REACH法規(guī)第四卷譯稿

1、B.6.皮膚敏感度測定1 .測定方法1.1. 引言注釋：在與大眾健康相關(guān)的毒性分類系統(tǒng)中，找尋潛在的人類皮膚感光劑的實(shí)驗(yàn)的靈敏度和能力是很重要的。沒有一種方法能對所有的對人類皮膚有潛在致敏性的物質(zhì)或者所有相關(guān)的物質(zhì)都合適。選擇實(shí)驗(yàn)方法時(shí)，要考慮各種因素，例如測定物的物理特性，包括其對皮膚的刺激性。兩種使用天竺鼠的實(shí)驗(yàn)正在發(fā)展：一種是佐劑類型，在完全佐劑(FCA)下，強(qiáng)行消除或延緩測定物對過敏癥狀的作用；另一種是非佐劑類型。佐劑類型實(shí)驗(yàn)比其它不使用完全佐劑的實(shí)驗(yàn)更能準(zhǔn)確預(yù)計(jì)人類皮膚對物質(zhì)作用作出的敏感反應(yīng)。天竺鼠極限化測試(GPMT)是輔助類型的實(shí)驗(yàn)。盡管還有其它一些實(shí)驗(yàn)方法可以測定物質(zhì)引起皮膚

2、敏感反應(yīng)的能力，GPMT仍是最可取的輔助類型的方法。關(guān)于物質(zhì)化學(xué)特性的分類有多種，非佐劑類型（Buehler實(shí)驗(yàn)較佳）被認(rèn)為靈敏度較差。在某些情況下，更適宜采取進(jìn)行局部注射的Buchler實(shí)驗(yàn)，而不是使用天竺鼠極限化皮膚注射的實(shí)驗(yàn)。當(dāng)使用Buchler實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，應(yīng)給出科學(xué)理由。這個(gè)實(shí)驗(yàn)同時(shí)描述了GPMT方法和Buchler方法。只要可行和有科學(xué)的根據(jù)，也可使用其它方法。如果在一個(gè)公認(rèn)的實(shí)驗(yàn)中觀察到陽性現(xiàn)象，應(yīng)指出測定物是潛在的感光劑，同時(shí)不必做進(jìn)一步的天竺鼠實(shí)驗(yàn)。然而，如果在實(shí)驗(yàn)中觀察到負(fù)反應(yīng)現(xiàn)象，則要使用本實(shí)驗(yàn)所描述的方法進(jìn)行天竺鼠實(shí)驗(yàn)。見描述部分B.1.2. 定義皮膚過敏：（過敏性皮膚炎

3、）是皮膚對物質(zhì)的免疫反應(yīng)。對于人類來說，這種反應(yīng)可分為瘙癢，紅斑，水腫，丘疹，小囊或這些癥狀的綜合。在其它物種中，反應(yīng)現(xiàn)象可能不同，可能只有紅斑和水腫。接觸感應(yīng)：讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸一段時(shí)間，使其對測定物產(chǎn)生過敏性反應(yīng)。感應(yīng)時(shí)間：接觸感應(yīng)后至少維持一星期，讓過敏性癥狀形成。接觸質(zhì)疑：讓先前涂了誘導(dǎo)處理過的測定物的動(dòng)物接觸一段時(shí)間，以確定此動(dòng)物是否產(chǎn)生過敏性反應(yīng)。1.3. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)每六個(gè)月，用已知的對皮膚有輕度到中度過敏刺激的物質(zhì)測定實(shí)驗(yàn)技術(shù)的靈敏度和可信度。在準(zhǔn)確進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，輔助類型的實(shí)驗(yàn)應(yīng)有30%,非輔助類型的實(shí)驗(yàn)應(yīng)有15%的輕度到中度過敏反應(yīng)現(xiàn)象。建議使用以下物質(zhì)。CAS實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)EINECS實(shí)

