基因表達沉默技術(shù)PPT課件

1、1藥學系藥物基因組學教研室藥學系藥物基因組學教研室2010.06.18 2010.06.18 基因表達沉默技術(shù)基因表達沉默技術(shù)2教學內(nèi)容及要求1234反義核酸技術(shù)反義核酸技術(shù)核酶技術(shù)核酶技術(shù)基因敲除技術(shù)基因敲除技術(shù)RNA干擾干擾 技術(shù)技術(shù) 重點重點 熟悉熟悉3參考資料 基因工程及其分子生物學基礎(chǔ)基因工程及其分子生物學基礎(chǔ)- -基因基因工程分冊工程分冊，北京大學出版社，靜國，北京大學出版社，靜國忠編忠編 自備材料（個人實踐經(jīng)驗）自備材料（個人實踐經(jīng)驗）4第一節(jié)第一節(jié) RNA干擾干擾技術(shù)技術(shù)5基本概念 掌握掌握 RNA RNA 干擾干擾 (RNA interference, RNAi):(RNA

2、interference, RNAi):由由小雙鏈小雙鏈RNARNA誘發(fā)的、同源誘發(fā)的、同源mRNAmRNA高效特異性降高效特異性降解的現(xiàn)象解的現(xiàn)象。小干擾小干擾RNA: RNA: 具有干擾功能的這種短雙鏈具有干擾功能的這種短雙鏈RNARNA就稱為小干擾就稱為小干擾RNARNA（Small interfering Small interfering RNA,siRNA)RNA,siRNA)。6注射注射sense秀麗線蟲秀麗線蟲antisense注射注射1995年年 發(fā)現(xiàn)歷史7反義反義RNA(antisense RNA)對基因抑制效應(yīng)比較微弱；對基因抑制效應(yīng)比較微弱；而雙鏈而雙鏈RNA（dsRN

3、A）能夠高效特異性阻斷靶基因的）能夠高效特異性阻斷靶基因的表達。表達。 1998年年8 Craig C. Mello克雷格梅洛Andrew Z. Fire安德魯安德魯菲爾菲爾2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine9隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)RNAiRNAi也存在于水稻、煙草、果也存在于水稻、煙草、果蠅、小鼠及人等幾乎所有的真核生物中。蠅、小鼠及人等幾乎所有的真核生物中。RNAi現(xiàn)象的普遍性10靶靶RNAi 機制siRNA在在ATP參與下形參與下形成成RISC復(fù)合體，被復(fù)合體，被RNA解旋酶解旋成單鏈，并解旋酶解旋成單鏈，并由其中的反義鏈指導(dǎo)移由其中的

4、反義鏈指導(dǎo)移至靶至靶mRNA，靶，靶mRNA被切割后誘發(fā)宿主細胞被切割后誘發(fā)宿主細胞針對這些針對這些mRNA的降解的降解反應(yīng)。反應(yīng)。外源長外源長dsRNA在在ATP作作用下被用下被RNase Dicer切切割成割成21nt左右、由正義左右、由正義和反義鏈組成的和反義鏈組成的siRNA重點重點11siRNA19 bp duplex2 nt 3 overhangs21 nt siRNA實驗設(shè)計難點難點121 1）靶序列的調(diào)出）靶序列的調(diào)出National Center forBiotechnology Information 1314152 2）

5、利用免費設(shè)計軟件進行）利用免費設(shè)計軟件進行siRNAsiRNA設(shè)計設(shè)計InvitrogenTakaraOligoegine 16軟件軟件的選擇的選擇原則原則1 1、選擇可讀框內(nèi)、翻譯起始位點之后、選擇可讀框內(nèi)、翻譯起始位點之后5050100nt100nt的序列作為靶序列；的序列作為靶序列；2 2、選擇的靶位、選擇的靶位5 5端之前的兩個堿基為端之前的兩個堿基為AAAA；3 3、GCGC含量控制在含量控制在35%35%65%,65%,最好最好50%50%左右；左右；4 4、堿基數(shù)目控制在、堿基數(shù)目控制在191921nt21nt；5 5、避免連續(xù)、避免連續(xù)3 3個或個或3 3個以上的相同堿基；個以

