(shè)干支流式管,參加各組抗體及同型對(duì)照試劑避光操作；然后將準(zhǔn)備好的細(xì)胞樣品參加已參加抗體試劑的流式管內(nèi),每管100W,充分混勻,置4c冰箱避光孵育30分鐘；孵育完成后每管參加ImlPBS,充分混勻,500g離心5分鐘,棄上清液,重復(fù)此洗滌過(guò)程1次,調(diào)整細(xì)胞懸液體積至200Ml左右,準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè).4.3 測(cè)定結(jié)果結(jié)果見(jiàn)表11-4.檢測(cè)圖譜見(jiàn)附圖04-0104-30.表11-4細(xì)胞表而抗原檢測(cè)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞代次細(xì)胞批號(hào)流式檢

15、測(cè)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果CD90CD29CD73CD105CD45CD34CD19/CD79aCD14HLA-DRP2代種子細(xì)胞樣品1280200043120210099.7%99.9%99.6%98.4%13%0.5%1.1%1.0%0.2%合定符規(guī)1280200001120210099.9%99.8%95.8%99.7%1.0%1.5%0.9%0.5%0.6%合定符規(guī)1280200017120210099.9%97.2%99.9%99.7%1.2%1.0%1.0%0.9%0.7%合定符規(guī)P4代成品細(xì)胞樣品1280200001140300099.8%97.1%97.1%99.6%1.5%0.8%1.1

16、%1.0%0.7%合定符規(guī)1280200001140400099.9%98.4%98.4%99.7%1.8%1.1%1.7%1.2%0.5%合定符規(guī)1280200001140500099.4%97.6%964%95.7%13%0.9%0.9%1.0%03%合定符規(guī)1280200001140900095.5%99.5%95.5%96.5%0.7%1.2%0.2%0.8%0.8%合定符規(guī)1280200001141000098.6%98.3%95.0%98.4%1.2%0.2%2.0%1.1%1.0%合定符規(guī)1280200001141300099.8%99.8%97.9%99.8%0.9%1.1%1

17、.7%1.3%1.1%合定符規(guī)5無(wú)菌需氧菌、厭氧菌和真菌5.1 供試品,儀器設(shè)備供試品：注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞P2代種子細(xì)胞,P4代成品細(xì)胞P2代種子細(xì)胞批號(hào)：12802000431202100,12802000011202100,12802000171202100P4代成品細(xì)胞批號(hào)：12802000011403000,12802000011404000,12802000011405000,12802000011409000,12802000011410000,12802000011413000儀器設(shè)備：仃級(jí)超凈工作臺(tái),BacT/ALERT3D120全自動(dòng)細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測(cè)檢測(cè)系統(tǒng)5.2

18、測(cè)定方法全自動(dòng)細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測(cè)檢測(cè)系統(tǒng).萬(wàn)級(jí)潔凈室、局部白級(jí)潔凈工作臺(tái)中操作.每批次取1管細(xì)胞,生理鹽水稀釋至812ml,一次性無(wú)菌注射器取樣接種先接種厭氧瓶BPN,后接種需氧瓶BPA,接種厭氧瓶時(shí)防止吸入空氣,接種過(guò)程嚴(yán)格根據(jù)無(wú)菌操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行消毒及操作,每個(gè)BPA及BPN瓶接種量均為4-6ml；接種后上機(jī)培養(yǎng)及檢測(cè),培養(yǎng)溫度351,培養(yǎng)周期14天,檢測(cè)時(shí)限內(nèi)每天至少觀察3次.檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為“陰性.5.3 測(cè)定結(jié)果結(jié)果見(jiàn)表11-5.表11-5各批次細(xì)胞無(wú)菌檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞代次細(xì)胞批次檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果P2代細(xì)胞種子細(xì)胞樣品12802000431202100全自動(dòng)細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測(cè)檢測(cè)系統(tǒng)陰性12

19、802000011202100陰性12802000171202100陰性P4代成品細(xì)胞樣品12802000011403000陰性12802000011404000陰性12802000011405000陰性12802000011409000陰性12802000011410000陰性12802000011413000陰性6支原體檢測(cè)根據(jù)?中國(guó)藥典?2021版第三部附錄XIIB,選取直接培養(yǎng)法及DNA染色法依法檢測(cè).6.1 供試品及儀器設(shè)備供試品：注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞P2代種子細(xì)胞,P4代成品細(xì)胞P2代種子細(xì)胞批號(hào)：12802000431202100,12802000011202100,1280

20、2000171202100P4代成品細(xì)胞批號(hào)：12802000011403000,12802000011404000,12802000011405000,12802000011409000,12802000011410000,12802000011413000儀器設(shè)備：電熱恒溫培養(yǎng)箱、熒光倒置顯微鏡、CCh培養(yǎng)箱6.2 測(cè)定方法?中國(guó)藥典?2021版第三部附錄刈B依法檢測(cè).6.3 測(cè)定結(jié)果結(jié)果如下表11-6：表11-6各批次細(xì)胞支原體檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞代次細(xì)胞批次檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果P2代種子細(xì)胞樣品12802000431202100?中國(guó)藥典?2021版第三部附錄刈B符合規(guī)定1280200001120