4、驗(yàn)數(shù)據(jù)EINECS名稱普通名稱101-86-0202-983-3%-己基肉桂醛%-己基肉桂醛149-30-4205-736-82-琉基苯并曝唾（快熱粉）kaptax94-09-7202-303-5苯噪卡因norcaine在有合適理由的情況下，可以使用其它符合以上標(biāo)準(zhǔn)的物質(zhì)1.4. 測定方法原理測定物通過皮內(nèi)注射和/或表皮注射注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。注射一定刺激量測定物后休息10到14天(誘導(dǎo)期)，在這期間免疫反應(yīng)漸形成。將經(jīng)過接觸刺激的動(dòng)物與注射了刺激性測定物而在誘導(dǎo)階段未經(jīng)處理的對比動(dòng)物樣品的皮膚反應(yīng)的范圍和程度進(jìn)行對比。1.5. 測定方法描述如果測定物需要被清洗，應(yīng)使用水或合適的溶劑，避免改變已有的

5、反應(yīng)和損害表皮的完整性。1.5.1. 天竺鼠極限化測試(GPMT)1.5.1.1. 預(yù)備健康的年輕成年白公天竺鼠應(yīng)至少在實(shí)驗(yàn)前5天開始適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件。實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物隨機(jī)分成幾組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)使用方法，將動(dòng)物樣品的毛剪去，剃去或可能的話用化學(xué)方法除去。小心避免損傷皮膚。實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后將動(dòng)物稱重。1.5.1.2. 實(shí)驗(yàn)條件1.5.1.2.1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通常使用實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的白公天竺鼠?？捎眯坌院?或雌性動(dòng)物。如果使用雌性動(dòng)物，其應(yīng)是未生育和非懷孕的。實(shí)驗(yàn)組至少有10只動(dòng)物，對比組至少包括5只動(dòng)物。當(dāng)使用少于20只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和10只對比動(dòng)物和不能確定測定物是否一種感光劑時(shí)，建議附加使用至少20只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和

6、10只對比動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。1.5.1.2.3. 試劑濃度用于每個(gè)接觸感應(yīng)階段的測定物的濃度應(yīng)是能被組織忍受和引起輕度到中度皮膚發(fā)炎的最大量。用于接觸刺激階段的濃度應(yīng)是不引起發(fā)炎反應(yīng)的最大量。如果得不到其它信息，應(yīng)用2到3只動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性測定以確定最佳濃度。若使用FCA處理的動(dòng)物應(yīng)仔細(xì)考慮測定物的濃度。1.5.1.3.步驟1.5.1.3.1. 前言第0天，實(shí)驗(yàn)組在動(dòng)物樣品的兩邊肩膀皮內(nèi)注射三種物質(zhì)，每種0.1毫升，肩膀應(yīng)脫凈毛，以使每種注射的物質(zhì)位于身體中線對稱的兩邊。注射物1:FCA與水或生理鹽水1:1（體積比）混合物注射物2：合適的狀態(tài)和濃度的測定物。注射物3:合適濃度的測定物與FCA/水或生理鹽

7、水的1:1（體積比）混合物。對于注射物3，水溶性物質(zhì)應(yīng)溶于水然后再與FCA混合。脂溶性或非水溶性物質(zhì)懸浮與FCA中與水相結(jié)合。測定物的最后濃度應(yīng)與注射物2中使用的相等。注射物1和2注射在離頭部最近處，彼此相鄰，而注射物3注射在測定部分的尾部。第0天，對比組皮內(nèi)注射三種物質(zhì)，每種0.1毫升，注射在與實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物相同的部位。注射物1:FCA與水或生理鹽水1:1（體積比）混合物。注射物2：未沖淡的媒介物注射物3:50%的媒介物與FCA/水或生理鹽水1:1的混合物。第57天，實(shí)驗(yàn)組和對比組如果測定物不是皮膚刺激性的，在局部誘導(dǎo)的約24小時(shí)前，剪去或剃去毛的測定部分應(yīng)用0.5毫升10%的用凡士林處理的硫酸