6、上的相同堿基；6 6、避免重復(fù)序列或回文結(jié)構(gòu)以免形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)；、避免重復(fù)序列或回文結(jié)構(gòu)以免形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)；7 7、靶序列同數(shù)據(jù)庫進行、靶序列同數(shù)據(jù)庫進行BLASTBLAST同源性比對。同源性比對。17我用的軟件：我用的軟件：siDirectsiDirect183 3）siRNAsiRNA合成或表達合成或表達RNARNA聚合酶聚合酶啟動子（包括啟動子（包括U6U6或或H1H1）：）：轉(zhuǎn)錄起始點明確；轉(zhuǎn)錄起始點明確；轉(zhuǎn)錄生成小轉(zhuǎn)錄生成小RNARNA；轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物無轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物無polyApolyA尾；尾；轉(zhuǎn)錄終止為轉(zhuǎn)錄終止為5 5個連續(xù)的個連續(xù)的U U。192021223 mg/ml 正向引物 1 l3

7、 mg/ml 反向引物 1 l90C 4 min70C 10 min室溫 訂購合成的引物序列退火訂購合成的引物序列退火 234) siRNA working?24mRNA:Real-time PCRmRNA:Real-time PCR Protein: Western blot Protein: Western blot17siRNA Mock 17siRNA Mock 255)5)合成合成oror構(gòu)建載體？構(gòu)建載體？A.A.化學合成化學合成siRNAsiRNA： 瞬時轉(zhuǎn)染瞬時轉(zhuǎn)染 實驗花費高實驗花費高 使用的時候，要用二乙基焦碳酸酯（使用的時候，要用二乙基焦碳酸酯（DEPCDEPC）處理過的

8、滅）處理過的滅菌蒸餾水溶解，這是因為菌蒸餾水溶解，這是因為siRNAsiRNA易被易被RNARNA酶降解。酶降解。B.B.載體：為了長期觀察基因沉默后的影響，需要長期表達載體：為了長期觀察基因沉默后的影響，需要長期表達siRNAsiRNA。C. C. 載體選擇：易轉(zhuǎn)染的細胞用質(zhì)粒載體，難轉(zhuǎn)染的細胞載體選擇：易轉(zhuǎn)染的細胞用質(zhì)粒載體，難轉(zhuǎn)染的細胞用逆轉(zhuǎn)錄載體或慢病毒載體。用逆轉(zhuǎn)錄載體或慢病毒載體。266 6）體外導(dǎo)入細胞）體外導(dǎo)入細胞a.a.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：具體操作步驟：具體操作步驟：按照脂質(zhì)體說明書進行按照脂質(zhì)體說明書進行27b.b.電穿孔導(dǎo)入：電穿孔導(dǎo)入：28c.c.病毒感染（以腺病毒

9、為例）：病毒感染（以腺病毒為例）：2930第二節(jié)第二節(jié) 反義核酸技術(shù)反義核酸技術(shù)3119781978年，年，Stephenson Stephenson 和和ZamecnikZamecnik首次報道了首次報道了反義寡脫氧核苷酸可抑制勞斯肉瘤病毒反義寡脫氧核苷酸可抑制勞斯肉瘤病毒RSVRSV的的復(fù)制現(xiàn)象。復(fù)制現(xiàn)象。1984 1984 年，年，Izant weintraubIzant weintraub提出了提出了“反義核反義核酸技術(shù)酸技術(shù)”的概念。的概念。Inhibition of Rous sarcoma viralRNA translation by a specific oligodeoxy

10、ribonucleotide. Proc Natl Acad Sci USA , 1978 ;75 : 285 - 288.歷史由來32 反義寡核苷酸概念：正義鏈互補的一段核苷酸序反義寡核苷酸概念：正義鏈互補的一段核苷酸序列，包括反義列，包括反義DNADNA和反義和反義RNARNA?；靖拍罘戳x反義RNA技術(shù)技術(shù)反義反義DNA技術(shù)技術(shù)33反義抑制的主要機理直接作用于靶直接作用于靶mRNA的的SD序列或部分編碼區(qū)，直序列或部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶接抑制翻譯，或與靶mRNA結(jié)合形成雙鏈結(jié)合形成雙鏈RNA，從而易被從而易被RNA酶酶H降解。降解。反義反義核酸核酸mRNARNase H34論著

