試驗(yàn)植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

1、植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定-考馬斯亮藍(lán)G-250染色法一、原理考馬斯亮藍(lán)G-250（Coomassiebrilliantblue,G-250）法是利用蛋白質(zhì)-染料結(jié)合的原理，定量地測(cè)定微量蛋白質(zhì)濃度的快速、靈敏的方法?？捡R斯亮藍(lán)G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。它和蛋白質(zhì)通過范德瓦爾鍵結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色形式轉(zhuǎn)變成藍(lán)色形式，最大光吸收由465nm變成595nm,通過測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個(gè)很快的過程，約2min即可反應(yīng)完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定1h,

2、之后，蛋白質(zhì)磔料復(fù)合物發(fā)生聚合并沉淀出來。此法靈敏度高，易于操作，干擾物質(zhì)少，是一種比較好的定量法。其缺點(diǎn)是在蛋白質(zhì)含量很高時(shí)線性偏低，且不同來源蛋白質(zhì)與色素結(jié)合狀況有一定差異。二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備（一）實(shí)驗(yàn)材料植物材料。（二）試劑1 .標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（100科曠mL牛血清白蛋白）：稱取牛血清蛋白25mg,加水溶解并定容至100mL,吸取上述溶液40mL,用蒸儲(chǔ)水稀釋至100mL即可。2 .考馬斯亮藍(lán)試劑：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL90%乙醇中，加入100mL85%（W/V）的磷酸，再用蒸儲(chǔ)水定容到1000mL,貯于棕色瓶中。常溫下可保存一個(gè)月。（三）儀器設(shè)備分光

3、光度計(jì)，離心機(jī)，研缽，燒杯，量瓶，移液管，試管等。三、實(shí)驗(yàn)步驟1 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6支試管，按下表加入試劑，搖勻，向各管中加入5mL考馬斯亮藍(lán)試劑，搖勻，并放置5min左右，以0號(hào)試管為空白對(duì)照，在595nm下比色測(cè)定吸光度。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 .樣品測(cè)定（1）樣品提取稱取鮮樣0.250.5g，用5mL蒸儲(chǔ)水或緩沖液研磨成勻漿后，3000r/min離心10min,上清液備用。（2）吸取樣品提取液1.0mL（視蛋白質(zhì)含量適當(dāng)稀釋），放入試管中（每個(gè)樣品重復(fù)3次），加入5mL考馬斯亮藍(lán)試劑，搖勻，放置2min后在595nm下比色，測(cè)定吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的各試劑加入量試劑r管號(hào)012345標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(mL)00.200.400.600.801.00蒸儲(chǔ)水量（mL）1.000.800.600.400.200考馬斯亮藍(lán)G-250（mL）5.005.005.005.005.005.00蛋白質(zhì)含量（gg）020406080100四、結(jié)果計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量=7£xfx1000