8、鈉，以使其產(chǎn)生局部發(fā)炎。第68天，實(shí)驗(yàn)組除去實(shí)驗(yàn)部分的毛。將覆蓋了最佳形態(tài)的測定物濾紙（厘米）2X4貼于動(dòng)物樣品的實(shí)驗(yàn)部分，綁上繃帶48小時(shí)。應(yīng)選擇合適的媒介物。固體應(yīng)先碾碎制成合適的形態(tài)?？赡艿脑挘灰♂屢后w。第68天，對比組除去實(shí)驗(yàn)部分的毛。用同樣的方法將賦形劑貼于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分，綁上繃帶48小時(shí)。1.5.1.3.2. 刺激第2022天，實(shí)驗(yàn)組和對比組除去實(shí)驗(yàn)組和對比組動(dòng)物側(cè)腹上的毛。將測定物涂于動(dòng)物樣品的一邊側(cè)腹，另一邊側(cè)腹涂媒介物。用繃帶固定24小時(shí)。觀察和評級：實(shí)驗(yàn)組和對比組- 在移去補(bǔ)丁約21小時(shí)后,如有必要需清潔挑戰(zhàn)部位并仔細(xì)剪或刮使脫毛。- 再過大概3小時(shí)后,也就是離開始測定其

9、應(yīng)用性48小時(shí)左右,可觀察到皮膚反應(yīng),并根據(jù)附錄中的程度等級做記錄。- 離這次觀察約24小時(shí)后,再進(jìn)行一次72小時(shí)觀察和記錄。對測定組和對照組動(dòng)物樣品的盲讀是被支持的.如果有必要闡明第一次測定的結(jié)果,那么在上次測定的約一星期后就要考慮又一次測定.下次測定也需用原來的對照組。所有來源于實(shí)驗(yàn)進(jìn)程的皮膚反應(yīng)以及任何異?，F(xiàn)象,包括全身反應(yīng)都要觀察并根據(jù)Magnusson/Kligman（見附錄）衡量等級記錄下來?？梢赃M(jìn)行其它過程如歷史病理檢查,皮膚折層厚度測量等,以此來闡明一些可疑反應(yīng)。1.5.2.Buehler測定1.5.2.1. 準(zhǔn)備工作在測定前讓健康年輕的成年白化天竺鼠在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中至少適應(yīng)5天

10、。并且這些動(dòng)物事先隨機(jī)分配到治療組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法的不同,選擇或剪或刮或用化學(xué)脫毛劑的手段來去除動(dòng)物毛發(fā),且要小心勿弄傷皮膚。測定的開始和結(jié)束分別稱下動(dòng)物體重。1.5.2.2. 測定情況1.5.2.2.1. 測定動(dòng)物通常使用實(shí)驗(yàn)室品種的白化天竺鼠。雄性的或雌性的動(dòng)物均可使用。如果使用雌性的動(dòng)物必須是從未生育過的或未懷孕的。實(shí)驗(yàn)組中最少要20只動(dòng)物,對照組中至少要10只。1.5.2.2.3. 劑量標(biāo)準(zhǔn)用于每個(gè)引導(dǎo)接觸的測定物質(zhì)的濃度時(shí)能產(chǎn)生溫和但不過度刺激的最高量。而用于免疫性試驗(yàn)接觸的濃度是不引起刺激的最高量。有必要的話可用2、3個(gè)動(dòng)物做個(gè)試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)來得到合適的濃度。對于水溶性的測定物質(zhì)，水或稀釋

11、的無刺激性的界面活性劑溶液可用作載體。對于其他測定物質(zhì)，乙醇/水用于誘導(dǎo)階段，丙酮用于免疫性試驗(yàn)階段。1.5.2.3.實(shí)驗(yàn)步驟1.5.2.3.1. 誘導(dǎo)階段0天-實(shí)驗(yàn)組清除一側(cè)毛發(fā)（仔細(xì)修剪）。實(shí)驗(yàn)補(bǔ)丁系統(tǒng)應(yīng)準(zhǔn)備好充足的已溶在合適載體中的測定物質(zhì)（必須證明載體選擇的正確性；如果合適的話，液態(tài)的測定物質(zhì)無需稀釋即可應(yīng)用）。實(shí)驗(yàn)補(bǔ)丁系統(tǒng)應(yīng)用于測定區(qū)域并且通過一個(gè)封閉的補(bǔ)丁或腔和一件合適的敷料與皮膚保持6小時(shí)聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)補(bǔ)丁系統(tǒng)必須是封閉的。一塊可方可圓的棉襯墊正合適，但大小需約4-6平方厘米。使用一個(gè)合適的束縛物來約束能確保封閉。如果使用包裝可能會造成額外的接觸。0天-對照組清除一側(cè)毛發(fā)仔細(xì)修剪載體