11、超過篇。論著超過篇?；蚬δ苎芯浚ɑ蚬δ苎芯浚?19941994年流行）年流行） 如抗病毒或抗腫瘤基因治療研究等領(lǐng)域。如抗病毒或抗腫瘤基因治療研究等領(lǐng)域。反義核酸應(yīng)用反義核酸應(yīng)用3519981998年年8 8月月2727日，美國食品藥品管理局（日，美國食品藥品管理局（FDAFDA）正）正式批準了由式批準了由ISISISIS公司開發(fā)的全球第一個反義藥物公司開發(fā)的全球第一個反義藥物“VitraveneVitravene” （福米韋生，（福米韋生，fomivirsenfomivirsen）在美國）在美國上市。上市。該藥抗病毒作用較強，是更昔洛韋的該藥抗病毒作用較強，是更昔洛韋的10001000倍，

12、用倍，用于治療巨細胞病毒性視網(wǎng)膜炎和艾滋病人并發(fā)巨于治療巨細胞病毒性視網(wǎng)膜炎和艾滋病人并發(fā)巨細胞視網(wǎng)膜炎細胞視網(wǎng)膜炎, ,有效率高達有效率高達80%-90%80%-90%。VitraveneVitravene為注射劑，患者每月只需注射一次藥物為注射劑，患者每月只需注射一次藥物（利用專用針頭直接注射進眼球內(nèi)），不良反應(yīng)（利用專用針頭直接注射進眼球內(nèi)），不良反應(yīng)有虹膜炎、玻璃體炎，發(fā)生率為有虹膜炎、玻璃體炎，發(fā)生率為2525，用糖皮質(zhì)，用糖皮質(zhì)激素治療可緩解或消除其炎性反應(yīng)。激素治療可緩解或消除其炎性反應(yīng)。2 2個硫代磷酸酯寡聚脫氧核苷酸組成個硫代磷酸酯寡聚脫氧核苷酸組成 36a.避免內(nèi)源性核酸酶

13、對其降解b.提高自身穩(wěn)定性以及與靶分子的親和力Hdeoxyribose提高有效性提高有效性技術(shù)難點技術(shù)難點37第一代硫代修飾（第一代硫代修飾（Phosphorothioate）Resisting To Nucleases；Activating RNase H pathwaysO38第二代修飾第二代修飾(2-O-methyl,2-O-methoxyethyl)Resisting To Nucleases；not activating RNase H pathways392001 2001 主要用于治療老年人中十分常見的視網(wǎng)膜黃斑退化癥主要用于治療老年人中十分常見的視網(wǎng)膜黃斑退化癥 Macugen

14、 哌加他尼40 2003 2003 新一代抗新一代抗HIVHIV新藥，屬于病毒的融合阻止劑類藥物新藥，屬于病毒的融合阻止劑類藥物 Fuzeon 41Tysabri 2004 2004 專治多發(fā)性硬化癥專治多發(fā)性硬化癥 4243第三節(jié)第三節(jié) 核酶技術(shù)核酶技術(shù)44核酶（核酶（ribozymeribozyme） ribonucleic acid enzyme ribonucleic acid enzyme 具有催化活性的具有催化活性的RNARNA，化學本質(zhì)是，化學本質(zhì)是RNA,RNA,卻卻具有酶的催化功能。具有酶的催化功能?；靖拍罨靖拍?5切赫切赫(T.R.Cech)(T.R.Cech)（194