21、2100符合規(guī)定12802000171202100符合規(guī)定P4代成品細(xì)胞樣品12802000011403000符合規(guī)定12802000011404000符合規(guī)定12802000011405000符合規(guī)定12802000011409000符合規(guī)定12802000011410000符合規(guī)定12802000011413000符合規(guī)定7細(xì)菌內(nèi)毒素根據(jù)中國(guó)藥典2021版第三部附錄刈E?細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法?之凝膠法依法檢測(cè).7.1供試品及儀器設(shè)備供試品：注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞P4代成品細(xì)胞P4代成品細(xì)胞批號(hào)：12802000011403000,12802000011404000,1280200001140

22、5000,12802000011409000,12802000011410000,128020000114130007.2 測(cè)定方法依中國(guó)藥典2021版第三部附錄XIIE檢測(cè),應(yīng)“V0.5EU/ml.7.3 測(cè)定結(jié)果結(jié)果如下表11-7：表11-7細(xì)菌內(nèi)毒素檢定結(jié)果細(xì)胞代次細(xì)胞批號(hào)檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果P4代成品細(xì)胞12802000011403000中國(guó)藥典2021版第三部附錄刈E0.5EU/ml128020000114040000.5EU/ml128020000114050000.5EU/ml128020000114090000.5EU/ml128020000114100000.5EU/ml1280

23、2000011413000k-ras.c-fos在不同代次的變化,對(duì)P0、P2、P2P4、P4P6、P10各代次細(xì)胞原癌基因、抑癌基因進(jìn)行檢測(cè),考察不同代次的培養(yǎng)細(xì)胞原癌基因、抑癌基因的表達(dá).同時(shí)對(duì)三批P2代種子細(xì)胞樣品,2個(gè)規(guī)格六批成品細(xì)胞樣品P4,復(fù)蘇后以及對(duì)應(yīng)的一批種子細(xì)胞P2,復(fù)蘇后的原癌基因、抑癌基因進(jìn)行檢測(cè),考察中試生產(chǎn)規(guī)模下P2代,P4代細(xì)胞的原癌基因和抑癌基因的表達(dá).11.2 儀器設(shè)備和試劑儀器設(shè)備：SIGMA,3K15冷凍離心機(jī)分光光度計(jì)NANOPHOTOMETER普通PCR儀,熒光定量PCR儀主要試劑：RNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄試劑盒美國(guó)伯樂(lè)公司BIO-RAD,ALS1296美國(guó)伯

24、樂(lè)公司BIO-RAD,CFX-96凱杰公司QIAGEN74204TOYOBOFSK-100SybergreenMix寶生物工程TAKARA11.3 實(shí)驗(yàn)方法分別根據(jù)RNA試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)提取RNA,以提取RNA所用的無(wú)RNase水作為空白對(duì)照,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)抽提RNA的濃度與純度.cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,SybergreenMix試劑盒將目的基因定量PCR檢測(cè),檢查間充質(zhì)干細(xì)胞抑癌基因P53、P21、RB及原癌基因c-Myc、k-ras、c-fos的表達(dá).詳細(xì)操作參考11.3.111.3.411.3.1 RNA提取參照試劑盒說(shuō)明書(shū)細(xì)胞收獲與裂解：細(xì)胞經(jīng)由胰

25、酶消化之后,300g,5min離心,去除上清；按細(xì)胞數(shù)目參加適量的BufferRLT裂解.細(xì)胞數(shù)目一般為lXlO,漩渦震蕩混勻.參加與BufferRLT等體積的70%乙醇至細(xì)胞裂解液中,輕輕吹打混勻.將包含有沉淀所有的700用的樣品轉(zhuǎn)移至離心柱中,輕合管蓋.12,OOOrpm離心15s.去除收集管內(nèi)的流出液,收集管繼續(xù)使用.4參加700同BufferRW1至離心柱中,輕合管蓋.12,OOOrpm離心15s,更換新的收集管.參加500N1BufferRPE至離心柱中,輕合管蓋.12,OOOrpm離心15s.去除收集管內(nèi)的流出液,收集管繼續(xù)使用.6加500N1BufferRPE至離心柱中,輕合管蓋

26、.12,OOOrpm離心3min.廢液和收集管丟棄,更換1.5ml滅菌的EP管為收集管.7直接參加30-50N1無(wú)RNase水.輕合管蓋,12,OOOrpm離心1min.收集1. 5mlEP管中的RNA,可-20或-80保存?zhèn)溆?11.3.2 RNA質(zhì)量檢測(cè)方法以提取RNA所用的無(wú)RNase水作為空白對(duì)照,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)抽提RNA的濃度與純度.11.3.3 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNAT0Y0B0公司的FirstStrandcDNASynthesisKito.轉(zhuǎn)錄反響體系：RNaseFreeH：0(ll-X)Pl5XRTBuffer4同dNTPMixture(lOmM)2P1RNaseInhi