12、應(yīng)用類似于上述測定組實(shí)驗(yàn)補(bǔ)丁系統(tǒng)應(yīng)用于測定區(qū)域并且通過一個(gè)封閉的補(bǔ)丁或腔和一件合適的敷料與皮膚保持6小時(shí)聯(lián)系。如果能證明不需要一個(gè)陰性對照組，可使用陽性的對照組。6-8天和13-15天-實(shí)驗(yàn)組和對照組在第6-8天以及第13-15天在相同側(cè)邊的相同測定部位進(jìn)行和0天一樣的操作（如有需要清除毛發(fā)）。1.5.2.3.2. 免疫試驗(yàn)階段27-29天-實(shí)驗(yàn)組和對照組清除實(shí)驗(yàn)組和對照組動(dòng)物先前沒經(jīng)處理的一側(cè)毛發(fā)（仔細(xì)修剪）。把一個(gè)含有適量測定物質(zhì)的密封的補(bǔ)丁或腔應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)組和對照組動(dòng)物原來沒受處理的一側(cè)，藥物濃度是不引起刺激的最大量。一個(gè)含載體的封閉的補(bǔ)丁或腔也應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)組的對照組先前沒受處理的一側(cè)。通過

13、一件合適的敷料保持6小時(shí)接觸。1.5.2.3.3. 觀察和評級- 在移去補(bǔ)丁約21小時(shí)后，清理測定部位的毛發(fā)。- 約3小時(shí)后（在應(yīng)用實(shí)驗(yàn)補(bǔ)丁約30小時(shí)后），觀察皮膚反應(yīng)并根據(jù)附錄中的等級標(biāo)準(zhǔn)做記錄。- 在觀察30小時(shí)后約24小時(shí)（在應(yīng)用實(shí)驗(yàn)補(bǔ)丁約54小時(shí)后），再次觀察皮膚反應(yīng)并記錄。對測定組和對照組動(dòng)物樣品的盲讀是被支持的.如果有必要闡明第一次測定的結(jié)果,那么在上次測定約一星期后就要考慮再一次測定.下次測定也需用原來的對照組。所有來源于實(shí)驗(yàn)進(jìn)程的皮膚反應(yīng)以及任何異常現(xiàn)象,包括全身反應(yīng)都要觀察并根據(jù)Magnusson/Kligman（見附錄）衡量等級記錄下來?？梢赃M(jìn)行其它過程如歷史病理檢查,皮膚

14、折層厚度測量等,以此來闡明一些可疑反應(yīng)。2. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（GPMT和BUEHLER測定）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)需歸納成表格形式，要表示出每次觀察中每個(gè)動(dòng)物樣品的皮膚反應(yīng)。3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如果在天竺鼠測定前已進(jìn)行過一次測定分析，那么關(guān)于測定的描述或參考文獻(xiàn)（如局部淋巴結(jié)測定（LLNA），鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)（MEST），包括過程細(xì)節(jié)需連同從測定或參考物質(zhì)中獲得的結(jié)果一并給出。實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告（GMPT和BUEHLER測定）如果可能的話，實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告要包含以下信息：測定動(dòng)物：- 使用的天葵鼠的品種；- 動(dòng)物樣品的數(shù)目、年齡以及性別；- 來源、房間環(huán)境、食物等；- 測定開始時(shí)每個(gè)動(dòng)物樣品的體重。實(shí)驗(yàn)狀況：- 補(bǔ)丁固定技術(shù)；- 使用的補(bǔ)丁材料及縫補(bǔ)技術(shù)的細(xì)節(jié)；- 附帶關(guān)于將用于實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)階段和免疫試驗(yàn)階段的濃度結(jié)論的試點(diǎn)研究的結(jié)果；- 測定物質(zhì)的準(zhǔn)備、應(yīng)用及清理細(xì)節(jié)；- 對于載體選擇的證明；- 用于誘導(dǎo)接觸及免疫試驗(yàn)接觸階段的載體和測定物質(zhì)的濃度以及用于與誘導(dǎo)階段和免疫試驗(yàn)