15、7-1947-），美國人），美國人, , 他獨立地發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)四膜蟲轉(zhuǎn)錄他獨立地發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)四膜蟲轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)物rRNArRNA前體，可切除自身的前體，可切除自身的413413個核苷酸的內(nèi)含子，使兩個個核苷酸的內(nèi)含子，使兩個外顯子拼接起來，變成成熟的外顯子拼接起來，變成成熟的rRNArRNA分子。分子。歷史由來歷史由來Thomas R.Cech1982 46S.Altman研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌RNaseP的蛋白質(zhì)部分除去后，留下RNA能夠切割rRNA前體的5端。1983 471989 Nobel Prize in Chemistry核酶的發(fā)現(xiàn)改變了核酶的發(fā)現(xiàn)改變了“所有酶都是蛋白質(zhì)所有酶都是蛋白質(zhì)”的傳

16、統(tǒng)觀念的傳統(tǒng)觀念48有封閉有封閉切割切割RNARNA應(yīng)用應(yīng)用阻斷基因的表達（1994年左右比較流行的研究工具）49通常由60個核苷酸左右組成；底物部分：含有GU序列；保守序列：13個堿基。錘頭狀核酶結(jié)構(gòu)示意圖5051第四節(jié)第四節(jié) 基因敲除技術(shù)基因敲除技術(shù)時間：時間：8080年代末年代末功能：建立基因失活或缺失的動物模型功能：建立基因失活或缺失的動物模型52發(fā)展歷史發(fā)展歷史a. 胚胎干細胞（胚胎干細胞（ embryonic stem cell，ES）分離培養(yǎng)）分離培養(yǎng)取自小鼠受精卵發(fā)育第取自小鼠受精卵發(fā)育第4，5天的胚胎細胞天的胚胎細胞 能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能

17、性 1981年，馬丁年，馬丁埃文斯埃文斯(Martin JEvans) 從正常的小鼠囊胚中從正常的小鼠囊胚中分離到了分離到了ES細胞。小鼠細胞。小鼠ES細胞的細胞的分離和應(yīng)用是分離和應(yīng)用是ES細胞技術(shù)發(fā)展的細胞技術(shù)發(fā)展的里程碑。里程碑。53同源重組：是指發(fā)生在減數(shù)分裂或者有絲分裂過程中同源重組：是指發(fā)生在減數(shù)分裂或者有絲分裂過程中相同或者相似相同或者相似DNADNA序列間的重組，通常通過一對同源分序列間的重組，通常通過一對同源分子非姊妹染色體間的斷裂而產(chǎn)生新的重組片段。子非姊妹染色體間的斷裂而產(chǎn)生新的重組片段。b. 同源重組技術(shù)應(yīng)用同源重組技術(shù)應(yīng)用541985年，奧利弗年，奧利弗史密塞斯史密塞

18、斯(Oliver Smithies) 等首次報道在腫瘤細胞等首次報道在腫瘤細胞中實現(xiàn)了人工打靶載體和內(nèi)源中實現(xiàn)了人工打靶載體和內(nèi)源-球蛋白基因間的同源重組。球蛋白基因間的同源重組。551988年，卡佩基安德等發(fā)展了一年，卡佩基安德等發(fā)展了一種稱為種稱為“正負篩選正負篩選”的策略，將的策略，將胸腺嘧啶激酶基因（胸腺嘧啶激酶基因（tk）置于打）置于打靶載體的外側(cè)，作為篩選的負性靶載體的外側(cè)，作為篩選的負性標記。這比單用陽性篩選正確克標記。這比單用陽性篩選正確克隆富集的倍數(shù)高隆富集的倍數(shù)高310倍，真正使倍，真正使得同源重組技術(shù)得以應(yīng)用。得同源重組技術(shù)得以應(yīng)用。馬里奧馬里奧卡佩基安德卡佩基安德(Mario R(Mario RCapechiand)Capechiand)丙氧鳥苷丙氧鳥苷56Martin Evans馬丁馬丁埃文斯埃文斯Mario Capecchi馬里奧馬里奧卡佩基卡佩基Oliver Smithies奧利弗奧利弗史密斯史密斯57原理和操作流程原理和操作流程5859小結(jié)小結(jié) 1 1、RNAiRNAi技術(shù)：技術(shù)： 基本概念；基本概念； RNAi RNAi技術(shù)發(fā)