27、bitor(10U/P1)1P1RandomPrimer(25pmol/Ml)1H1RNA(1Ng)XP1ReverTraAce1P1總體積：20間轉(zhuǎn)錄過(guò)程：30ClOmin42C20min99C5min4C5min瞬間離心Real-timePCR：B-actin為內(nèi)參,P0的細(xì)胞為對(duì)照.反響體系：2xsybyGreeen：5M1cDNA：0.4P1PrimerForward：0.1P1PrimerReverse：0.1P1H：0：4.4M1每個(gè)孔lOul的反響體系,每個(gè)基由于3個(gè)平行樣.使用BioRadReal-TimePCR儀擴(kuò)增.RT-PCR反響步驟：95C30s60cC30s72CIm

28、in39循環(huán)11.3.4 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用BIORADCFX.Manager導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),并使用2-Ct方法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),檢測(cè)相關(guān)原癌基因與抑癌基因的表達(dá)是否發(fā)生明顯變化.11.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1各代次細(xì)胞癌基因、抑癌基因檢測(cè)結(jié)果：三根臍帶樣本UMSC5029、UMSC5024、UMSC5039連續(xù)傳代,P0、P2、P2P4、P4P6、P10各代次細(xì)胞原癌基因、抑癌基因檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明：連續(xù)傳代培養(yǎng)及凍存復(fù)蘇過(guò)程不會(huì)對(duì)原癌基因、抑癌基因表達(dá)產(chǎn)生顯著影響.檢測(cè)結(jié)果如附圖11-01.2三批P2代種子細(xì)胞樣品原癌基因、抑癌基因檢測(cè)結(jié)果：三批種子細(xì)胞樣品12802000431202100,128020000112

29、02100,12802000171202100凍存前后原癌基因、抑癌基因檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明：P2代種子細(xì)胞凍存復(fù)蘇過(guò)程不會(huì)對(duì)原癌基因、抑癌基因表達(dá)產(chǎn)生顯著影響.檢測(cè)結(jié)果如附圖11-02：3成品質(zhì)量研究癌基因、抑癌基因檢測(cè)結(jié)果：對(duì)2個(gè)規(guī)格六批次的成品細(xì)胞P4,復(fù)蘇后及對(duì)應(yīng)的一批種子細(xì)胞P2,復(fù)蘇后進(jìn)行了原癌基因、抑癌基因檢測(cè),結(jié)果說(shuō)明：以P2代種子細(xì)胞作為對(duì)照表達(dá)組,傳代培養(yǎng)的P4代成品細(xì)胞原癌基因、抑癌基因表達(dá)不發(fā)生明顯改變.檢測(cè)結(jié)果如附圖11-03：11.5 結(jié)論通過(guò)對(duì)三根臍帶樣本傳代培養(yǎng)擴(kuò)增,P0、P2、P2P4、P4P6、P10各代次細(xì)胞原癌基因、抑癌基因檢測(cè),結(jié)果說(shuō)明：傳代至P10細(xì)胞,原癌

30、基因、抑癌基因表達(dá)沒(méi)有顯著性改變,傳代10代內(nèi)和凍存對(duì)干細(xì)胞原癌基因、抑癌基因表達(dá)沒(méi)有顯著影響.三批種子細(xì)胞樣品和2個(gè)規(guī)格六批成品細(xì)胞的原癌基因、抑癌基因檢測(cè),實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果說(shuō)明：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞采用現(xiàn)有生產(chǎn)工藝培養(yǎng)得到的P2代種子細(xì)胞,P4代成品細(xì)胞,中試規(guī)模生產(chǎn)下,各代次細(xì)胞的原癌基因與抑癌基因表達(dá)不發(fā)生明顯改變.12二甲基亞碉DMSO殘留檢測(cè)P4代成品細(xì)胞凍存前均參加含DMSO成份的凍存液,復(fù)蘇后根據(jù)細(xì)胞復(fù)蘇發(fā)放程序操作,洗滌去除DMSO溶液,參加保存液后成品注入人體,為考察成品細(xì)胞臨床使用前DMSO殘留量,特取本規(guī)格P4代成品細(xì)胞六批,根據(jù)干細(xì)胞復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,洗去凍存液參加保存液,送

31、檢DMSO殘留.12.1 檢測(cè)方法根據(jù)?中國(guó)藥典?2021版第三部附錄VIV第三法.12.2 檢測(cè)結(jié)果六批P4代成品細(xì)胞復(fù)蘇后DMSO殘留含量檢測(cè)結(jié)果如下表11-16.檢驗(yàn)報(bào)告見(jiàn)附圖12-01-12-06o表11-16注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞P4代成品細(xì)胞DMSO殘留含量檢測(cè)結(jié)果樣品規(guī)格批次檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果P4代成品細(xì)胞5x10?個(gè)/份12802000011403000?中國(guó)藥典?2021版第三部附錄VIV第三法0.01%128020000114040000.01%128020000114050000.01%128020000114090000.01%128020000114100000.01%128020000114130000.01%檢驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：6批成品細(xì)胞復(fù)蘇后經(jīng)過(guò)兩次洗滌,DMSO殘留量